現(xiàn)代生物技術(shù)與新藥研究 第十講 免疫調(diào)節(jié)劑與核酸藥物的篩選研究策略

1、第十講 免疫調(diào)節(jié)劑與核酸藥物的篩選研究策略胡海峰主要內(nèi)容n免疫調(diào)節(jié)劑定義 免疫抑制劑免疫增強劑n核酸藥物定義作用機理品種實例介紹人體免疫及其功能n免疫，又稱是免疫性或免疫力，是指機體在識別自我的基礎上，辨別、消滅和排除抗原性異物以維護機體的穩(wěn)定性和生理平衡的過程。n對人體主要有以下三大功能1、 防疫功能：免疫能幫助機體消滅與消除入侵之“敵”病原微生物及其抗原。2、 穩(wěn)定功能：免疫能幫助機體消除新陳代謝中損傷與衰老死亡的細胞，維持機體內(nèi)部的“治安”。3、 監(jiān)控功能：免疫能幫助機體抑制和消滅癌細胞持續(xù)性感染。如有的人患病癥沒用藥而自然痊愈，即是免疫的作用。免疫調(diào)節(jié)（Immunoregulation

2、）n免疫調(diào)節(jié)免疫調(diào)節(jié)主要是指在免疫應答過程中，各種免疫細胞與免疫分子相互促進和抑制，形成正負作用的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，并在基因的控制下，完成免疫系統(tǒng)對抗原的識別和應答。免疫調(diào)節(jié)（Immunoregulation）n免疫分子的調(diào)節(jié)作用1 抗體封閉抗原作用（結(jié)合抗原表位，阻止識別，抑制體液免疫應答）2 免疫復合物的調(diào)節(jié)作用 （免疫復合物既可促進免疫應答，又可抑制免疫應答）3 免疫細胞表面調(diào)節(jié)性受體的作用 【激活受體（正調(diào)節(jié)），抑制性受體（負調(diào)節(jié)）】n免疫細胞的調(diào)節(jié)作用1 T細胞調(diào)節(jié)2 B細胞調(diào)節(jié)3 NK細胞與巨噬細胞調(diào)節(jié)n整體水平的調(diào)節(jié)作用1 神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié) 2 免疫系統(tǒng)對神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌

3、系統(tǒng)的影響T細胞的調(diào)節(jié) T T細胞在免疫調(diào)節(jié)中決定免疫應答的類型，協(xié)調(diào)細細胞在免疫調(diào)節(jié)中決定免疫應答的類型，協(xié)調(diào)細胞免疫和體液免疫之間的關系胞免疫和體液免疫之間的關系。 ThTh細胞的調(diào)節(jié)細胞的調(diào)節(jié) 分類：分類：Th0Th0細胞、細胞、Th1Th1細胞和細胞和Th2Th2細胞細胞 Th0Th0細胞為細胞為Th1Th1細胞和細胞和Th2Th2細胞的前體細胞；細胞的前體細胞； Th1Th1細胞輔助細胞免疫應答；細胞輔助細胞免疫應答； Th2Th2細胞輔助體液免疫應答。細胞輔助體液免疫應答。免疫調(diào)節(jié)劑n對人體免疫系統(tǒng)具有抑制或增強作用的物質(zhì)稱為免疫調(diào)節(jié)劑n免疫抑制劑: 抑制免疫反應（FK506）n免

4、疫增強劑：增強人體的免疫功能（多糖）免疫抑制劑的研究作用機理篩選策略重要品種免疫抑制劑n免疫抑制劑是指能夠抑制免疫反應的藥物，它能抑制淋巴細胞增殖、分化和影響淋巴細胞的功能。n選擇性免疫抑制劑是指對淋巴細胞有專一性作用，對紅細胞生成幾乎沒有影響，無毒性或毒性極微，不損害宿主對細菌和真菌的感染防御機制。n免疫抑制劑應用于器官移植中的抗排斥作用和治療自身免疫性疾病如風濕性關節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、霉菌病、炎性腸病、自身免疫溶血性貧血等。免疫抑制劑作用機理n第1代：以皮質(zhì)激素、硫唑嘌呤、抗淋巴細胞球蛋白(ALG)為代表，主要作用為溶解免疫活性細胞，阻斷細胞的分化，其特點為非特異性、廣泛的免疫抑制。n第

5、2代：以環(huán)孢素A(CsA)和FK506為代表，主要阻斷免疫活性細胞的白細胞介素2(IL-2)的效應環(huán)節(jié)，因其以淋巴細胞為主而具有相對特異性。n第3代：以單克隆抗體、雷帕霉素、霉酚酸脂為代表，其作用于抗原呈遞和分子間的相互作用，與第2代制劑有協(xié)同作用。n第4代：以抗IL-2受體單克隆抗體、FTY20等為代表，主要針對改變cytokine環(huán)境，如抑制TH1，增強TH2。作用機理1環(huán)孢素和FK-506通過與胞漿內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)親免素受體結(jié)合而發(fā)揮作用的。親免素受體有3個亞型，分別為Cyclophilin, FKBP-12,Pin1, 它們都具有旋折酶（PPIase，羥脯氨酸順反異構(gòu)酶）的活性。其中FK

6、-506與FKBP12結(jié)合，形成藥物受體復合物，抑制T細胞內(nèi)鈣調(diào)素依賴的磷酸酶（Calcineurin）活性，導致T細胞IL-2基因轉(zhuǎn)錄受抑制，IL-2分泌減少，造成免疫抑制。作用機理2n霉酚酸酯（MPA）高選擇性、非競爭性、可逆性的次黃嘌呤核苷磷酸脫氫酶（IMPDH）抑制劑，可抑制鳥嘌呤核苷酸的經(jīng)典合成途徑。 人體內(nèi)淋巴細胞與其他細胞不同，不能利用嘌呤補救途徑合成嘌呤，因此 MPA可以高度選擇性的抑制淋巴細胞活化，抑制機體的細胞免疫和體液免疫功能。同時在淋巴細胞激活過程中，MPA通過減少GTP和GDP巖藻糖、GDP-甘露糖含量抑制淋巴細胞表面粘附分子的糖基化，從而抑制激活的淋巴細胞與上皮細胞

7、或靶細胞粘附而殺傷靶細胞。TCR:T cell receptor作用機理免疫抑制劑篩選n傳統(tǒng)的篩選方法MLR混合淋巴細胞反應T細胞抑制活性NK細胞抑制活性n新的篩選方法抑制Calcireurin活性方法（Dibefurin）P56酪氨酸蛋白激酶活性方法（Lymphostin）抑制活化T細胞的核因子的NFAT-68和NFAT-133免疫抑制劑篩選n含RBP基因的酵母篩選模型用含有RBP(雷帕霉素結(jié)合蛋白，Rapamycin Binding Protein, RBP)基因的啤酒酵母菌RS188N及其變株RS188N rbp：LEU(RBP基因片段由于被亮氨酸基因嵌入從而阻斷該基因編碼RBP的產(chǎn)生)

8、的篩選模型，凡對RS188N抑菌圈比對RS188N rbP ：LEU的抑菌圈大6mm以上，被認為產(chǎn)生Rapamycin及其結(jié)構(gòu)類似物。抑制Calcireurin活性方法nAbbott公司建立了Calcineurin活性分析體系:將小牛Calcineurin和Calmodlin在反應緩沖液中混合,以4-甲基傘形基磷酸為底物。加入含底物的緩沖液以起始反應,快速振搖混勻反應體系,37培養(yǎng)1小時,加入堿性緩沖液以終止反應。在355nm激發(fā)光下測460nm熒光強度。利用這一篩選體系發(fā)現(xiàn)了真菌產(chǎn)物Dibefurin,其抑制Calcineurin活性的IC50為g/ml;抑制MLR的IC50為2.5g/ml

9、(BrillG M,1996年)。重要品種In 1970 ， cyclosporins were isolated in the Sandoz Laboratories in Basel from Cylindrocarpon lucidum Booth (a fungus from a Wisconsin soil sample) and olypocladium inflatum Gams (a fungus from a Norwegian soil sample). Their structures were reported in 1976. 1 It was fortunate t

10、hat this group tested all of their new compounds for not only antibacterial and antifungal activity, but also for antiviral, cytostatic and immunosuppressiveactivity. The latter tests looked for a diminution of cytotoxic T-cell activity, and cyclosporin A proved to have high potency coupled with a l

11、ack of cytotoxicity and this was a key discovery.環(huán)孢菌素A重要品種n Subsequently, the structurally unrelated polyketide metabolite FK506 (3) was isolated in 1984 by the Fujisawa Pharmaceutical Company who were engaged in a systematic screening programme for agents with similar activity to cyclosporinnStrept

12、omyces tsukubaensis 9996 (found in a soil sample from the Tsukuba region of N. Japan) provided a product with around 100 times greater immunosuppressant activity than cyclosporin A. Its structure was finally elucidatedin 1987 and it subsequently entered clinical use in 1991 under the trade name Tacr

13、olimus (Prograf).來氟米特（LEF）又稱雷抑素免疫增強劑的研究n免疫增強劑根據(jù)其作用原理可分為中樞性免疫增強劑和儲存性免疫增強劑；n儲存性免疫增強劑與抗原同時、同部位注射時可以改變抗原分子構(gòu)型或其電荷，從而增強抗原性，或延長抗原的儲存和釋放的時間，由此持續(xù)地刺激機體而增強特異性免疫應答；n中樞性免疫增強劑能激活一種或多種免疫活性細胞或是通過促進免疫細胞表面標志的表達、加速細胞的成熟與增殖，或是作用于某些淋巴細胞的亞群而間接發(fā)揮作用；n常用的免疫增強劑有鋁佐劑、油懸液佐劑、BCG、干擾素、脂多糖、真菌糖肽、某些中草藥等。白細胞介素-2n白細胞介素-2是輔助T細胞分泌的淋巴因子，在

14、免疫系統(tǒng)中起著重要的作用，它能促進T細胞，NK細胞，B細胞的分化成熟及激活其生物活性，誘導淋巴因子激活的殺傷細胞活性，還能促進許多淋巴因子如干擾素、腫瘤壞死因子等的合成與釋放以及抗體生成。因此白細胞介素-2能大大增強機體免疫功能，對不少感染性疾病有治療作用，對某些腫瘤的防治有良好的效果。真菌多糖n 從各種真菌中提取的真菌多糖組分，常有活化人體巨噬細胞，刺激抗體產(chǎn)生，從而達到提高人體免疫力，增強人體抗病防癌能力的作用。從真菌中提取的多糖，優(yōu)于從動物體內(nèi)血液中提取的免疫球蛋白，具有更大的提高人體免疫力和抗癌的作用。n香菇多糖：為一種免疫刺激劑，能增強輔助T細胞的功能，可用于治療慢性肝炎和肝癌；n銀

15、耳多糖：能明顯促進特異抗體的形成和腹腔巨噬細胞的吞噬能力，增加外周血液中T淋巴細胞數(shù)量；n冬蟲夏草多糖、靈芝多糖等。免疫增強劑發(fā)展趨勢n未來的免疫增強劑應該有以下特征：能促進體液免疫和細胞免疫；能增強弱免疫性抗原的抗原性，而沒有毒副作用；能以不同途經(jīng)免疫，也能用于不同抗原；能在免疫抑制個體中發(fā)揮作用；能應用于食用動物不應有殘余毒素；能有效影響免疫反應的質(zhì)量；穩(wěn)定、便宜而且容易生產(chǎn)和保存。核酸藥物的研究n什么是核酸藥物？各種具有不同功能的核酸、核酸類似物、寡聚核糖核苷酸（RNA）和寡聚脫氧核糖核苷酸（DNA），后者主要作用于基因水平，在信息流上游起作用。n核酸類藥物：Aptamers， 抗基因核

16、酸藥物，核酶，反義核酸和其他核酸類似物等。核酸藥物分類反義核酸n反義核酸包括反義()和反義()兩種,是指與靶(多為)具有互補序列的或分子。n它通過與靶進行堿基配對結(jié)合的方式參與基因表達的調(diào)控。通常把轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反義的基因稱為反義基因()或反義,因其與轉(zhuǎn)錄靶的目的基因是反義的。 新的反義核酸藥物新的反義核酸藥物n反義核酸的第二代新藥通過抑制apoB蛋白100來降低血脂，它是致動脈硬化脂蛋白的克星；n波士頓麻薩諸塞州召開的2004年世界藥物開發(fā)技術(shù)的會議上，美國舊金山加利福尼亞大學的Stephen Young說：“因為這種藥物專門抑制apoB蛋白，從而達到降低血漿膽固醇的作用，這在人類歷史上還是第一次

17、，所以原始資料另人非常滿意。抑制SARS病毒復制的反義核酸藥物 n工研院生物醫(yī)學工程中心與美國ISIS藥廠於1月14日同步在臺北及美國加州同步發(fā)表SARS反意核酸藥物n其一為開發(fā)可有效抑制SARS冠狀病毒複製的第二代反意核酸藥物；其二為成功完成利用肺部輔助器械之吸入式噴霧劑型藥物。n以開發(fā)RNA藥物為主的美國ISIS公司為全球第一個商業(yè)化量產(chǎn)反意核酸藥物的公司，共取得一千餘項反意核酸藥物相關專利，目前至少有11個反意核酸藥物正在臨床試驗階段，包括：氣喘、癌癥等。RnR是第一個被應用于動物腫瘤和臨床白血病治療的,并取得一定的效果。但由于它在抗腫瘤方面存在一定的缺陷和不足,因此酶學家們轉(zhuǎn)向其它的的

18、研究。最初從曲霉菌中分離出的一種,能夠抑制大鼠腫瘤生長,但是臨床試驗顯示其毒性較高,抗腫瘤作用較弱。后來, 顯示出強大的抗腫瘤功能,通過細胞毒作用誘導腫瘤細胞的凋亡,抑制腫瘤的生長,特別是惡性腫瘤細胞對其敏感性更強。傳統(tǒng)的核苷酸藥物n傳統(tǒng)的核酸藥物或稱為核苷、核苷酸及其類似物如：8氯腺苷、三氮唑核苷，S腺苷蛋氨酸等S-腺苷蛋氨酸；S-（5-脫氧腺嘌呤核苷-5-基）蛋氨酸微球、納米球制劑n微球()、納米球()技術(shù)是由上世紀末發(fā)展起來的新型給藥技術(shù)。n微球系指藥物溶解或分散在輔料中形成的粒徑為1250微小球狀實體,而粒徑在101000之間的通常稱之為納米球(納米粒)。n藥物以微球、納米球的形式給藥后,可使藥物具有靶向和控釋作用,改變了藥物在體內(nèi)的動力學,從而提高藥物的生物利用度,降低毒副作用。n除了抗腫瘤化療藥物的以微球形式給藥外,來自傳統(tǒng)中藥領域抗癌