標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系

1、標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系PC阪應(yīng)體系與反應(yīng)條件標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：10X擴(kuò)增緩沖液10ul4種dNTP混合物各200umolL引物各10100mol模板DNA012ugTqDN臊合酶25ug2+15mmolL加雙或三蒸水至100ulPC或應(yīng)五要素：參加PC或應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTR模板和g2+引物：引物是PCR寺異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA5補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核甘酸鏈做引物，利用PCRt可將模板DNAS體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：引物長(zhǎng)度：15-30b,常用為20b左右。引物擴(kuò)增跨度：以200-

2、500b為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。引物堿基：G+若量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGCt好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的喋吟或喀咤核甘酸的成串排列。避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PC勝敗。引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量：每條引物的濃度01lu

3、mol或10100mo1,以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。酶及其濃度目前有兩種TqDN咪合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2。5U（指總反應(yīng)體積為100U1時(shí)），濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。dNTP的質(zhì)量與濃度dNTP的質(zhì)量與濃度和PCRT增效率有密切關(guān)系，dNTP#呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1NH或1Tris。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7075,小量分裝，-2

4、0C冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PC或應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200umolL,尤其是注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過(guò)低又會(huì)降低PCRT物的產(chǎn)量。dNTP能與g2+結(jié)合，使游離的g2+濃度降低。模板（靶基因）核酸模板核酸的量與Z化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA屯化方法通常采用SDS蛋白酶K來(lái)消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類(lèi)與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA吉合的組蛋白，再

5、用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PC或應(yīng)。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCRT增。RNA莫板提取一般采用異硫鼠酸月瓜或蛋白酶K法，要防止RNse降解RNAg2+濃度g2+對(duì)PCFT增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umolL時(shí)，g2+濃度為1520mmolL為宜。g2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低TqDN咪合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。PCR應(yīng)條件的選擇PC或應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。

6、溫度與時(shí)間的設(shè)置：基于PCRM理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在9095c變性，再迅速冷卻至4060C,引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至7075C,在TqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對(duì)于較短靶基因（長(zhǎng)度為100300b時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94c變性，65c左右退火與延伸（此溫度TqDNAW仍有較高的催化活性）。變性溫度與時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93c94Clmin足以使模板DNA變性，若低于93c則需延長(zhǎng)時(shí)間，但溫度不能過(guò)高，因?yàn)?/p>

7、高溫環(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCFT物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40c60C,可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。對(duì)于20個(gè)核甘酸，G+%量約50%勺引物，55C為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過(guò)以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm彳1(解鏈溫度)=4(G+C)+2(A+T)復(fù)性溫度=Tmf直-(510C)在Tm值允許圍內(nèi)，

8、選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCWE應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為3060se,足以使引物與模板之間完全結(jié)合。延伸溫度與時(shí)間：TqDNAm合酶的生物學(xué)活性：7080c150核甘酸S酶分子70C60核甘酸S酶分子55C24核甘酸S酶分子高于90c時(shí)，DNA成幾乎不能進(jìn)行。PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在7075c之間，常用溫度為72C,過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCRO申反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，一般1Kb以?xún)?nèi)的DNA段，延伸時(shí)間1min是足夠的。34kb的靶序列需34min；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出

9、現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)決定PCFT增程度。PCRf環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA勺濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在3040次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。PCR術(shù)概論聚合酶鏈反應(yīng)(PolymerseCinReion,PCR)是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍，使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測(cè)鑒定。過(guò)去幾天幾星期才能做到的事情，用PCWL小

10、時(shí)便可完成。PCR術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑。PCR術(shù)簡(jiǎn)史PCR的最早設(shè)想核酸研究已有100多年的歷史，本世紀(jì)60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)，Korn于1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)過(guò)DN儂性，與合適的引物雜交，用DNAM合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆RNA基因”。PCR的實(shí)現(xiàn)1985年美國(guó)PE-Ceus公司人類(lèi)遺傳研究室的ullis等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類(lèi)似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供以致一種合適的條件-摸板DNA寡核甘酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度

11、與時(shí)間。PCR勺改進(jìn)與完善ullis最初使用的DN媒合酶是大腸桿菌DN螺合酶的Kleno片段，其缺點(diǎn)是：Kleno酶不耐高溫，90c會(huì)變性失活，每次循環(huán)都要重新加。引物鏈延伸反應(yīng)在37c下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯(cuò)配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA段不均一。此種以Kleno酶催化的PCR術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增具備許多突出的優(yōu)點(diǎn)，但由于Kleno酶不耐熱，在DNA莫板進(jìn)行熱變性時(shí)，會(huì)導(dǎo)致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)周期，給PC叱術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PC叱術(shù)在一段時(shí)間內(nèi)沒(méi)能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視。1988年初，Keonog改用T4DNAm合酶進(jìn)行PCR其擴(kuò)增

12、的DNA段很均一，真實(shí)性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。1988年Siki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(ermusquius)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點(diǎn)：耐高溫，在70c下反應(yīng)2后其殘留活性大于原來(lái)的90%在93c下反應(yīng)2后其殘留活性是原來(lái)的60%在95c下反應(yīng)2后其殘留活性是原來(lái)的40%在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長(zhǎng)度(20Kb)。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶Kleno片段區(qū)別，將此酶命名為T(mén)qDN夠聚酶(TqDNAPoly

13、merse)。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。PC叱術(shù)基本原理PCR技術(shù)的基本原理類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴(lài)于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核甘酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA勺變性：模板DN給加熱至93c左右一定時(shí)間后，使模板DNAa鏈或經(jīng)PCRT增形成的雙鏈DNAB離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物白退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55c左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)

14、制原理，合成一條新的與模板DNA1互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。到達(dá)平臺(tái)期(Pleu)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNAT增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA擴(kuò)增量可用丫=（1+X）n計(jì)算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平（Y）均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PC

15、RT物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DN*段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長(zhǎng)期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱(chēng)平臺(tái)期數(shù)、PCRT增效率及DN咪合酶PCR的種類(lèi)和活性及非特異性產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)等因素。大多數(shù)情況下，平臺(tái)期的到來(lái)是不可避免的。PCRT增產(chǎn)物可分為長(zhǎng)產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度嚴(yán)格地限定在兩個(gè)引物鏈5端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長(zhǎng)產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個(gè)原始模板為例，在第一個(gè)反應(yīng)周期中，以?xún)蓷l互補(bǔ)的DNW模板，引物是從3端開(kāi)始延伸，其5端是固定的，3端則沒(méi)有固定的止點(diǎn)，長(zhǎng)短不一，這就是“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”。進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合

16、外，還要同新合成的鏈（即“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”）結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時(shí)，由于新鏈模板的5端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3端被固定了止點(diǎn)，保證了新片段的起點(diǎn)和止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增序列以?xún)?nèi)、形成長(zhǎng)短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計(jì)，這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測(cè)用。PC阪應(yīng)體系與反應(yīng)條件標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：10X擴(kuò)增緩沖液10ul4種dNTP混合物各200umolL引物各10100mol模板DNA012ugTqDN臊合酶25ug2+15mmolL加雙或三蒸水至100ulPC

17、即應(yīng)五要素：參加PC阪應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP模板和g2+引物：引物是PCR寺異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA5補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核甘酸鏈做引物，利用PCRt可將模板DNAS體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：引物長(zhǎng)度：15-30b,常用為20b左右。引物擴(kuò)增跨度：以200-500b為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+Ci多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGCM好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的喋吟或喀咤核甘酸的成串排列。避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避

18、免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量：每條引物的濃度01lumol或10100mo1,以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。酶及其濃度目前有兩種TqDN咪合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基

19、因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量25U（指總反應(yīng)體積為100ul時(shí)），濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。dNTP的質(zhì)量與濃度dNTP的質(zhì)量與濃度和PCRT增效率有密切關(guān)系，dNTP#呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1NH或1Tris。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7075,小量分裝，-20C冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PC或應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200umolL,尤其是注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過(guò)低又會(huì)降低PCRT物的產(chǎn)

20、量。dNTP能與g2+結(jié)合，使游離的g2+濃度降低。模板（靶基因）核酸模板核酸的量與Z化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA屯化方法通常采用SDS蛋白酶K來(lái)消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類(lèi)與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PC或應(yīng)。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCFT增。RNA莫板

21、提取一般采用異硫鼠酸月瓜或蛋白酶K法，要防止RNse降解RNAg2+濃度g2+對(duì)PCFT增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umolL時(shí)，g2+濃度為1520mmolL為宜。g2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低TqDN咪合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。PCR應(yīng)條件的選擇PC或應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。溫度與時(shí)間的設(shè)置：基于PCRM理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在9095c變性，再迅速冷卻至4060C,引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至7075C,在TqDNA聚合酶的作用下，

22、使引物鏈沿模板延伸。對(duì)于較短靶基因（長(zhǎng)度為100300b時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94c變性，65c左右退火與延伸（此溫度TqDNAW仍有較高的催化活性）。變性溫度與時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93c94Clmin足以使模板DNA變性，若低于93c則需延長(zhǎng)時(shí)間，但溫度不能過(guò)高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCFT物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。退火（復(fù)性）溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40c60C,可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物

23、復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。對(duì)于20個(gè)核甘酸，G+3量約50淵弓I物，55C為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過(guò)以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm彳1（解鏈溫度）=4（G+C）+2（A+T）復(fù)性溫度=Tmf直-（510C）在Tm值允許圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCWE應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為3060se,足以使引物與模板之間完全結(jié)合。延伸溫度與時(shí)間：TqDNAm合酶的生物學(xué)活性：7080c150核甘酸S酶分子70C60核甘酸S

24、酶分子55C24核甘酸S酶分子高于90c時(shí)，DNA合成幾乎不能進(jìn)行。PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在7075c之間，常用溫度為72C,過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCRO申反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，一般1Kb以?xún)?nèi)的DNA段，延伸時(shí)間1min是足夠的。34kb的靶序列需34min；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)決定PCFT增程度。PCRf環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA勺濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在3040次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。PCR應(yīng)特點(diǎn)特異性強(qiáng)PCR反應(yīng)的特

25、異性決定因素為:引物與模板DNA寺異正確的結(jié)合；堿基配對(duì)原則；TqDN臊合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及TqDN臊合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合（復(fù)性）可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。靈敏度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克（g=10-12g）量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克（ug=10-6g）水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的

26、檢測(cè)中，PCR勺靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU（空斑形成單位）；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。簡(jiǎn)便、快速PCR反應(yīng)用耐高溫的TqDNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在24小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。對(duì)標(biāo)本的純度要求低不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNAfi制品及總RNA勻可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制的DNA擴(kuò)增檢測(cè)。PCRT增產(chǎn)物分析PCR產(chǎn)物是否為特異性擴(kuò)增，其結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠，必須對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的分析與鑒定，才能得出正確的結(jié)論。PCRT

27、物的分析，可依據(jù)研究對(duì)象和目的不同而采用不同的分析方法。凝膠電泳分析：PCRT物電泳，EB澳乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。PCRT物片段的大小應(yīng)與預(yù)計(jì)白一致，特別是多重PCR應(yīng)用多對(duì)引物，其產(chǎn)物片斷都應(yīng)符合預(yù)訐的大小，這是起碼條件。瓊脂糖凝膠電泳：通常應(yīng)用12%勺瓊脂糖凝膠，供檢測(cè)用。聚丙烯酰胺凝膠電泳：610%丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢測(cè)分析。酶切分析：根據(jù)PCRT物中限制性?xún)?nèi)切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對(duì)靶基因分型，還能進(jìn)行變異性研究。分子雜交：分子雜交是檢測(cè)PCRT物特異性的有力

28、證據(jù)，也是檢測(cè)PCRT物堿基突變的有效方法。Souern印跡雜交：在兩引物之間另合成一條寡核甘酸鏈（內(nèi)部寡核甘酸）標(biāo)記后做探針，與PCRT物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測(cè)PCFT物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。斑點(diǎn)雜交：將PCRT物點(diǎn)在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內(nèi)部寡核甘酸探針雜交，觀察有無(wú)著色斑點(diǎn)，主要用于PCRT物特異性鑒定及變異分析。核酸序列分析：是檢測(cè)PCRT物特異性的最可靠方法。PCR常見(jiàn)題總結(jié)PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間一般為48以?xún)?nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48后帶型不規(guī)則甚致消失。假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶PC阪應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物

29、的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量及活性PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。模板：模板中含有雜蛋白質(zhì)，模板中含有Tq酶抑制劑，模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Tq酶或澳乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱(chēng)，是PC戲敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常

30、見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增，對(duì)策為：選定一個(gè)好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看D值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。g2+濃度：g2+離子濃度對(duì)PCRT增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCRF增的特異性，濃

31、度過(guò)低則影響PCRT增產(chǎn)量甚至使PCRT增失敗而不出擴(kuò)增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCRT增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul,應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對(duì)PCRT增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCRT增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。靶序列變異：如靶序列發(fā)

32、生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCRT增是不會(huì)成功的。假陽(yáng)性出現(xiàn)的PCFT增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管

33、及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PC昉法來(lái)減輕或消除。出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶PCFT增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是g2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR1環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶則不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)

34、出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93C變性，65c左右退火與延伸）。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCFT增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過(guò)高，g2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另一來(lái)源的酶。減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低g2+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。PCR污染與對(duì)策PCR反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生。污染原因（

35、一）標(biāo)本間交叉污染標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染；標(biāo)本核酸模板在提取過(guò)程中,由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染；有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。（二）PCR試劑的污染主要是由于在PCR試劑配制過(guò)程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染（三）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染這是PCR反應(yīng)中最主要最常見(jiàn)的污染題，因?yàn)镻CRT物拷貝量大（一般為1013拷貝ml）,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR僉測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCFT物污染，就可造成假陽(yáng)就可形成假陽(yáng)性。還有一種容易忽視，最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染；在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開(kāi)蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的