生物 畢業(yè)論文：甘草中甘草酸提取工藝的優(yōu)化

1、生物 畢業(yè)論文：甘草中甘草酸提取工藝的優(yōu)化 大學(xué)本科畢業(yè)論文甘草中甘草酸提取工藝的優(yōu)化姓 名院 系專 業(yè)班 級學(xué) 號指導(dǎo)教師辯論日期成 績甘草中甘草酸提取工藝的優(yōu)化內(nèi)容摘要 甘草酸為甘草有效成分的重要組成局部。本論文以氨性醇作為提取溶劑,采用響應(yīng)面試驗(yàn)方案,找出了其最正確提取條件:1.單因素處理時溶劑采用0.3%稀氨水加20%乙醇,處理時間為2.5h,處理溫度為90,處理時間為2.665h時,所得的吸光度(abs)最正確abs0.598401,對應(yīng)的濃度是0.0467mg/ml,甘草酸的提取率為11.68%?！娟P(guān)鍵詞】甘草酸 氨性醇 響應(yīng)面法 紫外可見分光光度計Optimization of

2、Extraction of glycyrrhizic acid in licoriceAbstract Glycyrrhizic acid as part of an important component of the active ingredients of licorice. In this thesis, the ammoniacal alcohol as the extracting solvent, by response surface testing program, the optimum extraction conditions were identified: 1.A

3、 single factor treatment solvent with dilute ammonia solution of 0.3% plus 20% ethanol, the processing time of 2.5h, the processing temperature of 90 .2. The best results of the integrated treatment of ammonia alcohol solution of dilute ammonia concentration of 0.338%, Water bath processing temperat

4、ure was 93.4 °h The resulting absorbance abs abs 0.598401, corresponding to the concentration of 0.0467mg/ml ,Glycyrrhizic acid extraction rate of 11.68%【key words】:Glycyrrhizic acid Ammoniacal alcohol Response Surface Methodology UV-Vis spectrophotometer目錄一、引言1(一)甘草及甘草酸簡介1(二)甘草酸提取工藝目前的狀況1(三)設(shè)計

5、實(shí)驗(yàn)方案的依據(jù)2(四)設(shè)計實(shí)驗(yàn)方案2二、實(shí)驗(yàn)材料與方法2 (一)實(shí)驗(yàn)儀器及試劑2(二)材料處理與試劑配制2(三)實(shí)驗(yàn)方法與步驟2三、結(jié)果與分析3(一)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線3(二)單因素處理結(jié)果與分析3(三)響應(yīng)面處理結(jié)果與分析3四、討論10參考文獻(xiàn)11致謝12甘草中甘草酸提取工藝的優(yōu)化姓名:郭鑫鑫指導(dǎo)老師:王文科一、引言 (一)甘草及甘草酸簡介 甘草Licorice系豆科Legtrn inosae 甘草屬G1ycyrrhiza 植物甘草Glycyrrhiza ulalensis Fisch 、脹果甘草Glycyrrhiza inflata Bat,或光果甘草Glycyrrhiza glabral 的枯

6、燥根及根莖加工而成1。因?yàn)槠淝鍩峤舛?補(bǔ)脾益氣,潤肺止咳,調(diào)和諸藥性被美譽(yù)為“十方九草。甘草除應(yīng)用于醫(yī)藥外,還廣泛地應(yīng)用于煙草、食品、釀造以及化裝品工業(yè)等領(lǐng)域2。 甘草酸glycyrrhizic acid或甘草甜素glycyrrhizin及甘草次酸glycyrrhetinic acid等三萜類化合物是甘草有效成分的重要組成局部3,其含量的上下常作為評價甘草質(zhì)量的重要指標(biāo)4。具有抗HIV病毒5、抗SARS病毒6、抗腫瘤7、抗?jié)?、治療肝炎、降血?等多種重要的藥理活性。甘草酸在甘草中以鈉鹽或鉀鹽的形式存在,水解生成甘草次酸和2分子的葡萄糖醛酸。其分子式為C42H62O16,相對分子量822.92

7、,其結(jié)構(gòu)式如圖: (二)甘草酸提取工藝目前的狀況 傳統(tǒng)提取方法是讓溶劑進(jìn)入藥材,將有效成分從固相擴(kuò)散轉(zhuǎn)移到液相的過程。影響浸出的因素主要有溶劑、溫度、壓力、固體藥材粒度與液體的流動狀態(tài)等。目前水和乙醇是最常用的溶劑。傳統(tǒng)的溶劑提取方法有:浸漬法、滲漉法、煎煮法、回流提取法、連續(xù)提取法。隨著世界中藥產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)代化,國內(nèi)外涌現(xiàn)出許多先進(jìn)的提取技術(shù)如超臨界流體提取法、微波輔助提取法等,以及高效靈敏的測定方法如高效液相色譜、毛細(xì)管電泳9等。超聲波輔助提取可以有效地破壞細(xì)胞壁,大大減少了提取時間,提高提取效率10。此外提取方法還有半仿生提取法(SBE法)、閃式提取法、負(fù)壓空化提取法、超高壓法等。 西方國家

8、大量進(jìn)口甘草,從中提取甘草次酸,作為臨床最常應(yīng)用的藥品。甘草酸及甘草次酸的提取和含量的測定在甘草研究中具有舉足輕重的地位。我國是甘草生產(chǎn)和出口的大國,但對甘草主要有效成分甘草酸的生物合成、作用機(jī)制、精制加工和綜合利用的深入研究還遠(yuǎn)落后于興旺國家11。 (三)設(shè)計實(shí)驗(yàn)方案的依據(jù) 由甘草酸自身的理化性質(zhì)及其在甘草中的存在形式,再依據(jù)廈門大學(xué)王巧娥等人在研究微波萃取甘草酸時發(fā)現(xiàn),采用氨性醇作為提取劑提取效率最高12。綜合考慮設(shè)備和經(jīng)費(fèi)的問題,實(shí)驗(yàn)主要采用傳統(tǒng)的溶劑提取方法。我在試驗(yàn)中采用氨性醇溶液作為提取溶劑,利用恒溫水浴鍋進(jìn)行嚴(yán)格的溫度調(diào)控,通過研究不同的溶劑濃度、反響溫度、反響時間對提取效果的影

9、響,從而得到最正確的工藝提取條件。 (四)設(shè)計實(shí)驗(yàn)方案 設(shè)計響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),探討提取甘草酸的最正確條件,分兩個步驟 步驟一、確定影響提取甘草酸的因素,分別是溶劑的濃度(20%乙醇+0.1%氨水,20%乙醇+0.3%氨水,20%乙醇+0.5%氨水),溫度(70,80,90,100),時間(1.5h/次,2h/次,2.5h/次,3h/次)設(shè)計單因素試驗(yàn),確定各因素的水平。 步驟二、設(shè)計響應(yīng)面法,優(yōu)化各因素水平,確定哪個是甘草酸提取最正確條件。二、實(shí)驗(yàn)材料與方法 (一)實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市儀器制造公司 電子天平 上海精密科學(xué)儀器 架盤藥物天平北京醫(yī)用天平廠 離心機(jī)山西師范大學(xué)生化

10、實(shí)驗(yàn)室 美的電磁爐 山西師范大學(xué)生化實(shí)驗(yàn)室 石英比色皿 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司 微量移液槍 上海精密科學(xué)儀器 新世紀(jì)紫外可見分光光度計山西師范大學(xué)生化實(shí)驗(yàn)室 甘草 臨汾市安遠(yuǎn)大藥房 無水乙醇 分析純天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技 氨水 分析純天津市申泰化學(xué)試劑 濃硫酸分析純孟津縣平樂鎮(zhèn)尤村 蒸餾水山西師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)室 (二)材料處理與試劑配置 將甘草粉碎為甘草粗粉,烘干至恒重,置于密閉玻璃容器,待用。 1配置濃度分別為0.1%,0.3%,0.5%的氨水假設(shè)干; 2配置濃度分別為70%和20%乙醇假設(shè)干; 3將配置好的氨水與20%乙醇按照體積比為1:1配置好三種氨性醇溶液。 (三)試驗(yàn)方法與步驟 1

11、提取準(zhǔn)確稱取三份質(zhì)量為10g的甘草粗粉,分別置于裝有100ml的三種氨性醇溶液的燒杯中,浸泡12h后,90恒溫水浴鍋浸泡2.5h;多層紗布過濾,取濾液,離心,取上清液,將沉淀并濾渣再次浸提一次,重復(fù)離心操作。 2濃縮加酸 合并兩次上清液,在電磁爐上進(jìn)行加熱濃縮至50ml左右,滴加50%濃硫酸至溶液PH為2-3,離心,取沉淀。 3稀釋 將沉淀溶于100ml70%乙醇中,充分溶解后,用移液槍移取200ul溶液,用70%乙醇溶液定容至50ml。 4測量 取各組稀釋液,分別移入石英比色皿中,以70%乙醇溶液對照,在254nm的波長下,用紫外可見分光光度計測其吸光度。 在提取時準(zhǔn)確稱取四份質(zhì)量為10g的

12、甘草粗粉,分別置于裝有100ml氨水濃度為0.3%的氨性醇溶液的燒杯中,浸泡12h后,分別在70,80,90,100恒溫水浴鍋浸泡2.5h,其余處理同1。 在提取時準(zhǔn)確稱取四份質(zhì)量為10g的甘草粗粉,分別置于裝有100ml氨水濃度為0.3%的氨性醇溶液的燒杯中,浸泡12h后,90恒溫浸泡1.5h,2h,2.5h,3h,其余處理同1。三、結(jié)果與分析(一)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線13 用70%的乙醇配置濃度為1.0mg/ml的甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品,分別移取0.5ml、0.75ml、1.00ml、1.25ml、1.50ml與25.0ml容量瓶,用70%的乙醇定容,在最大吸收波長254nm處測量其吸光度,如下列圖所示,得

13、到的回歸方程為y13.17x-0.017,相關(guān)系數(shù)為0.9996(其中y代表吸光度abs,x代表甘草酸質(zhì)量濃度mg/ml) 圖1 甘草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 (二)單因素處理結(jié)果與分析 1.氨性醇溶液濃度對提取效果的影響 固定其它條件即在90,水浴加熱兩次,每次加熱2.5h,考察不同氨性醇溶液濃度對提取效果的影響,其結(jié)果如表1所示。 表1 不同濃度氨性醇溶液對提取效果的影響 溶劑濃度 (氨水:乙醇吸光度 濃度mg/ml得率(%)圖2 氨性醇濃度對氧化效果的影響 由表1、圖2可知,提取效果先隨稀氨水濃度增大而增強(qiáng),后隨過稀氨水濃度增大的改變漸趨降低,在濃度為0.3%時效果最好。故確定氨性醇溶液稀氨水提取的最

14、適濃度為0.3%。 固定其它條件即在氨水濃度為0.3%的氨性醇溶液,水浴加熱兩次,每次加熱2.5h,考察不同溫度對提取效果的影響,其結(jié)果如表2所示。表2 不同溫度對提取效果的影響溫度()吸光度濃度mg/ml得率(%)圖3 不同溫度對提取效果的影響 由表2、圖3可知,提取效果先隨溫度的增加而增強(qiáng),后隨溫度的增加而減弱,所以我選擇90為最好。故確定提取的最適溫度為90。3. 不同時間對提取效果的影響 固定其它條件即在氨水濃度為0.3%的氨性醇溶液,90水浴加熱兩次,每次的時間分別為1.5h,2h,2.5h,3h,考察不同時間對提取效果的影響,其結(jié)果如表3所示。 表3 不同處理時間對提取效果的影響時

15、間(h)吸光度濃度mg/ml得率(%)圖4 不同處理時間對提取效果的影響 由表3、圖4可知,提取效果先隨時間的升高而增強(qiáng),后隨溫度的升高而降低,在時間為2.5h時,提取效果最好。故將2.5h作為移取的最適時間。三響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析 1.將實(shí)驗(yàn)中各因素與響應(yīng)面軟件中各實(shí)驗(yàn)因子對出對照,如下表: 表4 過硫酸銨的單因素影響因子和響應(yīng)面軟件中的實(shí)驗(yàn)因子對照表A溶劑濃度(氨水:乙醇)B溫度()C時間(h)-10.1%:20%80210.5%:20%1003 2.將各實(shí)驗(yàn)組參與反響條件與實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入響應(yīng)面軟件,如下表: 表5 響應(yīng)面設(shè)計軟件綜合試驗(yàn)及結(jié)果實(shí)驗(yàn)號 因素1 A:氨性醇濃度 (%) 因素2

16、B:溫度 () 因素3 C:時間 h 吸光度(abs)12345678910111213141516 表6 多因子之間的交互作用結(jié)果分析(平方和和方差分析)工程總述Sum ofSource平方和Sum ofSquares自由度df均方MeanSquareF值FValueP值概率 Fp-valueProb F評價模型(Model)0.14 9 0.016 20.46 0.0003significantA-A0.01910.01924.630.0016B-BCC7.004E-00317.004E-0039.240.0188C-C6.667E-00316.667E-0038.800.0209AB1.

17、440E-0041 1.440E-0040.190.6760AC9.610E-00419.610E-0041.270.2972BC4.464E-00314.464E-0035.890.0456A20.03310.03343.880.0003B20.02310.02330.820.0009C20.02410.02431.130.0008剩余值和(Residual)5.304E-00377.578E-004368.540E-0044.730.3381not significant純誤差(Pure Error)1.805E-00411.805E-004總和Cor Total0.1416溫度和時間交互

18、關(guān)系 圖5 溫度和時間交互關(guān)系平面圖濃度和時間交互關(guān)系圖6 濃度和時間交互關(guān)系平面圖濃度和溫度交互關(guān)系圖7 濃度和溫度交互關(guān)系平面圖溫度和時間交互關(guān)系圖8 溫度和時間交互關(guān)系立體圖濃度和時間交互關(guān)系圖9 濃度和時間關(guān)系交互關(guān)系立體圖濃度和溫度交互關(guān)系圖10 濃度和溫度交互關(guān)系立體圖 6.依據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)處理方式14做最后的分析方程歸納:得到Design-Expert 分析方程為:Abs+0.58286+0.043200* A+0.034167 *B+0.033333C-0.015500*A*C+0.10015*B* C-0.095227* A2-0.099545 * B2-0.10005* C2

19、我們可以根據(jù)這個線性多項(xiàng)式計算各個因素和最后結(jié)果(吸光值)之間的計算關(guān)系,更加直觀的做出分析判斷。 表7 最正確實(shí)驗(yàn)選擇序號(Number)A濃度(%)B溫度()C時間(h)吸光度(Abs)最高期望值Desirability選擇 1 0.190.34 0.330.598401 0.002 Selected有一個符合規(guī)定的選項(xiàng):;處理時間為2.665h時所得的吸光度(abs)最正確abs0.598401,對應(yīng)的濃度為0.0467mg/ml甘草酸提取率為11.68%。 四、討論 采用氨性醇溶液作為提取試劑,有兩方面優(yōu)點(diǎn):1.稀氨水可以與甘草酸形成銨鹽,由此大大增加其在溶液中的溶解度。2.甘草中含有

20、淀粉、蛋白質(zhì)等物質(zhì),而這些物質(zhì)在乙醇中會形成沉淀,故采用乙醇做提取試劑,可有效減少提取物中雜質(zhì)的含量。目前,用氨性醇溶液對甘草酸進(jìn)行提取的方法已逐漸被采用。 在研究了單因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響后,本文又采用響應(yīng)面優(yōu)化法,研究了甘草酸的最正確提取工藝,并通過相關(guān)軟件得到分析方程。在回歸方程中,A、B、C變量的正系數(shù)說明,該變量的正向變化能引起響應(yīng)值的降低;負(fù)的二次項(xiàng)系數(shù)說明,方程的拋物面開口向上,具有極小值點(diǎn),能夠進(jìn)行最優(yōu)分析。觀察方程的一次項(xiàng)系數(shù)可以發(fā)現(xiàn):對甘草酸提取效果的影響因素從大到小順序?yàn)?溶液濃度溫度時間,結(jié)合表6還可得出,溶液濃度到達(dá)極顯著水平。 文章還由Design-Expert軟件利

21、用三維圖綜合反映了各變量與兩個響應(yīng)之間、響應(yīng)與響應(yīng)之間、變量與變量之間的關(guān)系。比擬3組圖并結(jié)合表中P值可知:模型的一次項(xiàng)A、B、C,二次項(xiàng)A2、B2、C2,交互項(xiàng)BC都存在顯著差異,說明這幾個模型的擬合度很好。交互項(xiàng)AB、AC不顯著,說明A因素與B因素、A因素與C因素間的交互作用較小。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱,橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形那么與之相反。;處理時間為2.665h時所得的吸光度(abs)最正確abs0.598401,對應(yīng)的濃度為0.0467mg/ml甘草酸得率為11.68%,可以說取得較為理想的結(jié)果。 參考文獻(xiàn)1國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部S.北京:化學(xué)

22、工業(yè)出版社,2005,59-60.2王照蘭,校建材,于林消.甘草的利用價值、研究現(xiàn)狀及存在的問題J.中國草地,2002,241:73.3張繼,姚健,丁蘭,等.甘草的利用研究進(jìn)展J.草原和草坪,2000,892:12.4黃明進(jìn),王文金,魏勝利.我國甘草藥用植物資源調(diào)查及質(zhì)量評價的研究J.中國中藥雜志,2021,358:947-952.5 HATANO T,YASUBARA T,MIYAMOTO K,et al.Anti-human immumode-ficiency virus phenolics from licoriceJ.Chem Pharm Bull,1988,366:2286-2288

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