生物化學實驗教學內(nèi)容

1、生物化學實驗第 一 節(jié) 基本要求一、內(nèi)容提要基礎生物化學 實驗內(nèi)容， 主要以植物材 料為研究對 象。 實驗項目包括 糖類、 脂類、 蛋白質(zhì)和氨基 酸、核酸、酶、維生素的測定 ，既有定性又有 定量。實驗內(nèi)容編排 不求齊全， 而力求原理闡 述簡明扼要 ，通俗易懂，方法可靠，操作具體詳盡 ， 重復性好，靈敏度高。實驗方法涉及 傳統(tǒng)的滴定 法以及分光 光度法、層析法和電泳 等現(xiàn)代生物 化學實驗技 術。 本實驗指導可 供高等農(nóng)業(yè) 院校農(nóng)學類 、 生物技術以及 相關專業(yè)的本、?？茖W生使用 ，也可供從事與 生物科學有 關的科研工 作者閱讀與 參考。在以驚人速度 發(fā)展的生物 科學中， 生物化學是其 中最活躍的

2、 分支學科之 一， 它已成為發(fā)展 生命科學各分支學科和 生物工程技 術的重要基 礎。 作為一門研究 生命活動基 本規(guī)律的科 學， 它又是一門實 驗科學。工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、能源、環(huán)境科學等越 來越多的研 究領域都以 生物化學理 論為依據(jù)， 以其實驗技 術 為手段，生物化學已成 為高等院校 許多相關專 業(yè)學生必修 的專業(yè)基礎 課程。根據(jù)高等農(nóng)業(yè) 院校農(nóng)學類 專業(yè)教學計 劃， 基礎生物化學 課程是一門 重要的專業(yè) 基礎課； 并且又是實踐性極強的應 用學科。只有掌握扎實 而廣泛的基 礎知識和熟 練的操作技 能才算真正 掌握好這門 應用科學 。 因此，我們組織編寫 這本基礎生 物化學實驗 指導。本

3、實驗指導主 要是配合基 礎生物化學 教材， 供高等農(nóng)業(yè)院 校農(nóng)學類、 生物技術以及 相關專業(yè)的 學生使用 。 實驗多以植物 材料為主要 研究對象； 以生物大分子 碳水化合物、 核酸、 蛋白質(zhì)和酶等 為主要研 究 內(nèi)容。實驗方法涉及 到分光光度 法、層析、電泳等現(xiàn)代生 物化學實驗 技術。在實驗內(nèi)容編 排上，既有定性的又 有定量的； 實驗教材由基 礎生物化學 實驗和附錄 兩部分組成 。 實驗部分列出 的實驗項目 包括糖類 、 脂類、蛋白質(zhì)和氨基 酸、核酸、酶、維生素的測定 ，有些項目包括 幾種不同方 法，每一實驗方法分為目的、 原理、實驗材料、儀器和試劑、 操作步驟、結果計算、注意事項、思考題及參

4、考 答案。本實驗指導從 一定角度反 映了我國生 物化學研究 技術目前的 水平和狀況 ， 內(nèi)容不求全， 而力求其可靠性和方法性 。 在編寫過程中 ， 力求做到原理 闡述簡明扼 要， 通俗易懂，方法操作具體 詳盡， 重復性好，靈敏度高，且注重培養(yǎng)學 生嚴謹?shù)目?學態(tài)度，獨立分析、解決問題的能 力， 為提高其良好 的科研素質(zhì) 奠定基礎 。本實驗指導的 出版是集體 勞動的結晶 。 主要由在教學 第一線多年 從事基礎生 物化學理論 與實驗課教學與研究工 作的教授、 副教授和具有 博士、 碩士學位的中 青年教師等 共同編寫。 正是他們長期 不懈的辛勤勞動以及在 編寫工作中 給予的極大 支持， 才使本實驗指

5、 導得以順利 出版。 特別是陳祖潔 教授始終關 注本實驗 指 導的編寫進 程， 在百忙中審閱 了全部稿件 并提出許多 寶貴意見。 編者在此一并 表示深深的 謝意。由于我們的經(jīng) 驗和水平有 限， 加之時間較倉 促， 書中難免出現(xiàn) 不妥甚至錯 漏之處， 我們真誠希望 廣大讀者 在 參考使用中 不斷向我們 提供寶貴的 批評和建議 ，以臻逐趨完善 。編者 于山西農(nóng)業(yè)大 學 2005.6.10二、實驗記錄及實 驗報告每次實驗要做 到課前認真 預習， 實驗操作中仔 細觀察并如 實記錄實驗 現(xiàn)象與數(shù)據(jù) ， 課后及時完成 實驗報告 。1 課前預習實驗課前要將 實驗名稱、 目的和要求、 實驗內(nèi)容與原 理、 操作

6、方法和步 驟等簡單扼 要地寫在記 錄本中，做到心中有數(shù) 。2實驗記錄從實驗課開始 就要培養(yǎng)嚴 謹科學作風 ， 養(yǎng)成良好習慣 。 實驗條件下觀 察到的現(xiàn)象 應仔細地記 錄下來，實驗中觀測的 每個結果和 數(shù)據(jù)都應及 時如實地直 接記在記錄 本上， 記錄時必須使 用鋼筆或圓 珠筆， 并做到原始 記 錄準確、簡練、詳盡、清楚。如稱量試材樣 品的重量、 滴定管的讀數(shù) 、分光光度計的 讀數(shù)等，都應設計一定 的表格準確 記下正確的 讀數(shù)，并根據(jù)儀器的 精確度準確 記錄有效數(shù) 字。例如，光密度值為 0.050，不應寫成.05。每一個結果至 少要重復觀 測兩次以上 ，當符合實驗要 求并確知儀 器工作正常后再寫在

7、記 錄本上。另外，實驗中使用儀 器的類型、 編號以及試劑 的規(guī)格、化學式、分子量、準確的濃度 等 ， 都應記錄清楚 ， 以便總結實驗 完成報告時 進行核對和 作為查找成 敗原因的參 考依據(jù)。如果發(fā)現(xiàn)記錄的結果有懷 疑、遺漏、丟失等，都必須重做實 驗。3實驗報告實驗結束后， 應及時整理和 總結實驗結 果， 寫出實驗報告 。 按照實驗內(nèi)容 可分為定性 和定量兩大 類，實驗報告的格 式：實驗序號，實驗名稱；（ 1）目的和要求（ 2）內(nèi)容與原理（ 3）主要儀器及試 劑配制（ 4）操作方法與實 驗步驟（ 5）結果與討論定性實驗報告 中的實驗名 稱和目的要 求是針對該 次實驗課的 全部內(nèi)容而 必須達到的

8、目的和要求 。 在完成實驗報 告時， 可以按照實驗 內(nèi)容分別寫 原理、 操作方法、結果與討論等 。 原理部分應簡 述基本原理 。操作方法（或步驟）可以流程簡圖 的方式或自 行設計的表 格來表示。 結果與討論包 括實驗結果 及觀察現(xiàn)象的小結、對實驗課遇到 的問題和思 考題進行探 討以及對實 驗的改進意 見等。定量實驗報告 中，目的和要求、 原理以及操作 方法部分應 簡單扼要的 敘述， 但是對于實驗 條件 （試劑配制及儀 器） 和操作的關鍵 環(huán)節(jié)必須寫 清楚。 對于實驗結果 部分， 應根據(jù)實驗課 的要求將一 定實驗條件下獲得的實 驗結果和原 始數(shù)據(jù)進?行 認 真記錄 、 整理、歸納、分析和對比，

9、并盡量總結成 各種圖表， 如原始數(shù)據(jù)及 其處理的表 格、 標準曲線圖以 及比較實驗 組與對照組 實驗結果的 圖表等。另外， 還應針對實驗結果進行必 要的說明和 分析。 討論部分可以 包括：關于實驗方法 （或操作技術） 和有關實驗的 一些問題 ， 如實驗的正常 結果和異常 現(xiàn)象以及思 考題進行探 討， 對于實驗設計 的認識、體會和建議， 對實驗課的 改 進意見等。3第二節(jié)？操作要領第一節(jié)碳水化合物實驗一 還原糖和總糖的測定一一3,5-二硝基水楊酸比色法一、目的掌握還原糖 和總糖測定 的基本原理，學習比色法 測定還原糖的操作方法 和分光光度 計的使用。二、原理還原糖的測 定是糖定量 測定的基本 方

10、法。還原糖是指 含有自由醛 基或酮基的糖類，單糖都是還 原糖, 雙糖和多糖 不一定是還原糖，其中乳糖和 麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉 是非還原糖。利用糖的溶 解度不 同，可將植物樣 品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來，對沒有還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使 其降解成有還原性的單糖進行測定，再分別求出 樣品中還原 糖和總糖的含量(還原糖以葡 萄糖含量計)。還原糖在堿 性條件下加 熱被氧化成 糖酸及其它 產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊 酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量 與棕紅色物質(zhì)顏色的深 淺成正比關 系，利用分光光 度計， 在 m波長下測 定光密度值，查對標準曲

11、線并計算，便可求出樣 品中還原糖和總糖的含 量。由于多 糖水解為單糖時，每斷裂一個 糖昔鍵需加 入一分子水，所以在計算 多糖含量時應乘以0.9。3,5-二硝基水楊酸(黃色)3-氨基-5-硝基水楊酸(棕紅色)三、實驗材料、主要儀器和 試劑1 .實驗材料小麥面粉；精密 pH試紙。2 .主要儀器(1)具塞玻璃刻 度試管：20mL< 11(2)大離心管：50mL< 2(3)燒杯：X1(4)三角瓶：X1(5)容量瓶：與(6)刻度吸管：1mL< 1; 2mL<2; 10mL< 1(7)恒溫水浴鍋(8)沸水浴(9)離心機(10)扭力天平3.試劑(1) 1mg/mL葡萄糖 標準液

12、準確稱取 0c烘至恒重的 分析純葡萄 糖g,置于小燒杯 中，加少量蒸儲 水溶解后，轉(zhuǎn)移到 0mL容量瓶中，用蒸儲水定 容至 mL,混勻，4c冰箱中保存 備用。(2) 3,5-二硝基水楊 酸(DNS)試劑將6.3g DNS和62mL 2M NaOH溶液，加到 mL含有 85g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g 結晶酚和 亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸儲水定容至L,貯于棕色瓶 中備用。(3) 碘-碘化鉀溶液：稱取5g碘和10g碘化鉀，溶于 mL蒸儲水中。(4) 酚酗:指示劑：稱取0.1g酚Mt,溶于mL 70%乙醇中。(5) 6M HCl 和 M NaOH 各 。四、操作步驟1 .制作葡萄糖標準曲線

13、取7支 mL具塞刻度試管編號，按表1分別加入濃度為1mg/mL的葡萄糖標準液、蒸儲水和 ，5- 二硝基水楊 酸(DNS)試劑，配成不同葡 萄糖含量的反應液。表1葡萄糖標準曲線制作管號1mg/mL葡萄糖標準液 (mL)蒸儲水(mL)DNS (mL)葡萄糖含量(mg)光密度值( )0021.5010.21.81.50.220.41.61.50.430.61.41.50.640.81.21.50.851.01.01.51.061.20.81.51.2將各管搖勻，在沸水浴中準確加熱 min,取出，冷卻至室溫，用蒸鐳水定容至L,加塞后顛倒混勻，在分光光度 計上進行比色。調(diào)波長 0nm,用0號管調(diào)零點，測

14、出16號管的光密度值。以光密度值為縱坐標，葡萄糖含量 (mg)為橫坐標，在坐標紙上 繪出標準曲線。2 .樣品中還原糖和總糖的測定(1)還原糖的提取準確稱取.00g食用面粉，放入 mL燒杯中，先用少量蒸 儲水調(diào)成糊狀，然后加入 0mL蒸儲水, 攪勻，置于50c恒溫水浴中 保溫 in,使還原糖浸 出。將浸出液(含沉淀)轉(zhuǎn)移到 mL離心管中， 于4 000r/min下離心 ，沉淀可用 0mL蒸儲水洗一次，再離心，將二次離心 的上清液收 集在 mL 容量瓶中，用蒸儲水定 容至刻度，混勻，作為還原糖 待測液。(2)總糖的水解和提取準確稱取.00g食用面粉，放入 mL三角瓶中，加 蒸儲水及 0mL 6M

15、HCl ,置沸水浴中 加 熱水解 0min (水解是否完 全可用碘-碘化鉀溶液 檢查)。待三角瓶中 的水解液冷 卻后，加入1滴酚酬:指示劑，用中和至微紅色，用蒸儲水定 容在 mL容量瓶中，混勻。將定容后的 水解液過濾，取濾液 mL,移入另一 00mL容量瓶中定容，混勻，作為總糖待 測液。(3)顯色和比色取4支 mL具塞刻度試管，編號，按表2所示分別加入待 測液和顯色齊IJ,空白調(diào)零可 使用制作標準曲線的 號管。加熱、定容和比色 等其余操作 與制作標準曲線相同。表2樣品還原糖測定管號還原糖待測液(mL)總糖待測液(mL)蒸儲水 DNS光密度值(nm)查曲線萄糖量(mg)(mL)(mL)70.51

16、.51.580.51.51.59111.510111.5五、結果與計算：計算出7、8號管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均 值，在標準曲線 上分別查出相應的還原糖毫克數(shù)，按下式計算 出樣品中還 原糖和總糖的百分含量。提取液總體積(ml)查曲線所得 葡萄糖毫克數(shù)X還原糖()測定時取用體積(ml)X100樣品毫克數(shù)查曲線所得 水解后還原糖毫克數(shù) X釋倍數(shù)總糖() = X0.9 100樣品毫克數(shù)六、附注1 .離心時對稱 位置的離心 管必須配平。2 .標準曲線制 作與樣品測 定應同時進 行顯色，并使用同一 空白調(diào)零點和比色。3 .面粉中還原糖含量較少，計算總糖時可將其合并入多糖一起考慮。七、思

17、考題1 . 3,5-二硝基水楊酸比色法是如何對總糖進行測定的？2 .如何正確繪 制和使用標 準曲線？1 .植物中的總糖包括單糖、寡糖和多糖，單糖是還原糖，可直接測定。而沒有還原性的寡糖和多 糖，需用高濃度 的酸在加熱的條件下水解成有還原性的單糖，還原糖在堿 性條件下加熱被氧化成糖酸及 其它產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊 酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍 內(nèi)，還原糖的量 與 棕紅色物 質(zhì)顏色的深 淺成一定比例關系，利用分光光 度計，在 m波長下測 定光密度值，查對標準 曲線并計算，可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水 解為單糖時，每斷裂一個 糖昔鍵需要 加入分子水，所以在

18、計算 多糖含量時應乘以0.9。2 .標準曲線應 在坐標紙上 繪制，橫坐標軸距 坐標紙底邊1.52cm,標示出刻度 和葡萄糖的毫克數(shù)； 縱坐標軸距 坐標紙左邊1.52cm ,標示刻度和 光密度值；曲線為過原 點的直線，測定點均勻 分布在直線的 兩側；標準曲線只 能在測試條件完全相同的情況下，用于確定樣 品中的物質(zhì) 含量。對于重復的 測定，應 取吸光度 的平均值查 標準曲線；測定數(shù)據(jù)不 應記在標準曲線上。實驗二還原糖含量 測定 礎鋁酸比色 法一、目的植物體內(nèi)的 還原糖主要 是葡萄糖、果糖和麥芽 糖。它們在植物 體內(nèi)的分布，不僅反映植 物體內(nèi)碳水 化合物的運 轉(zhuǎn)情況，而且也是合 成其它成分碳架來源和

19、呼吸作用的基質(zhì)。此外，水果、蔬菜中含糖 量的 多少，也是鑒定其 品質(zhì)的重要指標。其它碳水化 合物，如淀粉、蔗糖等，經(jīng)水解也生成還原糖。因此，測定還原糖 的方法在研究植物體內(nèi)生理生化變化和測定植 物體內(nèi)碳水 化合物方面都是很重要 的。二、原理還原糖是具有玻基(>C=O)的糖，能將其它物 質(zhì)還原而其本身被氧化。(1)還原糖在堿 性條件及有 酒石酸鉀鈉 存在下加熱，可以定量地 還原二價銅 離子為一價 銅離子，產(chǎn) 生磚紅色 的氧化亞銅 沉淀，其本身被氧 化。具體反應如 下：(2)氧化亞銅在 酸性條件下，可將鋁酸錢 還原，還原型的鋁 酸俊再與神 酸氫二鈉起作用，生成一 種藍色復合物一一神鋁藍，其顏

20、色深淺 在一定范圍內(nèi)與還原糖 的含量(即被還原的Cu2O量)成正比， 用標準葡萄 糖與神鋁酸作用，比色后做標 準，就可測得樣 品還原糖含 量。CU21 Cu+2Cu+- + SO42- - 2Cu2+藍色復合物CuSO? +2NaOI? Na2SO 4 + Cu(OH)2Cu(OH) 2 +HO-CH-COONa?HO-CH-COOKCuO-CH-COONa?O-CH-COOK+H2OO-CH-COONa?Cu+O-CH-COOKCH=OH-C-OHHO-C-HH-C-OH1H-C-OHCH2OH?+H2OCOOHH-C-OHHO-C-H +2H-C-OHIH-C-OHCH2OH?HO-CH-

21、COONa?HO-CH-COOK+CU2O J三、實驗材料、主要儀器和 試劑1 .實驗材料：蘋果、面粉等2 .主要儀器(1)分光光度計(2)水浴鍋（3）具塞刻度試 管：20mL< 10（4）刻度吸管：1 ml M , 2 ml >4, 5 ml >3（5）容量瓶：100 ml >2（ 6）漏斗（ 7）研缽3試劑（ 1）銅試劑：A、 4? 2OB 、稱取無 水碳酸鈉， 用 L 水溶于大燒 杯中，加入2g 含 4 分子結晶水 的酒石酸鉀 鈉，待全溶（應加熱）后加入碳酸氫 鈉 ， 再加入0g 無水硫 酸 鈉（加熱），全溶及冷卻后 加水至 00mL，沉淀12d,取上清液（要求嚴

22、格時 過濾）備用。使用前將與B按1 ： 9混勻即可使用。（2）神鋁酸試劑：25g鋁酸鏤（NH4）24 4H2O溶于 L蒸儲水中（加熱溶解，但溫度接近150c時易分解），待冷卻后再 加入 L濃O4混勻。另將3g神酸氫二鈉sO4 7H2。）溶解于 mL蒸儲水中，然后加到鋁 酸鏤溶液中，室溫下放置 于棕色瓶中可長期使用。（ 3） mL 標準葡 萄 糖原液：準確稱取分析 純葡萄糖， 溶解定容到L。四、操作步驟1標準曲線的制 作：在一系列刻度 試管中，分別加入 mL 標準葡 萄 糖 0、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5 及 0.6 mL，再順序加入 蒸儲水2、1.9、1.8、1.7、1.

23、6、1.5及1.4 mL,配成濃度分 別為0、10、20、30、40、50及的系列葡萄糖溶液。每試管加入銅試劑 L,混勻后沸水浴中加熱0min,立即冷卻，再加入L 砷鉬酸試劑 ， 振蕩兩分鐘后 稀釋到 0mL， 用分光光度計 在 nm 波長下 比 色， 測其光密度nm（做一式兩份） 。以糖濃度微克 數(shù)為橫坐標 ，光密度為縱坐標，繪制標準曲線 。2植物樣品中還 原糖的提取 ：將樣品洗凈， 吸干其表面水 分，切碎混勻，稱取1g 放 入 研缽中，加入約0.5g 石英砂 ， 磨成勻漿，加水將樣品 由玻璃漏斗沖入mL容量瓶中，加水達80mL,搖勻后置于80c恒溫水浴上 浸提0.5h。待上述樣品 冷卻后，

24、沉淀蛋白質(zhì)，加入5%硫酸鋅 L,再慢慢滴入0.3mol/L Ba（OH） 2 5mL,以沉淀蛋白 質(zhì) 。振蕩后靜置， 至上層出現(xiàn)清 液后再加一 滴 Ba（OH） 2，直至無白色沉 淀時，向容量瓶加水 至刻度。3還原糖含量的 測定：過濾上述已 定容的樣品液，取5mL濾液，再定容到 00mL （此步視樣品 的含糖量而 定）。取已稀釋 的溶液 ，與標準葡萄糖顯色法相同：加銅試劑 mL,煮沸in,加神電目酸試劑2mL ,振蕩 ，定容到 ml,波長下比色，記下光密度 向（至少重復兩 次）。五，結果計算GX稀釋液倍數(shù)還原糖含量（尸 W 106式中：G從標準曲線上查得含糖量（）W 樣品重（g）六、思考題舉例

25、說明哪些是還原糖？參考答案：還原糖是指 含有自由醛 基或酮基的糖類，單糖都是還 原糖，雙糖和多糖 不一定是還原糖，其中果糖、 乳糖和麥芽 糖是還原糖，蔗糖、淀粉和纖維 素等是非還 原糖。第二節(jié)脂類實驗一脂肪碘值的測定一、目的掌握測定脂 肪碘值的原 理和操作方法，了解測定脂 肪碘值的意義。二、原理不飽和脂肪 酸碳鏈上含有不飽和鍵，可與鹵素（Cl2, B2, I2）進行加成反 應。不飽和鍵數(shù) 目越多， 加成的鹵素 量也越多，通常以 碘值”表示。在一定條件 下，每 脂肪所吸收碘的克數(shù)稱為該脂肪的 碘 值”。碘值越高，表明不飽和 脂肪酸的含量越高，它是鑒定和 鑒別油脂的一個重要常數(shù)。碘與脂肪的 加成反

26、應很慢，而氯及澳與 脂肪的加成 反應快，但常有取代 和氧化等副 反應。本實 驗使用IBr進行碘值的測定，這種試劑穩(wěn)定，測定的結果接近理論值。澳化碘（IBr）的一部分與油脂的不 飽和脂肪酸起加成作用，剩余部分與 碘化鉀作用放出碘，放出的碘用 硫代硫酸鈉滴定。H HI Ihc=ch + HBr CC I II Br加成反應：釋放碘：IBr + KI KBr + I 2滴定：I2O3 O6實驗時取樣 多少決定于 油脂樣品的碘值?？蓞⒖急?與表2:表1樣品最適量和碘值的關系碘值（g）30以下306060100100140140160160210樣品數(shù)（g）約1.10.50.60.30.40.20.30

27、.150.260.130.15作用時間（h）0.50.50.51.01.01.0表2幾種油脂的碘值名稱亞麻子油魚肝油棉子油花生油豬油牛油碘值（g）1752101541701041108510048642541三、試劑和器材1 .試劑(1)澳化碘溶液取12.2g碘，放入錐形瓶內(nèi)，緩慢加入冰乙酸(99.5%),邊加邊搖，同時略溫熱，使碘溶解。冷卻后，加澳約 L。注意：所用冰乙酸不應含有還原性物質(zhì)。檢查方法：取 2mL冰乙酸，加少許重銘酸鉀及硫酸，若 呈綠色，則證明有還 原性物質(zhì)存 在。(2) 0.1mol/L標準硫代硫酸鈉溶液取結晶硫代 硫酸鈉 g,溶在經(jīng)煮沸 后冷卻的蒸儲水(無CO2存在)中。添

28、加硼砂 .6g或氫氧化 鈉1.6g (硫代硫酸鈉溶液在 910時最穩(wěn)定)。稀釋到后，用標準0.1mol/L碘酸鉀溶液按下法標定：準確量取 .1mol/L碘酸鉀溶 液、10%碘化鉀溶液10mL和1mol/L硫酸 mL,混合均勻。以1 %淀粉溶液作 指示劑，用硫代硫酸 鈉溶液進行 標定。按下面所列 反應式計算 硫代硫酸鈉溶液濃度后， 用水稀釋至0.1mol/L。KIO344 +3I2 +3H2OI22O3 1-O6(3)純四氯化碳(4) 1 %淀粉溶液(溶于飽和氯 化鈉溶液中)(5) 10 %碘化鉀溶液(6) 花生油或豬油2.器材(1)碘瓶(或帶玻璃塞 的錐形瓶)(2)棕色、無色滴定管 各1支(3

29、)吸量管(4)量筒(5)分析天平四、操作步驟1 .準確稱取.30.4g花生油2份，置于兩個干 燥的碘瓶內(nèi)，切勿使油粘 在瓶頸或壁 上。加入 L 四氯化碳，輕輕搖動，使油全部溶 解。用滴定管仔 細地加入 5mL澳化碘溶液，勿使溶液接 觸瓶頸，塞 好瓶塞，在玻璃塞與 瓶口之間加數(shù)滴10%碘化鉀溶液 封閉縫隙，以免碘的揮 發(fā)損失。在2030c暗處 放置0min ,并不時輕輕 搖動。油吸收的碘 量不應超過澳化碘溶液 所含之碘量的一半，若瓶內(nèi)混合 物的 顏色很淺，表示花生油用量過多，改稱較少量 花生油，重作。2 .放置 in后，立刻小心地 打開玻璃塞，使塞旁碘化 鉀溶液流入 瓶內(nèi)，切勿丟失。用新配制的1

30、0% 碘化鉀 mL和蒸儲 水 把玻璃塞和 瓶頸上的液 體沖洗入瓶內(nèi)，混勻。用0.1mol/L硫代硫酸 鈉溶 液迅速滴定至淺黃色。加入1 %淀粉溶液約1mL,繼續(xù)滴定，將近終點時，用力振蕩，使碘由四氯 化碳 全部進入水溶液內(nèi)。再滴定至藍 色消失為止，即達滴定終 點。另作2份空白對照，除不加油樣 品外，其余操作同 上。滴定后，將廢液倒入 廢液缸內(nèi)，以便回收四 氯化碳。計算碘值。五、結果計算碘值表示 00 g脂肪所能吸收碘的克 數(shù)，因此樣品碘 值的計算如下:(AB) XTX100 碘值=C式中，A :滴定空白用 去的 S2O3溶液的平均毫升數(shù)B:滴定碘化后 樣品用去的 O3溶液的平均毫升數(shù)C:樣品的

31、重量 (g)T： 1mL 0.1mol/L硫代硫酸鈉溶液相當 的碘的克數(shù)六、附注(1)碘瓶必須潔 凈、干燥，否則油中含 有水分，引起反應不 完全。(2)加碘試劑后，如發(fā)現(xiàn)碘瓶 中顏色變淺 褐色時，表明試劑不 夠，必須再添加1015 mL試劑。(3)如加入碘試 劑后，液體變濁，這表明油脂 在中溶解不完 全，可再加些 CI4。(4)將近滴定終 點時，用力振蕩是 本滴定成敗 的關鍵之一，否則容易滴 加過頭或不足。如震蕩不 夠，CC14展會出現(xiàn)紫或 紅色，此時應用力 振蕩，使碘進入水 層。(5)淀粉溶液不 宜加得過早，否則滴定值 偏高。七、思考題1 .測定碘值有 何意義？液體油和固 體脂碘值間有何區(qū)別

32、？2 .滴定過程中，淀粉溶液為 何不能過早 加入？3 .滴定完畢放 置一些時間后，溶液應返回 藍色，否則表示滴 定過量，為什么？參考答案1 .不飽和脂肪 酸碳鏈上含 有不飽和鍵，可與鹵素(Cl2, B2, I2)進行加成反 應.不飽和鍵數(shù) 目越 多，加成的鹵素 量也越多，通常以 碘值”表示。在一定條件 下，每脂肪所吸收 碘的克數(shù)稱為該脂肪的 碘值”。碘值越高，表明不飽和 脂肪酸的含量越高，它是鑒定和 鑒別油脂的一個重要常數(shù)。因此， 液體油的碘 值應高于固體脂的碘值。2 .淀粉溶液不 宜加得過早，否則大量的I2與淀粉結合成藍色物質(zhì)，這一部分碘 就不容易與O3反應，由碘值計算 公式可知，B值減小，

33、因而使滴定 值偏高。3 .這是由于空 氣氧化I-所引起的。如果溶液未 變藍，說明I-被空氣氧化 成I2后，繼續(xù)與 發(fā) 生反應，而不與淀粉 反應生成藍 色，即 2O3過量。實驗二粗脂肪含量的測定索氏抽提法、目的51前國內(nèi)外 普遍采用抽 提法，其中索氏抽 提法（d）是公認的經(jīng) 典方法，也是我國脂肪廣泛存 在于許多植物的種子和 果實中，測定脂肪的 含量，可以作為鑒 別其品質(zhì)優(yōu)劣的一個指標。脂肪含量的測定有很多方法，如抽提法、酸水解法、比重法、折射法、電測和核磁共振法等。目糧油分折首選的標準方法。通過本實驗 的學習，掌握索氏抽 提法測定粗脂肪含量的原理和操作方法。二、原 理本實驗采用索氏抽提法中的殘余

34、法，即用低沸點有機溶劑（乙醍或石油醍）回流抽提，除去樣 品中的粗脂肪，以樣品與殘渣重量之差，計算粗脂肪含量。由于有機溶劑的抽提物中除脂肪外，還或多 或少含有游離脂肪酸、管醇、磷脂、蠟及色素等 類脂物質(zhì)，因而抽提法 測定的結果只能是粗脂肪。三、實驗材料、主要儀器和 試劑1 .實驗材料油料作物種子、中速濾紙2 .儀器:（1）索氏脂肪抽提器（圖1）或yg- n型油分測定器（2）干燥器（直徑1518cm,盛變色硅膠）1（3）不銹鋼鐐子（長 ）（4）培養(yǎng)皿8（5）分析天平（感量 0.001g）T（6）稱重瓶,（7）恒溫水浴0人聯(lián)青（8）烘箱牛演（9）樣品篩（60目）9八代取班3 .試劑I一）無水乙醛或低

35、沸點石油醒（A.R.）,索氏做提看四、操作步驟1 .將濾紙切成8cmX8cm,疊成一邊不封口的紙包，用硬鉛筆編寫順序號，按順序排列在培養(yǎng)皿中。 將盛有濾紙 包的培養(yǎng)皿移入 立C烘箱中干燥2h,取出放入干 燥器中，冷卻至室溫。按順序?qū)⒏?濾紙 包放人同一稱量瓶中稱重（記作a）、稱量時室內(nèi) 相對濕度必 須低于 。2 .包裝和干燥在上述已稱 重的濾紙包 中裝入 左右研細的樣品，封好包口，放入i2c的烘箱中干 燥3h,移至干燥器 中冷卻至室 溫。按順序號依 次放入稱量 瓶中稱重（記作b）。3 .抽提將裝有樣品的濾紙包用長鐐子放入抽提筒中，注入一次虹吸量的1.67倍的無水乙醛，使樣品包完全 浸沒在乙 醛

36、中。連接好抽提 器各部分，接通冷凝水 水流，在恒溫水浴中進行抽提，調(diào)節(jié)水溫在7080c 之間，使冷凝下滴 的乙醛成連 珠狀（120150滴/min或回流7次/h以上），抽提至抽取 筒內(nèi)的乙醛 用濾 紙點滴檢查無油跡為止（約需612h）。抽提完畢后，用長鐐子取出濾紙包，在通風處使 乙醛揮發(fā)（抽提室溫以1225c為宜）。提取瓶中的 乙醛另行回收。4 .稱重待乙醛揮發(fā) 之后，將濾紙包置 于105i2C烘箱中干燥2h,放入干燥器 冷卻至恒重為止（記作c）。五、結果與計算bc粗脂肪含量 （） =X100ba式中：a：稱量瓶加濾 紙包重（g）b：稱量瓶加濾 紙包和烘干 樣重（g）c：稱量瓶加濾 紙包和抽提

37、 后烘干殘渣 重（g）六、附注（1）測定用樣品、抽提器、抽提用有機 溶劑都需要 進行脫水處理。這是因為：第一，抽提體系中 有 水，會使樣品中 的水溶性物質(zhì)溶出，導致測定結 果偏高；第二，抽提體系中 有水，則抽提溶劑 易被水飽 和（尤其是乙醛，可飽和約 的水），從而影響抽 提效率；第三，樣品中有水 ，抽提溶劑不 易滲入細 胞組織內(nèi)部，結果不易將脂肪抽提干凈。（2）試樣粗細度 要適宜。試樣粉末過 粗，脂肪不易抽 提干凈；試樣粉末過 細，則有可能透 過濾紙 孔隙隨回流溶劑流失，影響測定結 果。（3）索氏抽提法 測定脂肪最 大的不足是耗時過長，如能將樣品 先回流12次，然后浸泡在 溶劑中 過夜，次日再

38、繼續(xù)抽提，則可明顯縮短抽提時間。（4） YG- n型油分測定 器容量大，適合于樣品 較多的選種 鑒定工作使用，溫度控制在70 c左右， 8h可提取完畢。（5）必須十分注意乙醛的安全使用。抽提室內(nèi)嚴禁有明火存在或用明火加熱。乙醛中不得含有過 氧化物，保持抽提室 內(nèi)良好通風，以防燃爆。乙醛中過氧 化物的檢查方法是：取適量乙醛，加入碘化鉀 溶液，用力搖動，放置 n,若出現(xiàn)黃色 則表明存在 過氧化物，應進行處理 后方可使用。處理的方法 是: 將乙醛放入 分液漏斗，先以1/5乙醛量的稀KOH溶液洗滌23次，以除去乙醇；然后用鹽酸 酸化，加 入1/5乙醛量的或 O3溶液，振搖，靜置，分層后棄去 下層水溶液

39、，以除去過氧 化物；最后用水洗至中性，用無水C12或無水O4脫水，并進行重蒸 儲。七、思考題1 .如何利用殘 余法測定油 料作物種子中的粗脂肪含量？2 .測定過程中為什么需要對樣品、抽提器、抽提用有機 溶劑都要進行脫水處理？3 .在實驗過程 中安全使用 乙醛應注意 哪些問題？4.測定樣品粒子粗細有什么要求?參考答案1 .殘余法測定油料作物種 子中的粗脂肪含量，是用低沸點 有機溶劑（乙醛或石油 醛）回流抽提, 除去樣品中的粗脂肪，以樣品與殘 渣重量之差，來計算粗脂 肪含量。2進行脫水處理 的原因有三 ：第一，抽提體系中有 水，會使樣品中的 水溶性物質(zhì) 溶出，導致測定結 果 偏高；第二，抽提體系中

40、有 水，則抽提溶劑易 被水飽和（ 尤其是乙醚， 可飽和約 的水） ，從而影響抽 提 效率；第三，樣品中有水， 抽提溶劑不易 滲入細胞組 織內(nèi)部，結果不易將脂 肪抽提干凈 。3抽提室內(nèi)嚴禁 有明火存在 或用明火加 熱。乙醚中不得含 有過氧化物 ，保持抽提室內(nèi) 良好通風，以防燃爆。4試樣粗細度要 適宜。試樣粉末過粗 ，脂肪不易抽提 干凈；試樣粉末過細 ，則有可能透過 濾紙孔隙 隨 回流溶劑流 失，影響測定結果 。第三節(jié) 核 酸實驗一酵母的 提制一、目的：學習和掌握從 酵母中提制 RNA 的 原 理和方法， 從而加深對核 酸性質(zhì)的認 識。二、原理：提取和制備RNA 的首 要 問題是選RNA 含量 高

41、 的材料。微生物是工業(yè) 上大量生產(chǎn) 核酸的原料 ，其中的提制以酵 母最為理想，因為酵母核 酸中主要是RNA （2.6710.0%）, DNA很少（0.030.516%）, 而且菌體容易 收集， RNA 也易 于 分離。此外，抽提后的菌體 蛋白質(zhì)（占干菌體的50%）仍具有很高的應用價值。RNA 提制 過 程首先要使 RNA 從 細 胞中釋放， 并使它和蛋白 質(zhì)分離，然后將菌體除 去。 再根據(jù)核酸在等電點時 溶解度最小的性質(zhì)，將pH調(diào)至2.02.5,使RNA沉淀，進行離心收 集。然后運用 NA不 溶于 有 機溶劑乙醇 的特性，以乙醇洗滌RNA 沉淀 。提取的 方法很多， 在工業(yè)生產(chǎn)上 常用的是稀

42、堿法和濃鹽 法。稀堿法利用細 胞壁在稀堿 條件下溶 解 ，使 RNA 釋 放 出來，這種方法提取 時間短，但RNA 在 稀 堿條件下不 穩(wěn)定，容易被堿分解 ；濃鹽法是在 加 熱的條件下 ，利用高濃度的 鹽改變細胞 膜的透性， 使 RNA 釋 放 出來，此法易掌握， 產(chǎn)品顏色較好。使用濃鹽法 提出RN時應注意掌握溫度，避免在 70c之間停留時 間過長，因為這是磷 酸二 酯酶和磷酸單酯酶作用的溫度范圍，會使因降解而降 低提取率。在90100c條件下加熱 可使蛋白質(zhì) 變 性，破壞磷酸二酯 酶和磷酸單 酯酶，有利于A 的提取。三、實驗材料、主要儀器和1 實驗材料活性干酵母；pH0.55.0的精密試 紙

43、； 冰塊。2儀器2）三角瓶（）5）電爐8）離心機（4 000r/min ）11）吸濾瓶（）3）量筒（50mL）6）試管木夾9）燒杯（, 50mL, 10mL ）12）布氏漏斗（60mm）（ 1）藥物天平（ 4）水浴鍋（ 7）離心管（ 10）滴管及玻棒（13）表面皿（8cm）;（14）烘箱； （15）干燥器；（16）紫外可見分 光光度計。3.試劑（1） NaCl （化學純）（2） 6mol/L HCl（3） 95 %乙醇（化學純）四、操作步驟1 .提取活性干酵母 粉5g,倒入 mL三角瓶中，加 5g,水 ，攪拌均勻，置于沸水浴 中提取 。2 .分離將上述提取 液取出，立即用自來 水冷卻，裝入大離

44、心 管內(nèi)，以3 500r/min離心，使提取液與 菌體殘渣等分離。3 .沉淀將離心得到 的上清液傾于燒杯中，并置于放有 冰塊的 0mL燒杯中冷卻，待冷至 C以下時，用 /L HCl小心地調(diào)節(jié) 至2.02.5。隨著pH下降，溶液中白色 沉淀逐漸增力口，到等電點時 沉 淀量最多（注意嚴格控制pH）。調(diào)好后繼續(xù)于冰水中靜置 n,使沉淀充分，顆粒變大。4 .抽濾和洗滌上述懸浮液 以3 000r/min離心 ，得到 沉淀。將沉淀物放 在 小燒杯內(nèi)，用95%的乙 醇510mL充分攪拌洗滌，然后在鋪有 已稱重濾紙的布氏漏斗上用真空泵 抽氣過濾，再用95%乙醇5 10mL淋洗3次。由于 不溶于乙醇，洗滌不僅可

45、脫水，使沉淀物疏松，便于過濾、干燥，而且可除 去可溶性的脂類及色素等雜質(zhì)，提高了制品的純度。5 .干燥從布氏漏斗 上取下有沉 淀物的濾紙，放在表面皿上，置于80c烘箱內(nèi)干燥。將干燥后的RNA制品稱重。6 .含量測定稱取一定量 干燥后的 NA產(chǎn)品配制成濃度為10的溶液，在751型分光光度計 上測定其60nm處的光密度值，按下式計算RNA含量：nmRNA溶液總體積（mL）RNA 含量（） =XX1000.024 LRNA 稱取量（）式中： nm為 m處的光密度值；L為比色杯 的光徑（cm）; 0.024為 mL溶液含有 的光密度值。五、結果計算根據(jù)含量測 定的結果按下式計算提取率：RNA 提取 率

46、（） = RNA 含量（） XRNA制品 量 M00酵母重(g)六、思考題1 . RNA提制中注意事項是什么？參考答案1 .主要注意事 項為：避開核酸酶 作用的溫度范圍2070C,防止 降解。同時在調(diào) H值時， 一定要緩慢小心，且要在低溫下進行。此外，在抽濾洗滌 時，要用乙醇洗滌，且不可用水洗，否則將導 致RNA部分溶解而造成損失，降低 提取率。附注：苯酚法提取酵母(一)原理細胞內(nèi)大部 分RNA均與蛋白質(zhì)結合在一起，以核蛋白的 形式存在。因此，提取 時要把 A 與蛋白質(zhì) 分離并除去。將細胞置于 含有十二烷 基磺酸鈉(te, SDS)的緩沖液中，加等體積水 飽和酚，通過劇裂振 蕩，然后離心形 成

47、上層水相和下層酚相。核酸溶于水 相，被苯酚變性 的蛋 白質(zhì)或者溶于酚相，或者在兩相 界面處形成 凝膠層。本實驗采用 的0.15mo/L緩沖液系統(tǒng)可使大部 分 RNA-蛋白復合物 解離，而DNA-蛋白復合物 只有極少部 分解離；用酚處理時DNA-蛋白復合物 變性，在 低溫條件 下從水相中除去，這樣得到的RNA制品中混雜的 NA極少。用氯仿-異戊醇繼續(xù) 處理 制RNA從水溶液中沉淀出來。本法得到的RNA不僅(2)水浴(4)紫外可見分 光光度計(6)振蕩器(8)真空干燥器/L乙酸鈉，用乙酸調(diào)到 pH5.0。品，可進一步除去其中少量的蛋白質(zhì)。最后用乙醇使 純度高，而且多呈自 然狀態(tài)，可供繼續(xù)研 究之用

48、。(二)主要儀器和 試劑2 .儀器(1)臺式高速離 心機(10 000r/min )(3) dof 管(1.5mL)(5)冰箱或冷柜(04C)(7)分析天平(精確至 0.1mg)3 .試劑(均為分析純)(1) SDS-緩沖?0.3% SDS, 0.1mol/L NaCl ,(2)飽和酚液：重蒸苯酚用(1)溶液飽和。(3)氯仿-異戊醇液：24 ： 1 (V/V)。(4)含2%乙酸鉀的 5%乙醇溶液。(5)無水乙醇(6)乙醛(7)溶菌酶(B.R.) (1mg/mL)(三)操作步驟1 .取1g活性干酵母在研缽中研碎，加SDS-緩沖液使成勻漿，洗入各f管(略少于管容積的一半)，加溶菌酶.1mL,混勻，

49、室溫靜置 0min,再加等體積 飽和酚液，室溫下劇烈 振蕩 n。 置冰浴中分 層，在04 c低溫環(huán)境下，10 000r/min離心 。吸出上層清 液，轉(zhuǎn)入新的 orf管, 加等體積氯 仿-異戊醇，室溫下劇烈 振蕩2.5min ,然后10 000r/min離心 n。吸出上層清 液，轉(zhuǎn)入另 一新 dorf管，加2倍體積95%乙醇（含2%乙酸鉀），在冰浴中放 置 n,使RNA沉淀。再以 10 000r/min離心5min ,棄上清液，沉淀用少許 無水乙醇和乙醛各洗一次，即加乙醇或乙醛，迅速離心 各1min,保留沉淀。傾去乙醛后，減壓真空干燥，準確稱重，記錄。RNA制品純度的測定及RNA提取率的計算與

50、濃鹽法相同。實驗二地衣酚顯色法測定 A含量一、目的學習含量的定量測定方法以及RNA快速定性檢測方法，熟悉分光光 度計使用原 理及其操作。二、原理在三氯化鐵及鹽酸存在下，RNA與，5-二羥基甲苯（地衣酚）反應，生成綠色物質(zhì)，其最大光吸收 值在 0nm處。要說明的是：地衣酚反應特異性較差，凡戊糖均可與地衣酚反應，DNA及其他雜質(zhì)也 能給出類似的顏色。因此測定 NA時，要考慮 A等雜質(zhì)影響，可先測定 NA含量，再計算出 NA 含量。三、實驗材料、主要儀器與 試劑1 .實驗材料（1） RNA標準溶液：取標準 A （預先經(jīng)定磷 法確定其純 度）配成的溶液。（2）樣品待測液：適當稀釋，使 RNA含量為50

51、/mL。2 .地衣酚試劑先稱取 0mg三氯化鐵溶于 00mL濃鹽酸中（配制0.1%濃度的溶劑）備用。在使用前加 入 g 地衣酚配 制成0.1%濃度的地衣 酚試劑。3 .主要儀器（1）分光光度計四、操作方法1 .標準 曲線的制作取12支潔凈干燥試管按下表取樣并加入試劑：2 口 呂勺RNA標準溶液（mL）H2O (mL)地衣酚試劑(mL)RNA含量（）1 , 202.52.503, 40.52.02.5505, 61.01.52.51007, 81.51.02.51509, 102.00.52.520011 , 122.502.5250充分混勻后，于沸水浴中加熱in。自來水冷卻 后，測定 70nm

52、。以RNA含量為橫坐標，nm為縱坐標，繪制標準曲線。2 .樣品的測定取樣品溶液2.5mL,加入地衣酚 試齊1J 2.5mL,如前述方法 測定 70nm ,從標準曲線 查出 含量。五、計算樣品中 A濃度(樣品測得的RNA ()2.5 (mL)實驗三三種腺昔酸 分離鑒定 醋酸纖維素 薄膜電泳法一、目的掌握醋酸纖 維素薄膜電泳法分離帶電顆粒原理；觀察核甘酸 類物質(zhì)的紫外吸收現(xiàn)象。二、原理帶電粒子在 電場中向著 與其自身帶相反電荷的電極移動的現(xiàn)象，稱為電泳?？刂齐娪緱l 件(如pH 等)，使混合試樣 中的不同組 分帶有不同的凈電荷，各組分在電 場中移動的速度或方向各不相同，從而 達到分離各組分的目的，這

53、就是電泳 分析法。以醋酸纖維 素薄膜作支持物進行電泳分析的方法稱為醋酸 纖維素薄膜 電泳法。在pH4.8電泳緩沖 液條件下，帶有不同量 磷酸基團的AMP、ADP、ATP解離之后，帶有負電荷 量 的順序為：ATP>ADP>AMP,它們在電場 中移動速度 不同，從而得到分 離。又利用核甘 酸類物質(zhì)的堿 基具有紫外吸收性質(zhì)，將分離后的電泳醋酸薄 膜放在紫外燈下，可見暗紅色 斑點，參照標準樣 品在同樣 條件下的電泳情況，對混合試樣 分離后的各 組分進行鑒 定。三、儀器與試劑3 .儀器(1)電泳儀、電泳槽(平板式)(2)紫外燈(3)電吹風、醫(yī)用鐐子(4)醋酸纖維素 薄膜(8 cmX12cm)(5)微量進樣器( 或 )4 .試劑(1)檸檬酸緩沖液(pH4.8):稱取檸檬酸8.4g,檸檬酸鈉 7.6g,溶于蒸儲水，稀釋到 00mL。(2)標準腺甘酸 溶液：用蒸儲水將 純AMP、ADP、ATP分另1J配成mg/10mL溶液。其中 需略加熱