BrukerInVivoXtreme小動物活體成像系統(tǒng)標準操作規(guī)程

1、BrukerIn-VivoXtreme小動物活體成像系統(tǒng)標準操作規(guī)程【目的】通過制定本操作規(guī)程,規(guī)范小動物活體成像系統(tǒng)使用。【準備】1、 實驗試劑（藥物、染料、麻醉劑、水、脫毛膏等）;2、 實驗對象（小鼠、大鼠、黑鼠、裸鼠等）;3、 如需要氣體麻醉則要進行氧氣準備,將麻醉劑倒入麻醉機中,并檢查麻醉機檢查窗中液位位于“min”與“Max”之間;氣體麻醉前根據(jù)室內溫度情況酌情打開動物空氣加熱器?！鹃_機】主機部分:1、打開X-Ra戊源，將開關鑰匙打到“ON”的位置；2、打開主機，將主機右后方的電源開關打到“ON”的位置。接著打開電腦，等待網(wǎng)線圖標出現(xiàn)一個黃色三角嘆號后,將MI軟件打開。注意:儀器開機

2、以后,需要大約20分鐘的預冷時間。附屬部分:1、 如需要進行氣體麻醉,則需要打開麻醉機,并對實驗對象進行預麻醉;2、如果需要進行三維旋轉拍攝，則需準備動物旋轉系統(tǒng)（MARS）動物旋轉系統(tǒng)的準備需要在不開拍攝軟件與MARS控制器按鈕打到manual的情況下，先按要求將旋轉器安裝到暗箱中，然后將按鈕打到auto,完成之后即可打開MI軟件【拍照】1、將實驗對象擺放到托盤中,拍照部位朝下,如拍攝腹部影像,需將實驗對象腹部朝下,并將四肢伸展開,然后將托盤放入暗箱拍攝位置,放置就是托盤缺口朝右側擺放;2、雙擊桌面MI圖標，打開MI軟件，單擊“Capture”按鈕，打開拍攝參數(shù)設置界面；1）:拍攝界面頂部顯

3、示儀器型號。MI軟件提供同時拍攝兩張圖像的功能,即第一張圖像就是Foreground,主圖像，第二張圖像就是Background背景圖像。點擊Foreground與Background按鈕進行切換，對兩張圖像的拍攝程序分別進行編輯。2）:左邊第一部分File里可以執(zhí)行與創(chuàng)建、編輯修改一個Protocol,同時,Protocol還可以通過點擊軟件頂部的工具欄中Protocol按鈕打開。3）:第二部分就是選擇拍攝模式,共有5種,分別為Fluorescence熒光,Luminescence學發(fā)光，Radioisotopix同位素,X-RayXtReflectance反射光,另外可以Custom定制程

4、序。點擊Setting的下拉菜單,可以選擇我們已經(jīng)設定好的拍攝程序,或者選擇DefaultSession默認設置，與CurrentSession來新建一個拍攝程序。每個拍攝模式都有一個默認設置，具體拍攝條件如下（InVivoXtremeENG,42M）:Tat>le3.TU5lofModaIriesandassccialedOetauits«Uinys.ModalityBackgroundExposureTim#FOV和scopBin*FilterFocalZoneFluorescenceStandardX-ray2secLastselected22x2EmSelectExSe

5、lectTrayLuminescenceStandardX-ray10secLastselected114x4Em-NaneTrayRadioisotopicReflectance30secLastselected114x4Em-NoneX-rayX-RayMore1.2secLastselected21x1X-ray-0.4(45kVp)X-rayReflectanceNone0.1sec(4MP)02sec(16MP)Lastselected111x1NoneTrayH),Forthe16Mpcarnera,thebinningshouldbedoubledForexample2x2bin

6、ningbecomes4x4.右邊的save保存程序，saveas另存為與重命名，Delete刪除程序。點擊Unlock與Lock鍵，可以對鎖定的程序解鎖或為鎖定的程序設置密碼鎖定。在Annotation框中輸入文字，可以對該程序拍攝的圖片進行至多48個字符的注釋。在AccumulationPath欄里選擇圖像的保存路徑。4):第三部分就是選擇或者不選背景圖像,BackgroundImage的下拉菜單里可以不選背景圖像或者選擇某個拍攝程序生成背景圖像。軟件預設了一個標準的X光拍攝程序，一個高分辨率的X光拍攝程序與一個反射光的拍攝程序，具體拍攝條件可以在Background中查瞧。如果我們在Ba

7、ckground中編輯保存了自己的程序，在這里也可以選用。5):第四部分中可以查瞧設備的IP地址，相機的序列號與CCD就是否已經(jīng)準備好，如果方塊變成綠色就表示CCD已經(jīng)降到預設溫度，儀器已經(jīng)可以正常使用。6):右邊第一部分就是光源設定，在光源的下拉菜單中，生物發(fā)光與同位素拍攝選才?Luminescence反射光拍攝選擇ReflectanceRGB,熒光與白光拍攝選擇Muti-wavelength,X光拍攝選擇X-ray。在ApplyReferenceFile中選擇就是否應用校正文件，None就是不應用校正文件,Auto就是當已經(jīng)設置了合適的校正文件時，軟件自動選擇匹配的校正文件，選才¥

8、;Manual后先進行正常的圖像拍攝，拍完后移除樣品與托盤，再進行校正文件的拍攝。為了保證圖像質量，凡就是涉及到運用光源的實驗，例如熒光，白光,反射光與X光成像，都必須設置合適的校正文件。熒光、白光與反射光的校正文件跟光圈大小、成像視野、焦距與激發(fā)發(fā)射波長相關；X光的校正文件跟光圈大小、成像視野、焦距與鋁膜相關；當改變拍攝程序中的以上參數(shù)時，必須重新拍攝與設置校正文件。以下就是校正文件的推薦參數(shù)設置：SettheexposuretimeusingtheExposureTimetexteditboxandUnitspop-upmenu./Fluorescencesettheexposuretim

9、eto1secondwith4x4binningandincreaseordecreaseasnecessarytogenerate>10,000graylevelsinasingleexposure.值FNOTE:Longerwavelengthfilterpairsmayrequirelongerexposuretimes./Reflectance-settheIntensityofallLEDstoHighandbeginwitha0,2secondexposureanincreaseasnecessarytogenerate>10.000graylevelsinasingl

10、eexposure,/X*Ray-settheexposuretimeto2secondswith2x2binningtogenerate>10t000graylevels,摩平NOTE:AnX-rayIlluminationReferenceFileiscreatedatthetimethattheIn-VivoXtremeImagingSystemisinstalled.Itisonlynecessarytocreateanewilluminationreferencefileiftheoriginalfileiscorruptedoraccidentallydeleted,吐NOT

11、E:CreationofanX-rayIlluminationReferenceFileshouldbeideallyperformedafterarestartofthesystemafterremainingidleovernight.當選擇多重曝光時，應用FinaAccumulation最終只生成一張圖片，AllAccumulations每次曝光的最終結果都就是與之前的圖片疊加后的結果，保存每次曝光所產生的圖片，但在軟件中只打開最后一張。AllImage就是指保存每次疊加的圖片以及單張圖片。SeparateImages就是指只保存單次曝光的結果圖片。7）右邊的第二部分就是選擇濾光片，當進

12、行X光拍攝時，可以選擇不同厚度的鋁膜，鋁膜越厚，過濾掉低能量的X射線就越多，骨骼與肌肉軟組織的對比度越高，圖像越清晰。因此大鼠X光成像，對骨骼清晰度要求高的圖像，或者需要進行骨密度分析的圖像，建議選擇0、8mm厚度的鋁膜。這里可以選擇X光機的能量，有20、25、30、35、40、45幾檔可選，高清晰度的X光成像需要高能量，一般大鼠或小鼠的全身骨骼成像選擇45KVR在熒光拍攝時需要選擇激發(fā)與發(fā)射濾光片，熒光成像中根據(jù)熒光物質的特性來選擇相應的濾光片，需要注意的就是激發(fā)與發(fā)射濾光片之間波長間隔必須至少在50nm以上，否則會帶來強烈的背景干擾。白光、反射光、生物發(fā)光、同位素與X光成像，濾光片都選擇0

13、與0。8）:右邊的第三部分就是相機設置。包括ExposureType曝光方式，這里可選Standard標準曝光,TimeLapse間隔曝光與做校正文件時應用的IlluminationReference曝光模式。曝光時間可以以秒與分鐘為單位任意選擇火光的最小曝光時間就是1、2秒,其它拍攝模式的曝光時間最小就是0、1秒（XtremeFI就是0、2秒）,最長就是10分鐘。曝光次數(shù)最大可選擇32次，但過多的曝光次數(shù)就是不合適的，可隨機調整。當在曝光方式中選擇TimeLapse時，這里可以選擇拍攝間隔與在多長時間或者幾幀以后拍攝停止。Mode（選才?CCD在采集圖像時的讀取速度）里有HighSpeed與

14、HighSensitivity兩個選項，建議熒光、反射光與X光選擇HighSpeed化學發(fā)光與同位素選擇HighSensitivityPredictExposureTime就是預測日M光按鈕，用此按鈕可以估計生物發(fā)光與同位素的曝光時間。選中以后彈出對話框,輸入曝光所需的灰度級,點擊計算按鈕,Xtreme會自動計算所需要的最佳曝光時間。Binning就是指像素合并，XtremeBI最高到32x32,XtremeFI最高到64x64,像素合并就是指將CCD的相鄰幾個像素合并成一個像素在圖像中呈現(xiàn),提高CCD的拍攝靈敏度與響應速度。當拍攝弱信號比如化學發(fā)光或者同位素時,可能需要用到4x4以上的像素合

15、并。InstantDCR就是指CCD的即時暗電荷修正設置，對大多數(shù)的圖像來說，0、5-1之間的值比較合適。當用到小樣品臺進行小視野的X光成像時，必須勾上MagStage這個選項，小樣品臺提供放大倍數(shù)為3、3倍的X光成像,特別適合拍攝爪子、關節(jié)、頭顱等部位。FOV中調節(jié)成像面積,XtremeBI分別有7、2x7、2cm,10x10cm,12x12cm,15x15cm,18x18cmf19x19cm的6個成像視野可選擇。fStop就是選擇光圈的大小，光圈數(shù)值越小通光量越大，成像的信號強度越高。FocalPlane就是選擇成像的焦距，熒光、白光與反射光等所有在托盤上的成像選擇Tray,X光與同位素等

16、在磷屏上的成像選擇X-Ray9):右邊的最下方可以切換拍攝界面的Standard與Advanced模式。Preferences按鈕可對儀器硬件進行設置與調試。點擊Preview進入預覽界面，預覽界面中可以調節(jié)拍攝時間與焦距，打開反射與白光光源等。點擊Capture按鈕直接進行拍攝。3、新建不同模式的拍攝程序1):以新建一個熒光拍攝程序為例,首先在Modality中選擇Fluorescence,Setting中選擇CurrentSesion,ApplyRefernceFil升選擇None,然后設置合適的激發(fā)與發(fā)射濾光片，這里以綠色熒光蛋白GFP的激發(fā)與發(fā)射光480,535為例,ExposureT

17、ype選擇Standard,曝光時間、Bin、FOVfStop與FocalPlanet艮據(jù)需要選擇，下面就是不同拍攝模式的推薦拍攝程序:Thefollowingtableisasummaryoftheseguidelinesandhelpfulsuggestions:Table4.1：imageCaptureGuidelinesModalityExposureType"f-stopIlluminationTypicalExposureTimeFluorescenceStandardexposure,binningM.1-氏6Multi-wavelength1-30secondsLum

18、inescenceStandardexposurerbinningf1.1None<5minutesRadioisotopicStandardexposure,binningf1.1None<5minutesX-RayStandardexposurehupto2x2binning2-M.OX-Ray1.2second-iminuteReflectanceStandardexposurenobinningRGB-LED0Jsecond(4MP)0.2seconds(16MP)*StandardSingleexposuresprovideexcellentquality16-bitim

19、agesthataregoodformostapplicationsStandardmultipteaccurriulartedimageoptionsmayalsobeusedtoimprovequanUtstionanddvnarriicranae-bevond16-bit.選好之后點擊Saveas為程序命名并保存程序。由于熒光、白光、反射光與X光需要做背景校正，所以接下來我們做一個背景校正文件，在ExposureType中選擇IlluminationReference,把動物倉中的樣品與樣品托盤取出，正確放置EPI屏（做X光背景校正文件需正確安裝X光磷屏，做反射光校正文件需放置Backd

20、rop屏）,關閉倉門點擊Capture按鈕，軟件進行校正文件的拍攝。拍完之后校正文件自動在MI軟件中打開，此時將拍攝模式改回Standard校正文件應用中選擇Auto,點擊Save保存程序，這樣一個完整的熒光拍攝程序就建好了。2）:設置Background在拍攝界面上方點擊Background按鈕切換到背景圖像編輯界面。與Foreground的設置相似，Background也可以選擇熒光、生物發(fā)光、同位素、X光與反射光的拍攝模式，具體程序的設置請參考Foreground的設置，需要注意的就是，軟件設置了2個X光與一個反射光的默認程序供用戶選擇，用戶可根據(jù)具體需求設置。當一個設置了Background的程序點擊Capture拍攝時，軟件會要求提供保存路徑，拍完之后兩張圖像直接存儲且在MI軟件中打開,Background疊力口Foreground后顯示,Fore