水稻轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)方法與步驟_第1頁
水稻轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)方法與步驟_第2頁
水稻轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)方法與步驟_第3頁
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文檔簡介

1、水稻轉(zhuǎn)基因一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? .學(xué)習(xí)水稻組織培養(yǎng)的方法2 .學(xué)習(xí)水稻轉(zhuǎn)基因的方法二、實(shí)驗(yàn)原理5cmHI(14454),GFP目的基因克隆到雙元載體中,雙元載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌,然后攜帶雙元載體的農(nóng)桿菌侵染水稻愈傷組織,通過T-DNA插入,把我們的目的基因整合到水稻染色體上。歷史:農(nóng)桿菌感染受傷的植物產(chǎn)生冠瘤瘤病,發(fā)現(xiàn)是由Ti質(zhì)粒引起,同時(shí)做雜交,發(fā)現(xiàn)只有T-DNA(transferredDNA)這一部分被整合到植物染色體上了。三、試驗(yàn)步驟:一、水稻愈傷組織的誘導(dǎo)(一)以水稻幼胚為試材誘導(dǎo)愈傷組織1 .消毒:取水稻未成熟種子(灌漿期),按以下步驟消毒:1)用自來水沖洗種子,去掉浮起的癟谷;2)將種子放入2

2、50ml無菌燒杯中(種子數(shù)量約占1/3體積),用200ml70%酒精消毒2分鐘;(在操凈工作臺上進(jìn)行無菌操作)3)加入250ml25%次氯酸鈉(NaClO)溶液,同時(shí)加數(shù)滴吐溫-20,浸泡90分鐘;4)倒去NaClO溶液,用無菌蒸儲水清洗種子4-5遍。2 .誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng):(以下步驟需無菌操作)1)用鐐子夾住種子,在無菌濾紙上用鋼鉤擠出幼胚,置入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中;2)操作完畢后封好培養(yǎng)皿(一般保鮮膜),在暗處適溫下(25-28C)培養(yǎng)5天;3)繼代培養(yǎng)。用鐐子剝下胚性愈傷組織(去掉芽及膜狀物),置入繼代培養(yǎng)基中(凸起面向上),暗處適溫下(25-28C)培養(yǎng)3天。(二)以水稻成熟胚為試材誘導(dǎo)愈傷組織

3、1 .消毒:取水稻成熟種子,人工或者機(jī)械脫殼,挑選飽滿光潔無菌斑的種子,按以下步驟消毒:1)將種子放入100ml無菌燒杯中,倒入70%酒精消毒2分鐘;2)倒去酒精,加入100ml20%次氯酸鈉(NaClO)溶液,浸泡30分鐘;3)倒去次氯酸鈉溶液,用無菌蒸儲水清洗種子4-5遍,最后一遍浸泡30分鐘。2 .誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng):(以下步驟需無菌操作)1)種子放在無菌濾紙上吸干,置入成就胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,每皿1214顆;2)操作完畢用封口膜(MicroporeTMSurgicalTape)封好培養(yǎng)皿,在28c光照培養(yǎng)箱,培養(yǎng)3周;3)在超凈工作臺上打開培養(yǎng)皿,用鐐子挑取自然分裂的胚性愈傷組織(淡黃色,致密

4、呈球狀),置入繼代培養(yǎng)基中,在28c光照培養(yǎng)箱,繼代培養(yǎng)1周。(如不馬上用,需轉(zhuǎn)移至暗處,于22c繼續(xù)培養(yǎng)1周)1、 農(nóng)桿菌培養(yǎng)挑取農(nóng)桿菌單克隆或吸取所保藏的農(nóng)桿菌菌液100M于4mlYEP(含50mg/lKan和50mg/lStr)培養(yǎng)液中,28C,250rpm振蕩培養(yǎng)20-36h至菌液OD600為0.8-1.0。2、 共培養(yǎng)和抗性愈傷組織的選擇1 .感菌與共培養(yǎng):1)取培養(yǎng)好的菌液500M于1.5ml離心管中,4C,4000rmp,離心2min,去上清。用含200umol/lAs的30mlAAM感菌液制成懸浮液,使菌液OD600的終濃度為0.01;2)將長到一定大小的水稻愈傷組織挑出,放入

5、農(nóng)桿菌懸浮液侵染5分鐘;3)將愈傷組織取出,置于無菌的濾紙上瀝干30-40分鐘;4)將愈傷組織置于共培上。25c暗培養(yǎng)2.5天。2 .選擇:1)將愈傷組織取出,用無菌水清洗5-6次,其間需不停的振蕩。再用含500mg/l頭抱拉定(或頭抱曝的鈉)的無菌水清洗12遍。最后置于無菌濾紙上瀝干2小時(shí);2)將晾干的愈傷轉(zhuǎn)入含500mg/l頭抱拉定(或頭抱曝的鈉)和50mg/l潮霉素的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行第一輪選擇,28C,光照培養(yǎng)14天;3)將長有抗性愈傷的初始愈傷轉(zhuǎn)到含500mg/l頭抱拉定(或頭抱曝的鈉)和50mg/l潮霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)彳T第二輪選擇,28C,光照培養(yǎng),直到顆粒性的抗性愈傷組織長出。3、

6、 抗性愈傷組織的預(yù)分化(可選)將新長出的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入預(yù)分化培養(yǎng)基中,25C,光照培養(yǎng)7天。4、 抗性愈傷組織的誘導(dǎo)分化和生根挑取從同一愈傷來的顏色鮮黃的抗性愈傷3-4顆,移入裝有分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿或塑料廣口瓶中(每皿或每瓶放置5-7顆),用封口膜封好,放入恒溫培養(yǎng)室中,等待分化成苗(15-30天)。待苗長至1cm左右,放入生根培養(yǎng)基中壯苗注:以上一至五的操作步驟皆在無菌條件下進(jìn)行。5、 轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽轉(zhuǎn)基因苗從分化到移栽最短時(shí)間為兩個(gè)月左右。將苗根部和莖葉分化得較完好的試管挑出(苗長至試管頂部,就要及時(shí)開蓋),打開封口膜,加入適量蒸儲水或無菌水(防止培養(yǎng)基長菌),煉苗3天至一周左右,然后洗去瓊脂,移栽到溫室的土缽中生長,檢測。四、注意事項(xiàng)1,超凈臺在用之前要紫外滅菌半個(gè)小事,使用前用酒精噴壺噴灑酒精,再用棉球擦干凈臺面2,水稻轉(zhuǎn)基因?qū)?/p>

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