菌種傳代與復(fù)蘇

1、菌種是從事微生物學(xué)及生命科學(xué)研究的基本材料，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，診斷制品的制備，菌苗的生產(chǎn)、微生物致病性研究，藥物的抑菌 試驗(yàn)及藥品微生物檢驗(yàn)等都有一套完整的菌種、微生物具有生命活力， 在傳代過(guò)程中易發(fā)生變異甚至死亡，因此菌種傳代與保藏是一項(xiàng)重要的基礎(chǔ)工作。菌種代號(hào)國(guó)內(nèi)藥品微生物檢驗(yàn)所用的菌種代號(hào)是CMCC(或 CMCC(B)CMCC-中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心，、，B-代表細(xì)菌，F(xiàn)代表真菌。金黃色葡萄球菌 CMCC(B)2600次腸本f菌CMCC(B)44102枯草芽 孢 桿 菌 CMCC(B)63501 白 色 念 珠 菌 CMCC(F)98001 黑 曲 霉 CMCC(F)98003傳代和接種菌種凍

2、干粉復(fù)蘇把凍干菌種管、滅菌1ml 滴管、雙碟、鑷子、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面數(shù)支，移入接種室或凈化臺(tái)。先用砂輪將凍干菌種安瓿瓶頸部挫出挫痕，再將凍干菌種管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦凈，放在滅菌雙碟內(nèi)，待干。點(diǎn)燃酒精燈，將菌種管的封口一端在火焰上燒灼紅熱，用滅菌滴管吸取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，滴在灼熱的菌種管封口一端，是驟冷而炸裂。取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口打開，放入滅菌雙碟內(nèi)，領(lǐng)取一只滅菌滴管，在火焰旁吸取營(yíng)養(yǎng)肉湯少許，加至菌種管底部，將凍干菌攪動(dòng)促使溶解，隨即吸出管內(nèi)菌液，分別接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面及普通肉湯內(nèi)，并將滴管及菌種管投入消毒液內(nèi)，將已接種的營(yíng)養(yǎng)肉湯及營(yíng)養(yǎng)瓊脂

3、斜面進(jìn)行培養(yǎng)。菌種斜面?zhèn)鞔僮髋囵B(yǎng)基應(yīng)新鮮制備，如斜面已無(wú)冷凝水者，不宜再使用。標(biāo)簽上注明菌種名及菌種編號(hào)。至冰箱取出的菌種斜面，應(yīng)在室溫放置約30 分鐘，待溫度平衡后再移入接種室或超凈工作臺(tái)。點(diǎn)燃酒精燈，用左手握住菌種斜面，將管口靠近火焰旁，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅30 秒，隨后將全部接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過(guò)3 次。左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手無(wú)名指，小指及掌部夾住棉塞，撥開棉塞，將接種環(huán)深入管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷卻再移至菌苔上，刮去少量菌苔，隨即取出接種環(huán)，并將菌種管口移至火焰旁。堵上棉塞，左手將菌種管放下，取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面一支，照上述操作打開棉塞，將接種

4、環(huán)深入管內(nèi)至瓊脂斜面的底部，由底向上，將接種環(huán)輕貼斜面的表面曲折移動(dòng)，使細(xì)菌劃在斜面的表面上。取出接種棒，在火焰旁將培養(yǎng)基管棉塞堵上，然后將接種過(guò)細(xì)菌的接種棒在火焰上燒灼滅菌。菌種的培養(yǎng)與保存大腸桿菌35-37 攝氏度培養(yǎng)48 小時(shí)金黃色葡萄球菌30-35 攝氏度培養(yǎng)48 小時(shí) 枯草芽孢桿菌30-35 攝氏度培養(yǎng)48 小時(shí)白色念珠菌23-28 攝氏度培養(yǎng)7 天 黑曲霉 23-28 攝氏度培養(yǎng)7 天將培養(yǎng)物管自培養(yǎng)箱取出后放入冰箱（2-8 攝氏度）保存，一菌懸液的制備般 2 個(gè)月轉(zhuǎn)種一次。取上述培養(yǎng)好的菌種斜面移入接種室或凈化工作臺(tái)，放置室溫后，用接種環(huán)取菌苔少許接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯中（10ml/支，

5、已滅菌），將已接種畢的細(xì)菌管置35-37 攝氏度培養(yǎng)18-24 小時(shí)， 取出備用。一般于冰箱中保存可用兩周。取上述培養(yǎng)好的營(yíng)養(yǎng)肉湯菌懸液（濃菌液）1ml,加到9ml %無(wú)菌氯化鈉溶液混勻，為 10-1 ， 再取另一只刻度吸管吸取10-1 菌液 1ml加到%無(wú)菌氯化鈉溶液中混勻，為10-2 以此類推，稀釋至含活菌數(shù)在 50-100 個(gè)。用平板計(jì)數(shù)。此稀釋菌液用于試驗(yàn)后加陽(yáng)性對(duì)照，可在一周內(nèi)使用。記錄 傳代和接種使用后，應(yīng)做好菌種傳代接種記錄。菌懸液制備后，應(yīng)做好菌液制備使用記錄。依據(jù) : 中國(guó)藥典2010年版二部及菌種使用說(shuō)明書1. 標(biāo)準(zhǔn)菌的來(lái)源標(biāo)準(zhǔn)菌株由中國(guó)藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)菌種保藏中心（

6、ChinaMedical culture collection ,CMCC ）提供的冷凍干燥菌種（0 代）或由上級(jí)藥檢部門已接種好的菌種斜面（3 代） 。黑曲霉的0 代菌種為保存于含15%甘油的%無(wú)菌氯化鈉溶液中的孢子懸液冷存管。中國(guó)藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心提供的冷凍干燥菌種的標(biāo)簽 CMC（B）代表細(xì)菌（bacteria ） ,CMCC（F代表真菌（fungi ）每種菌具有固定的代號(hào)。2. 標(biāo)準(zhǔn)菌的驗(yàn)收從菌種保藏中心購(gòu)買的原始菌種管是玻璃安瓿裝的凍干菌，接收同時(shí)應(yīng)檢查是否有隨菌種附有的相關(guān)資料。接收菌種時(shí)應(yīng)檢查安瓿的數(shù)量和名稱，和每一支安瓿的完整性。在相應(yīng)的菌種接收記錄上記

7、上所有的關(guān)于菌種的信息，如名稱、數(shù)量和接收日期等。在菌種安瓿及菌種管上粘貼標(biāo)簽，內(nèi)容包括：菌種名稱、菌種代號(hào)、代次、接收日期、接收人、貯存條件、有效期至。新購(gòu)入的0 代原始菌種儲(chǔ)存于20， 有效期為三年。從上級(jí)藥檢部門購(gòu)買的已接種好的菌種斜面（ 3代）應(yīng)檢查菌種管是否完好。儲(chǔ)存于 28 C,有效期為3個(gè)月。3. 標(biāo)準(zhǔn)菌的復(fù)蘇、復(fù)壯及標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株的制備物品及試劑：接種針、酒精燈、移液管、75%酒精及75%酒精棉球培養(yǎng)基改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基: 用于黑曲霉復(fù)蘇、復(fù)壯.液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基: 用于生孢梭菌復(fù)蘇、復(fù)壯.營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基: 用于金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、 乙型副傷寒沙門菌、短小

8、芽孢桿菌、銅綠假單胞菌復(fù)蘇、復(fù)壯。改良馬丁培養(yǎng)基: 用于白色念珠菌復(fù)蘇、復(fù)壯.操作步驟：a. 打開潔凈工作臺(tái)。b. 在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并讓其自然風(fēng)干。c. 用一小砂輪在安瓿的上部劃一條線，用手輕輕將安瓿掰開（開 啟安瓿時(shí)必須小心，因?yàn)榘碴秤鰺釙r(shí)可能會(huì)破裂）d. 以無(wú)菌方法用一無(wú)菌吸管從已準(zhǔn)備好的上述液體培養(yǎng)基中移 取ml到安甑中。e. 輕輕地旋轉(zhuǎn)安瓿以使凍干菌種和液體培養(yǎng)基充分混合并完全溶解。f. 用無(wú)菌吸管將安瓿內(nèi)菌液全部轉(zhuǎn)接到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基。g. 根據(jù)安瓿上所標(biāo)明的不同菌種類型而將其培養(yǎng)于相應(yīng)的溫度（細(xì)菌培養(yǎng)溫度3035C,培養(yǎng)1824小時(shí)；真菌培養(yǎng)溫度 2328C,培養(yǎng)3

9、5天。觀察是否渾濁，渾濁說(shuō)明菌種復(fù)蘇生長(zhǎng)；若不渾濁，細(xì)菌應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至7 天，真菌應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至14 天，若仍未渾濁，滅菌處理。h. 黑曲霉的菌懸液先室溫待菌懸液融化后用無(wú)菌吸管吸取管內(nèi)液體12滴滴在改良馬丁瓊脂斜面上，用吸管涂布均勻，置2328C培養(yǎng)57天，斜面正面為黑褐色厚絨狀，色澤均一，不應(yīng)有雜色，斜面?zhèn)让鏌o(wú)色，接近菌層培養(yǎng)基略帶黃色。確認(rèn)后用含有%（ ml/ml ）的吐溫 -80 的 %無(wú)菌氯化鈉溶液洗脫到無(wú)菌試管中。i. 取經(jīng)復(fù)蘇后的上述細(xì)菌菌液8-10ml 至液體培養(yǎng)基中按g 項(xiàng)操作對(duì)菌種進(jìn)行復(fù)壯。以無(wú)菌技術(shù)向復(fù)壯后的菌種中加入100ml20%勺無(wú)菌甘油混勻，1-2ml/ 管分

10、裝于凍存管。每個(gè)菌種制備10 支，按順序進(jìn)行編號(hào)，最后一支做為質(zhì)控管進(jìn)行質(zhì)量控制，即進(jìn)行相應(yīng)的確認(rèn)。其余作為儲(chǔ)備管。黑曲霉的h 項(xiàng)下洗脫液按h 項(xiàng)下方法進(jìn)行復(fù)壯，制成復(fù)壯后的抱子懸液20ml。以無(wú)菌技術(shù)向復(fù)壯后的菌種中加入20ml 、 30%的無(wú)菌甘油混勻，1-2ml/ 管封存于凍存管。制備10 支，按順序進(jìn)行編號(hào)，最后一支做為質(zhì)控管進(jìn)行質(zhì)量控制，即進(jìn)行相應(yīng)的確認(rèn)。其余作為儲(chǔ)備管。將上述制備好的凍存管逐支粘貼標(biāo)簽。內(nèi)容包括：菌種名稱、菌種代號(hào)、編號(hào)、代次、制備日期、制備人、貯存條件、有效期至等。j 儲(chǔ)備菌種管制備成功，儲(chǔ)存于20，有效期為三年。菌種確認(rèn)用無(wú)菌接種環(huán)從質(zhì)控管中取細(xì)菌培養(yǎng)物接種到營(yíng)

11、養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上， 或相應(yīng)的宜于該細(xì)菌生長(zhǎng)的鑒別平板上，劃線分離出單個(gè)菌落。然后在3035c下培養(yǎng)23天；同樣的方法取真菌到玫瑰紅鈉 瓊脂培養(yǎng)基平板，并在2328 c下培養(yǎng)7天；培養(yǎng)后，觀察其菌落 形態(tài)，應(yīng)符合該菌種形態(tài)特征。污染處理假如在該平板上發(fā)現(xiàn)有其他菌落生長(zhǎng)，則說(shuō)明或操作有污染或菌種不純。 將此被污染了的培養(yǎng)物滅菌處理。可尋找原因重新分離挑選純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種作為第四代。并重新制備儲(chǔ)備菌種管菌種的傳代與保藏將菌種接種至一新鮮培養(yǎng)基上，每萌發(fā)一次即稱為一代，因此，當(dāng)原始菌種復(fù)溶并轉(zhuǎn)至新培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)，即認(rèn)為已傳代一次，從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥的菌種為第0 代， 冷凍干燥的原始菌種開啟

12、后轉(zhuǎn)種后為第1 代，直到第3 代為工作菌種。菌種的傳代次數(shù)（自原始菌種凍干粉起）不得超過(guò)5 代。菌種的傳代保藏過(guò)程項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)菌的復(fù)蘇為傳第一代，復(fù)壯為第二代。傳第三代時(shí)取1 支凍存管自然解凍，將其轉(zhuǎn)接斜面菌種作為工作用菌種。此時(shí)，工作用菌種為第3 代。 工作用菌種，分為兩類：一類用于定期傳代（W3），一類用于實(shí)驗(yàn)用（S3） 。定期傳代用菌的傳代其操作步驟如下（斜面接種法）：（ 1） 從冰箱冷藏室中取出菌種斜面后，應(yīng)在室溫放置約30 分鐘。（ 2）將裝有新鮮配制的培養(yǎng)基菌種保藏管管壁上注明菌名及接種日期，和傳代菌種一并移入潔凈工作臺(tái)，打開紫外燈照射一小時(shí)。（ 3）關(guān)閉紫外燈。點(diǎn)燃酒精燈，左手握住菌

13、種斜面，將管口靠近火焰上方，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅約30 秒，隨后將接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過(guò)三次。（ 4）右手用無(wú)名指、小指及掌部夾住管塞，左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手再輕輕拔開管塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，隨即取出接種棒并將菌種管口移至火焰上方。（ 5）塞上管塞，左手將菌種管放下，取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面（或改良馬丁瓊脂斜面）一支，照上述操作打開管塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)至瓊脂斜面的底部向上劃一條直線，然后從底部向上作連續(xù)曲線劃線，一直劃到斜面頂端，使細(xì)菌接種在斜面的表面上。（ 6）取出接種環(huán)，在火焰上方將培養(yǎng)基管蓋上塞子，然后將

14、接種過(guò)細(xì)菌的接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌。（7）將已接種好的細(xì)菌管置3035 c細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng) 2224h,真菌管置2328c真菌培養(yǎng)多f最多培養(yǎng)7天。當(dāng)工作用菌種傳代代數(shù)小于5時(shí)，可直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn) 接下一代工作用菌種，如：(W3可直接車接為(W4。按上述程序操 作，直至(W4轉(zhuǎn)為(W5為止，需重新接種，舊的工作菌種進(jìn)行銷 毀。菌種培養(yǎng)條件及時(shí)間培養(yǎng)基保存條件及時(shí)間大腸埃希菌(CMCC(B)44102)3035 c 2224h營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基2c8 C保存3個(gè)月金黃色葡萄球菌(CMCC(B)26003)3035 c 2224h營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基2c8 C保存3個(gè)月枯草芽抱桿菌(CMCC(B)63501)3035 c 2224h營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基2c8 C保存3個(gè)月銅綠假單胞菌(CMCC(B)10104)3035 c 2224h營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基2c8 C保存3個(gè)月乙型副傷寒沙門菌(CMCC(B)50094)3035 C 2224h營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基2c8 C保存3個(gè)月生抱梭菌(CMCC(B)64941)3035 C 2224h營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基2c8 C保存3個(gè)月白色念珠菌(CMCC(F)98001)2328 c最多7天改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基2c8 C保存3個(gè)月黑曲霉(CMCC(F)98003)2328 c最多7改良馬丁瓊脂2c8 C保存3天培養(yǎng)基個(gè)月短小芽抱桿菌(