2022年干細(xì)胞分裂模式和干細(xì)胞干性維持的機(jī)制研究

1、工程名稱(chēng)：干細(xì)胞分裂模式和干細(xì)胞干性維持的機(jī)制研究首席科學(xué)家：高維強(qiáng) 上海交通大學(xué)起止年限：2021.1至2021.8依托部門(mén)：教育部 上海市科委一、關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題及研究?jī)?nèi)容(一) 擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題面對(duì)我國(guó)生命醫(yī)學(xué)科學(xué)的重大需求和干細(xì)胞研究的挑戰(zhàn)，結(jié)合我們前期的研究根底，本工程擬重點(diǎn)圍繞干細(xì)胞分裂模式的發(fā)生、調(diào)控和動(dòng)態(tài)機(jī)制及其在正常和病理過(guò)程中的意義這一核心內(nèi)容，解決如下關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題：1. 以對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)分裂為新的切入點(diǎn)，研究哺乳類(lèi)組織干細(xì)胞干性維持這一重要生物學(xué)課題。2. 從機(jī)理上說(shuō)明對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)分裂、細(xì)胞周期、miRNA、蛋白質(zhì)修飾之間的關(guān)系，及其如何調(diào)控干細(xì)胞的干性維持。3. 發(fā)現(xiàn)新的

2、調(diào)控干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)分裂的關(guān)鍵分子，為臨床疾病的診治提供線(xiàn)索。(二) 主要研究?jī)?nèi)容1. 干細(xì)胞分裂模式對(duì)干細(xì)胞干性的調(diào)控機(jī)制：觀察哺乳類(lèi)上皮組織(前列腺、腦、內(nèi)耳)在發(fā)育及病變過(guò)程中的干細(xì)胞分裂模式，研究及驗(yàn)證的和新發(fā)現(xiàn)的不對(duì)稱(chēng)分裂的關(guān)鍵分子的調(diào)控機(jī)理及其作用，包括與特異信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子的關(guān)系。 2. 細(xì)胞周期調(diào)控干細(xì)胞干性的獲得及其機(jī)理：從干細(xì)胞多能性獲得與細(xì)胞周期、分裂模式之間的關(guān)系與調(diào)控機(jī)理著手，結(jié)合影響細(xì)胞分裂模式、細(xì)胞周期變化的關(guān)鍵因子研究，從干性獲得的角度逆向解讀干細(xì)胞的干性與細(xì)胞周期、分裂模式之間的關(guān)系與調(diào)控機(jī)理，并在此系統(tǒng)中研究關(guān)鍵因子通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來(lái)決定細(xì)胞命運(yùn)的可能機(jī)制

3、。3. miRNA和蛋白質(zhì)修飾在干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)分裂過(guò)程中的作用及機(jī)理：分析miRNA 302/367集群、let-7和組蛋白修飾HDAC對(duì)干細(xì)胞分裂模式調(diào)控干細(xì)胞干性獲得和維持的影響；鑒定let-7缺失、miRNA 302/367集群表達(dá)和HDAC抑制誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的特異靶信號(hào)基因；利用miRNA啟動(dòng)子報(bào)告體系驗(yàn)證新舊調(diào)控干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)不對(duì)稱(chēng)分裂的關(guān)鍵分子對(duì)干細(xì)胞干性獲得和維持的作用；利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)系統(tǒng)分析組蛋白修飾與干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)分裂的關(guān)系。4. 運(yùn)用果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)研究調(diào)控干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)分裂的新機(jī)制:篩選調(diào)控對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)分裂的新因子，利用遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)及分子生

4、物學(xué)等方法，在果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)中闡述這些新因子的作用機(jī)制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為哺乳類(lèi)干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)/不對(duì)稱(chēng)分裂機(jī)理研究提供新的研究方向及理論依據(jù)。二、預(yù)期目標(biāo)一總體目標(biāo) 瞄準(zhǔn)國(guó)家戰(zhàn)略需求和國(guó)際干細(xì)胞科學(xué)研究前沿，針對(duì)干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)分裂調(diào)控干細(xì)胞干性獲得和維持這一核心問(wèn)題，運(yùn)用哺乳類(lèi)上皮干細(xì)胞、類(lèi)器官體外重建體系、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞重編程體系和病變組織培養(yǎng)等體系和方法，系統(tǒng)研究干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)分裂、細(xì)胞周期、miRNA、蛋白質(zhì)修飾與干細(xì)胞干性維持之間的相互關(guān)系，說(shuō)明其如何通過(guò)特異的信號(hào)通路影響干細(xì)胞的干性維持，提醒干細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)分裂和細(xì)胞周期在組織發(fā)育、再生修復(fù)及病理變化過(guò)程中的作用機(jī)制；運(yùn)用果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)等模式動(dòng)物

5、，驗(yàn)證調(diào)控干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)/不對(duì)稱(chēng)分裂的關(guān)鍵分子的整體功能，并探尋新的因子，分析其在哺乳類(lèi)的同源功能和分子機(jī)制，完善和建立哺乳類(lèi)干細(xì)胞分裂模式的分子機(jī)理模型。通過(guò)本工程的實(shí)施使我國(guó)在干細(xì)胞干性維持研究的相關(guān)領(lǐng)域到達(dá)國(guó)際領(lǐng)先水平。同時(shí)，以本工程實(shí)施為契機(jī)，促進(jìn)干細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、生物化學(xué)、影像學(xué)研究的銜接和拓展，培養(yǎng)一批優(yōu)秀的穿插學(xué)科研究人才。二具體目標(biāo) 1. 以哺乳類(lèi)組織為研究對(duì)象，運(yùn)用前列腺、腦、內(nèi)耳體外培養(yǎng)系統(tǒng)，采取高分辨顯微技術(shù)，實(shí)時(shí)追蹤干細(xì)胞分裂模式，解析分裂模式與干細(xì)胞干性維持在正常發(fā)育和組織病變過(guò)程中的分子生物學(xué)作用及意義。2. 全面分析重編程整個(gè)過(guò)程中的細(xì)胞周期變化及其分

6、裂模式，并在此系統(tǒng)中研究關(guān)鍵因子通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來(lái)決定細(xì)胞命運(yùn)的機(jī)制。3. 說(shuō)明特異miRNA、蛋白質(zhì)修飾相關(guān)因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和基于果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)模式動(dòng)物中的和新發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵分子之間的相互作用關(guān)系，描繪它們調(diào)控干細(xì)胞干性維持的機(jī)制圖。4. 利用果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)模式動(dòng)物遺傳學(xué)篩選平臺(tái)，發(fā)現(xiàn)假設(shè)干新的調(diào)控干細(xì)胞分裂模式和干細(xì)胞干性維持及獲得的關(guān)鍵分子，確定與哺乳類(lèi)相應(yīng)的同源基因在前列腺、腦、內(nèi)耳組織中的作用。5. 取得具有國(guó)際影響的原創(chuàng)性成果，在國(guó)際重要學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表高水平論文 30-50篇。在Cell、Nature、Science及其系列雜志上發(fā)表3至5篇國(guó)際頂級(jí)學(xué)術(shù)論文。申請(qǐng)專(zhuān)利 10項(xiàng)。6. 培養(yǎng)國(guó)家

7、出色青年基金獲得者1-2人，培養(yǎng)一批具有國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力的優(yōu)秀中青年研究人員和后備人才，為我國(guó)干細(xì)胞分裂模式和干細(xì)胞干性維持研究的高水平、可持續(xù)開(kāi)展提供支撐。三、研究方案(一) 學(xué)術(shù)思路干細(xì)胞干性維持包括自我更新及分化潛能，與分裂模式直接相關(guān)。干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)分裂是干細(xì)胞干性維持的核心問(wèn)題，通過(guò)對(duì)稱(chēng)分裂擴(kuò)大干細(xì)胞池或分化的細(xì)胞數(shù)目，通過(guò)不對(duì)稱(chēng)分裂維持干細(xì)胞數(shù)量及干性，同時(shí)產(chǎn)生分化的子細(xì)胞。干細(xì)胞分裂模式的異常往往導(dǎo)致許多臨床疾病，特別是上皮組織疾病，包括腫瘤等。但是，目前對(duì)干細(xì)胞的對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)分裂與這些疾病發(fā)生開(kāi)展之間的作用機(jī)制知之甚少。因此，哺乳類(lèi)干細(xì)胞分裂模式的研究對(duì)提醒上皮組織發(fā)育及病變的新

8、機(jī)理和有效地防治相關(guān)疾病具有重要的科學(xué)指導(dǎo)意義。干細(xì)胞分裂模式的調(diào)控涉及多方面的因素，尤其是細(xì)胞周期因子、miRNA、蛋白質(zhì)修飾、特異信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)等。這些因素不僅直接調(diào)控干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)不對(duì)稱(chēng)分裂這一過(guò)程，而且與干細(xì)胞的功能有關(guān)。因此探討這些因素之間的相互關(guān)系，并提醒它們?nèi)绾握{(diào)控干細(xì)胞干性維持，是干細(xì)胞研究的重要方向?；谝陨纤悸?，我們一方面將利用哺乳類(lèi)上皮干細(xì)胞、類(lèi)器官體外培養(yǎng)體系和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞體系，研究干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)不對(duì)稱(chēng)分裂模式，細(xì)胞周期信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞重編程過(guò)程、miRNA功能、蛋白質(zhì)修飾和干細(xì)胞干性之間的相互作用機(jī)理；另一方面，利用直觀、高效、快捷的果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)遺傳篩選體系以及這些模式動(dòng)物先

9、期工作中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的一些調(diào)控干細(xì)胞分裂模式的重要因子，探索其在哺乳類(lèi)干細(xì)胞干性維持中的同源功能及特異性，提醒調(diào)控干細(xì)胞分裂模式及干性維持的新機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)?？傮w思路圖(二) 技術(shù)途徑根據(jù)如上總體學(xué)術(shù)思路，設(shè)立本工程的總體研究技術(shù)途徑?？傮w上，本工程將運(yùn)用多種哺乳類(lèi)上皮組織體外干細(xì)胞培養(yǎng)體系，研究干細(xì)胞分裂模式對(duì)干細(xì)胞干性維持的作用及其機(jī)制。以此為主軸，同時(shí)展開(kāi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期、細(xì)胞重編程、miRNA、蛋白質(zhì)修飾、以及果蠅線(xiàn)蟲(chóng)模式動(dòng)物的研究，多管齊下，系統(tǒng)地探討干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)不對(duì)稱(chēng)分裂和干細(xì)胞干性維持以及在細(xì)胞重編程中干細(xì)胞干性獲得的機(jī)制。利用果蠅及線(xiàn)蟲(chóng)遺傳學(xué)方法，篩選調(diào)控干細(xì)胞不

10、對(duì)稱(chēng)分裂的新關(guān)鍵分子，研究它們?cè)诓溉轭?lèi)上皮組織病變腫瘤發(fā)生開(kāi)展過(guò)程中可能的作用機(jī)制。具體如下： 課題一利用獨(dú)創(chuàng)的干細(xì)胞標(biāo)記物別離純化干細(xì)胞或特異的轉(zhuǎn)基因熒光報(bào)告蛋白，在體外三維膠原蛋白培養(yǎng)體系、組織切片或活體胚胎中直觀地、實(shí)時(shí)地追蹤干細(xì)胞的分裂模式及分化過(guò)程。從特異信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)這一角度，進(jìn)展干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)分裂如何影響哺乳類(lèi)干細(xì)胞干性維持的機(jī)制研究。說(shuō)明在上皮組織再生修復(fù)及病理變化包括癌變過(guò)程中干細(xì)胞分裂模式和干細(xì)胞干性維持的作用及機(jī)理。       課題二利用實(shí)時(shí)熒光成像、熒光標(biāo)記、基因芯片等技術(shù)，實(shí)時(shí)全方位地觀測(cè)重編程過(guò)程的細(xì)胞

11、周期變化與干性獲得之間的關(guān)系，并明確這一過(guò)程中的細(xì)胞分裂模式；同時(shí)還為其他課題提供成熟的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)，用于逆向驗(yàn)證分裂模式、細(xì)胞周期關(guān)鍵基因的功能。 課題三運(yùn)用標(biāo)記熒光蛋白實(shí)時(shí)示蹤成像技術(shù)觀察miRNA 302/367集群/let-7誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分裂模式, 探討miRNA與干細(xì)胞干性獲得和維持的相關(guān)性。采用免疫沉淀Argonaute- RISCs-基因芯片技術(shù)鑒定miRNA 302/367集群/let-7特異的靶信號(hào)基因。利用HDAC1和HDAC2敲除小鼠細(xì)胞，說(shuō)明HDACs與干細(xì)胞干性獲得和維持的分子機(jī)制。建立特異的miRNA啟動(dòng)子報(bào)告體系，研究其與信號(hào)通路分子、干細(xì)胞標(biāo)記及轉(zhuǎn)錄

12、因子的作用關(guān)系。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)系統(tǒng)分析干細(xì)胞分化前后、對(duì)稱(chēng)/不對(duì)稱(chēng)分裂之間、及HDACs敲除小鼠細(xì)胞組蛋白以及其它蛋白質(zhì)修飾，尤其是乙?；淖兓?，為探明蛋白質(zhì)修飾調(diào)控干細(xì)胞分裂模式提供依據(jù)。 課題四利用激光共聚焦顯微鏡，結(jié)合抗體制備和免疫熒光技術(shù)，觀察參與不對(duì)稱(chēng)分裂的蛋白亞細(xì)胞定位。采用高分辨率活體顯微成像技術(shù)，追蹤GFP標(biāo)記的相關(guān)蛋白在不對(duì)稱(chēng)分裂過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化。通過(guò)二次親和純化技術(shù)和質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)調(diào)控干細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)分裂的新因子。利用果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)遺傳學(xué)手段如RNAi、EMS誘變或P因子發(fā)現(xiàn)調(diào)控干細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)分裂的新基因。(三) 創(chuàng)新與特色 目前對(duì)干細(xì)胞分裂模式的認(rèn)識(shí)主要來(lái)自于果蠅和線(xiàn)

13、蟲(chóng)，哺乳類(lèi)干細(xì)胞分裂模式的調(diào)控機(jī)理非常復(fù)雜，許多方面尚屬空白，有待于研究。本研究工程具有以下創(chuàng)新和特色：1. 哺乳類(lèi)上皮組織與腫瘤病變密切相關(guān)，研究哺乳類(lèi)上皮，尤其是非腦組織上皮的干細(xì)胞分裂模式研究是一大創(chuàng)新。2. 首次利用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系統(tǒng)逆向研究細(xì)胞周期、分裂模式相關(guān)因子與細(xì)胞干性獲得之間的關(guān)系。3. 利用干細(xì)胞標(biāo)記物別離純化干細(xì)胞，首次在體外三維上皮單位/類(lèi)器官organoid的形成體系中直觀地追蹤干細(xì)胞的分裂模式及分化過(guò)程尚無(wú)報(bào)導(dǎo)。4. 在活體示蹤方面，將雙光子、近紅外等最新的熒光影像技術(shù)用于實(shí)時(shí)、無(wú)損地觀察哺乳類(lèi)上皮干細(xì)胞的對(duì)稱(chēng)與不對(duì)稱(chēng)分裂過(guò)程；并將最新的超高分辨影像技術(shù)STORM在

14、亞細(xì)胞層面記錄干細(xì)胞的對(duì)稱(chēng)與不對(duì)稱(chēng)分裂的精細(xì)變化。 5. 填補(bǔ)腫瘤的發(fā)生開(kāi)展和干細(xì)胞的分裂模式之間的關(guān)系的研究空白。6. 首次研究特異miRNA 302/367集群調(diào)控重編程過(guò)程中細(xì)胞分裂模式，說(shuō)明其在干細(xì)胞干性獲得和維持中的分子機(jī)制。7. 利用組蛋白去乙酰化酶HDAC敲除小鼠，首次研究抑制HDAC如何影響細(xì)胞分裂模式提高miRNA重編程效率的新機(jī)制。8. 利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)系統(tǒng)分析HDACs敲除小鼠細(xì)胞組蛋白以及其它蛋白質(zhì)修飾，尤其是乙?；淖兓?。9. 利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)系統(tǒng)分析干細(xì)胞分化前后組蛋白修飾的變化，為探明蛋白質(zhì)修飾調(diào)控干細(xì)胞干性維持的機(jī)制提供依據(jù)。10. 從果

15、蠅和線(xiàn)蟲(chóng)中篩選新基因，對(duì)其進(jìn)展蛋白定位和功能分析，并發(fā)現(xiàn)新的結(jié)合蛋白，研究其同源蛋白在哺乳類(lèi)干細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)分裂過(guò)程中的功能及調(diào)控機(jī)制。11. 獨(dú)創(chuàng)線(xiàn)蟲(chóng)胚胎后期高分辨顯微成像技術(shù)，活體觀察細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)分裂，結(jié)合突變體分析，提醒干細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)分化機(jī)制。12. 首次整合果蠅、線(xiàn)蟲(chóng)和哺乳類(lèi)各體系的優(yōu)勢(shì)，對(duì)干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)/不對(duì)稱(chēng)分裂調(diào)控機(jī)制進(jìn)展深入系統(tǒng)地研究。四可行性分析1. 理論上可行 近年來(lái)在干細(xì)胞干性維持和分裂模式研究方面, 特別是在模式動(dòng)物果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)干細(xì)胞分裂模式研究中取得了很大的進(jìn)展，已經(jīng)形成了初步的機(jī)理模型，為理解哺乳類(lèi)干細(xì)胞分裂模式提供了理論框架和概念根底。國(guó)際上關(guān)于哺乳類(lèi)上皮干細(xì)胞分裂模式的研究已

16、經(jīng)開(kāi)場(chǎng)有相關(guān)報(bào)道，正在成為干細(xì)胞和發(fā)育生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)關(guān)于對(duì)稱(chēng)/不對(duì)稱(chēng)分裂模式對(duì)干細(xì)胞的干性維持的研究仍然處于起步階段，本工程整合哺乳類(lèi)、果蠅、線(xiàn)蟲(chóng)體系的各自?xún)?yōu)勢(shì)，并結(jié)合在細(xì)胞周期、miRNA、蛋白質(zhì)修飾、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面研究的先進(jìn)技術(shù)，為在干細(xì)胞干性維持和分裂模式研究領(lǐng)域取得重大突破奠定根底。2. 課題組能力和條件可行 本工程的科研隊(duì)伍以從事干細(xì)胞科學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物影像學(xué)、分子生物學(xué)研究的“985工程國(guó)家重點(diǎn)大學(xué)和中國(guó)科學(xué)院為主體，集中了目前上海、浙江、廣東、北京、四川地區(qū)從事干細(xì)胞研究的優(yōu)勢(shì)科研團(tuán)隊(duì)。其中，課題負(fù)責(zé)人高維強(qiáng)教授和重要骨干楊小杭教授為國(guó)家中央組織部

17、“千人方案入選專(zhuān)家。其他課題組組長(zhǎng)和主要骨干成員均有在國(guó)內(nèi)外長(zhǎng)期從事科研的經(jīng)歷，在相關(guān)領(lǐng)域已經(jīng)取得顯著成績(jī)。參加本工程研究的各實(shí)驗(yàn)室已具備良好的研究條件。3. 有很好的工作根底在過(guò)去的研究工作中，本工程組成員一直瞄準(zhǔn)于干細(xì)胞領(lǐng)域的國(guó)際開(kāi)展前沿，在干細(xì)胞分裂模式、細(xì)胞重編程、miRNA、干細(xì)胞別離純化、干細(xì)胞標(biāo)記物的鑒定、組織修復(fù)重建及腫瘤發(fā)生開(kāi)展等等方面均有良好的根底和積累。主要表達(dá)在以下幾個(gè)方面：1) 本工程組已經(jīng)利用單個(gè)干細(xì)胞，成功實(shí)現(xiàn)前列腺重建。在內(nèi)耳毛細(xì)胞再生研究方面，在國(guó)際上第一個(gè)發(fā)現(xiàn)內(nèi)耳上皮干細(xì)胞的定位并可在體外成功誘導(dǎo)其分化為內(nèi)耳毛細(xì)胞。此外，利用胚胎大鼠腦組織切片培養(yǎng)技術(shù)，已成

18、功地實(shí)時(shí)紀(jì)錄神經(jīng)干細(xì)胞的不對(duì)稱(chēng)細(xì)胞分裂。2) 在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)研究方面，本工程組成員首次發(fā)現(xiàn)Vc能夠極大提高重編程效率，被選為封面文章發(fā)表于Cell Stem Cell；在重編程機(jī)理研究方面首次發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞重編程過(guò)程中存在間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化MET過(guò)程，并發(fā)表在Cell Stem Cell上。3) 本工程組成員發(fā)現(xiàn)特異轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)控制肺上皮祖細(xì)胞增殖和分化，調(diào)控肺發(fā)育和損傷后氣道再生修復(fù)，論文和評(píng)論在Nat Genet網(wǎng)站上登出獲得了廣泛的關(guān)注。首次發(fā)現(xiàn)miR302/367集群在成纖維細(xì)胞高表達(dá)和HDAC抑制可有效地重編程人和鼠體細(xì)胞成為多能性干細(xì)胞，其特征為表達(dá)多能干細(xì)胞標(biāo)記基

19、因、形成畸胎瘤和高效生成高比例生殖系嵌合體的小鼠，已被Cell Stem Cell承受為封面故事。4) 本工程組成員首次在果蠅中發(fā)現(xiàn)并鑒定了Pins及Gi在神經(jīng)干細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)分裂中的功能，并發(fā)現(xiàn)紡錘體不對(duì)稱(chēng)幾何形態(tài)受到富集在神經(jīng)干細(xì)胞上部的兩個(gè)且功能互補(bǔ)的蛋白復(fù)合體調(diào)控。另外，還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Snail家族蛋白亦參與不對(duì)稱(chēng)分裂的調(diào)控。這些關(guān)于干細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)分裂分化調(diào)控的一系列重要成果屢次發(fā)表在Cell、Genes & Dev、EMBO J等刊物上。5) 在線(xiàn)蟲(chóng)細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)分裂研究領(lǐng)域，本工程組成員首次發(fā)現(xiàn)了一種新分子能夠調(diào)節(jié)微管切割蛋白katanin的表達(dá)水平，進(jìn)而說(shuō)明了調(diào)控胚胎不對(duì)稱(chēng)細(xì)胞分裂

20、的新機(jī)制，成果發(fā)表在Journal of Cell Biology上。這些工作根底將為這一工程研究提供豐富的實(shí)驗(yàn)體系與獨(dú)特的實(shí)驗(yàn)手段。五課題設(shè)置根據(jù)總體研究目標(biāo)和研究?jī)?nèi)容，本工程擬以干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)與不對(duì)稱(chēng)分裂和干細(xì)胞的干性維持為核心，以哺乳類(lèi)上皮干細(xì)胞為突破點(diǎn)，將工程分解為各有側(cè)重，但又互相聯(lián)系、互相促進(jìn)的四個(gè)課題見(jiàn)總體思路圖，從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期、miRNA和蛋白質(zhì)修飾、果蠅線(xiàn)蟲(chóng)遺傳學(xué)等方面有機(jī)結(jié)合地、深入系統(tǒng)地探索干細(xì)胞分裂模式在干細(xì)胞干性維持中的作用及其機(jī)制。從各課題研究所利用的不同體系和所側(cè)重的不同角度來(lái)看，課題一著重應(yīng)用哺乳類(lèi)上皮干細(xì)胞中干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)與不對(duì)稱(chēng)分裂和干細(xì)胞干性維持研究體系，系

21、統(tǒng)研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在其中的參與及作用；課題二研究細(xì)胞周期相關(guān)因子對(duì)干細(xì)胞干性獲得和維持的作用及其機(jī)理；課題三從miRNA和蛋白質(zhì)修飾的角度研究其在干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)分裂過(guò)程中的精細(xì)調(diào)控；課題四運(yùn)用果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)模型，發(fā)現(xiàn)新的決定干細(xì)胞分裂模式的關(guān)鍵分子，為創(chuàng)新藥物的研發(fā)提供靶標(biāo)。從各課題間的有機(jī)聯(lián)系及與工程預(yù)期目標(biāo)的關(guān)系來(lái)看：課題一聚焦哺乳類(lèi)上皮干細(xì)胞，為干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)與不對(duì)稱(chēng)分裂和干細(xì)胞干性維持的研究提供了一個(gè)重要的獨(dú)特體系。 課題二中影響細(xì)胞周期的因子、課題三中的miRNA和蛋白質(zhì)修飾以及課題四果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)中新發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵分子的作用都將可以在這一系統(tǒng)中進(jìn)展驗(yàn)證。課題二利用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系統(tǒng)研究細(xì)胞周期改變

22、與干性獲得的關(guān)系，說(shuō)明這一過(guò)程中的細(xì)胞分裂模式，并為其它課題包括模式動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵因子從逆向的角度進(jìn)展驗(yàn)證，同時(shí)在這一系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的新的關(guān)鍵因子可在其它系統(tǒng)中進(jìn)展研究。課題三分析特異miRNA及蛋白質(zhì)修飾調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂模式誘導(dǎo)維持重編程多能干細(xì)胞干性的分子機(jī)制，并研究在病變情況下miRNA及蛋白質(zhì)修飾對(duì)干細(xì)胞分裂方式與干性的作用，與課題一密切相關(guān)。同時(shí)miRNA調(diào)控細(xì)胞分裂模式及其特異靶點(diǎn)，如細(xì)胞周期調(diào)控信號(hào)分子、細(xì)胞凋亡調(diào)控信號(hào)分子和染色體重塑分子等，與課題二嚴(yán)密聯(lián)系。此外，這些特異miRNA及蛋白質(zhì)修飾分子與課題四發(fā)現(xiàn)的調(diào)控干細(xì)胞分裂模式的分子也可互為進(jìn)一步研究的切入點(diǎn)。課題四的研究利用模式

23、動(dòng)物果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)直觀、高效、快捷的實(shí)驗(yàn)手段和技術(shù)，尋找參與調(diào)控對(duì)稱(chēng)/不對(duì)稱(chēng)分裂模式的新基因，并明確其在模式動(dòng)物中的功能和分子機(jī)理。本課題可為課題一、二、三提供新的研究思路和整體動(dòng)物水平的驗(yàn)證平臺(tái)，并創(chuàng)新性地說(shuō)明哺乳類(lèi)干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)與不對(duì)稱(chēng)分裂和干細(xì)胞干性維持的作用機(jī)制。各課題具體設(shè)置如下：課題一：干細(xì)胞分裂模式對(duì)干細(xì)胞干性的調(diào)控機(jī)制。研究目標(biāo)：說(shuō)明哺乳類(lèi)干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)分裂和不對(duì)稱(chēng)分裂、特異信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)與干細(xì)胞干性維持之間的相互關(guān)系。提醒干細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)分裂在組織發(fā)育、再生修復(fù)及病理變化過(guò)程中的作用機(jī)制。驗(yàn)證新的調(diào)控干細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)分裂的關(guān)鍵分子如何通過(guò)特異的信號(hào)通路影響干細(xì)胞的干性維持及其在臨床的應(yīng)用潛能。研究

24、內(nèi)容：1. 干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)與不對(duì)稱(chēng)分裂在哺乳類(lèi)組織正常發(fā)育過(guò)程中的研究。在哺乳類(lèi)上皮組織(前列腺、腦、內(nèi)耳)正常發(fā)育過(guò)程中，利用干細(xì)胞的標(biāo)記物、中心體和紡錘體的標(biāo)記物、以及的在果蠅或線(xiàn)蟲(chóng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的與對(duì)稱(chēng)與不對(duì)稱(chēng)分裂相關(guān)的標(biāo)記物，采用實(shí)時(shí)光學(xué)影像、熒光標(biāo)記、雙光子/近紅外/多光譜及高分辨率熒光顯微影像等技術(shù)和免疫組化，根據(jù)紡錘體的方向、干細(xì)胞分裂的位置細(xì)胞核上下振蕩行為、分裂板的夾角垂直、水平以及介于中間、子細(xì)胞位置大小及形態(tài)上的差異、特異分子在細(xì)胞質(zhì)中的不對(duì)稱(chēng)分布等指標(biāo)，觀察上皮干細(xì)胞在體外三維類(lèi)器官形成過(guò)程中或培養(yǎng)的組織切片或活體胚胎中干細(xì)胞的分裂模式和干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)與不對(duì)稱(chēng)分裂的比例。A. 實(shí)時(shí)

25、追蹤體外經(jīng)純化、別離、三維培養(yǎng)的干細(xì)胞形成類(lèi)器官Organoid的過(guò)程。B. 利用特異的轉(zhuǎn)基因熒光報(bào)告蛋白，實(shí)時(shí)追蹤培養(yǎng)的組織切片或活體胚胎中干細(xì)胞的分裂分化過(guò)程。C. 利用免疫組織化學(xué)技術(shù)，在不同的發(fā)育點(diǎn)，觀察體內(nèi)特定微環(huán)境下的干細(xì)胞分裂模式及分化過(guò)程。 2. 從特異信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)這一角度，進(jìn)展干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)分裂如何影響哺乳類(lèi)干細(xì)胞干性維持的機(jī)制研究。A. 研究Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)及其相關(guān)的分子與哺乳類(lèi)干細(xì)胞分裂模式及干細(xì)胞干性維持的關(guān)系，包括Numb、Hes、Atoh1等。B. 研究Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)與哺乳類(lèi)干細(xì)胞分裂模式及干細(xì)胞干性維持的關(guān)系，包括beta-catenin、Wnt5a

26、、Frizzled、Axin2等。C. 研究Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)與哺乳類(lèi)干細(xì)胞分裂模式及干細(xì)胞干性維持的關(guān)系，包括Shh、Patched、Gli1等。3. 進(jìn)一步深入系統(tǒng)地研究哺乳類(lèi)干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)分裂的分子機(jī)制。A. 上皮干細(xì)胞干性因子Bmi、Nanog等及外表標(biāo)志分子CD117、CD133等及對(duì)上皮干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)分裂的影響。B. 采用宮體胚胎電轉(zhuǎn)導(dǎo)和RNAi技術(shù)，研究快速基因干擾相關(guān)中心體蛋白基因CP110、CDK5RAP2等對(duì)神經(jīng)上皮干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)分裂的影響。C. 利用課題二中獲得的細(xì)胞周期相關(guān)因子，研究其和哺乳類(lèi)干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)分裂的關(guān)系及在上皮組織發(fā)育中的作用。D. 利用課

27、題三中miRNA和蛋白質(zhì)修飾，研究其和哺乳類(lèi)干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)分裂的關(guān)系及在上皮組織發(fā)育中的作用。E. 利用課題四中果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)里的及新發(fā)現(xiàn)的調(diào)控干細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)分裂及其干性的分子，研究其和哺乳類(lèi)干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)分裂的關(guān)系及在上皮組織發(fā)育中的作用。F. 探索以上這些因子和特異信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上下游關(guān)系，及其在哺乳類(lèi)上皮干細(xì)胞干性維持中的作用。4. 研究在上皮組織再生修復(fù)及病理變化包括癌變過(guò)程中干細(xì)胞分裂模式和干細(xì)胞干性維持的作用及機(jī)理。A. 利用免疫組織化學(xué)技術(shù)，在組織再生修復(fù)、重建過(guò)程中不同的時(shí)間點(diǎn)，觀察體內(nèi)特定微環(huán)境下的干細(xì)胞分裂模式及分化過(guò)程。B. 采用干細(xì)胞標(biāo)記物CD133、CD177、CD

28、44等，從腫瘤組織中純化、別離、三維培養(yǎng)干細(xì)胞，觀察其克隆及細(xì)胞球形成及在體成瘤過(guò)程中干細(xì)胞的分裂模式及分化過(guò)程。C. 探索課題二、三、四中有潛力的關(guān)鍵靶標(biāo)因子對(duì)上皮組織再生修復(fù)及病理變化包括癌變可能的臨床應(yīng)用。承當(dāng)單位：上海交通大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院生物物理所課題負(fù)責(zé)人：高維強(qiáng)，教授，上海交通大學(xué)學(xué)術(shù)骨干：魏勛斌、王曉群、楊茹 預(yù)算經(jīng)費(fèi)：28課題二：細(xì)胞周期調(diào)控干細(xì)胞干性的獲得及其機(jī)理研究目標(biāo)：從干細(xì)胞多能性獲得與細(xì)胞周期、分裂模式之間的關(guān)系與調(diào)控機(jī)理著手，結(jié)合影響細(xì)胞分裂模式、細(xì)胞周期變化的關(guān)鍵因子研究，從干性獲得的角度逆向解讀干細(xì)胞的干性與細(xì)胞周期、分裂模式之間的關(guān)系與調(diào)控機(jī)理，力爭(zhēng)取得新的突

29、破。研究?jī)?nèi)容： 1. 研究細(xì)胞重編程過(guò)程中的細(xì)胞分裂模式。A. 利用小鼠成纖維細(xì)胞高效快速重編程體系，結(jié)合熒光標(biāo)記和實(shí)時(shí)觀測(cè)顯微技術(shù)，研究細(xì)胞重編程過(guò)程中的細(xì)胞分裂模式。B. 利用基因芯片等技術(shù)，檢測(cè)現(xiàn)有重編程過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞分裂模式關(guān)鍵基因PAR蛋白等表達(dá)變化。C. 根據(jù)實(shí)時(shí)觀測(cè)和基因芯片表達(dá)分析結(jié)果，研究影響分裂模式的關(guān)鍵基因與Oct4等重編程因子之間的關(guān)系。2. 全面分析重編程過(guò)程中細(xì)胞周期的變化與iPS細(xì)胞干性獲得之間的關(guān)系。A. 利用小鼠成纖維細(xì)胞高效快速重編程體系，結(jié)合熒光標(biāo)記和實(shí)時(shí)觀測(cè)顯微技術(shù)，研究細(xì)胞重編程過(guò)程中的細(xì)胞周期變化。B. 利用基因芯片等技術(shù)，結(jié)合前期結(jié)果中發(fā)現(xiàn)

30、Vc可以提高重編程效率，檢測(cè)不同條件重編程過(guò)程中，不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞周期關(guān)鍵基因(Cyclins、CDKs、p27等)表達(dá)變化。C. 根據(jù)實(shí)時(shí)觀測(cè)和基因芯片表達(dá)分析結(jié)果，研究影響細(xì)胞周期的關(guān)鍵基因與Oct4等重編程因子見(jiàn)關(guān)系。3. 利用iPS系統(tǒng)研究細(xì)胞周期、分裂模式關(guān)鍵因子，系統(tǒng)研究Numb等關(guān)鍵因子通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來(lái)決定細(xì)胞命運(yùn)的可能機(jī)制。A. 結(jié)合前期研究結(jié)果，研究Numb基因在細(xì)胞重編程過(guò)程中的表達(dá)變化，并研究其與重編程因子Oct4之間的關(guān)系。B. 研究果蠅、線(xiàn)蟲(chóng)模型中發(fā)現(xiàn)的分裂模式、細(xì)胞周期關(guān)鍵因子在細(xì)胞重編程過(guò)程中對(duì)細(xì)胞干性獲得的影響及作用機(jī)制。C. 研究Numb在iPS細(xì)胞分化過(guò)程

31、中調(diào)節(jié)不對(duì)稱(chēng)分裂的作用。D. 在細(xì)胞重編程系統(tǒng)中，研究細(xì)胞分裂模式、細(xì)胞周期關(guān)鍵因子與重編程因子Oct4、Sox2、Klf4等協(xié)同作用之間的關(guān)系和作用機(jī)理。承當(dāng)單位：中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與安康研究院、四川大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：蘇煥興，副研究員，中國(guó)科學(xué)院生物醫(yī)藥與安康研究院學(xué)術(shù)骨干：Miguel A Esteban、李紅昌 預(yù)算經(jīng)費(fèi)：24課題三：miRNA和蛋白質(zhì)修飾在干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)/不對(duì)稱(chēng)分裂過(guò)程中的作用及機(jī)理研究目標(biāo)：我們的近期工作發(fā)現(xiàn)miRNA和蛋白質(zhì)修飾可導(dǎo)致細(xì)胞重編程Cell Stem Cell, in press，本課題將深入研究miRNA和蛋白質(zhì)修飾是否通過(guò)調(diào)控干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)不對(duì)稱(chēng)分裂從而影

32、響干細(xì)胞干性的獲得和維持，闡述miRNA和蛋白質(zhì)修飾與細(xì)胞周期及特異信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之間的相互作用關(guān)系，探索miRNA和蛋白質(zhì)修飾與在果蠅及線(xiàn)蟲(chóng)模式動(dòng)物中的和新發(fā)現(xiàn)的調(diào)控干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)不對(duì)稱(chēng)分裂的關(guān)鍵分子的上下游關(guān)系，使我們得以全面系統(tǒng)地理解干細(xì)胞干性維持及獲得的機(jī)理。研究?jī)?nèi)容：1. 明確特異miRNA和蛋白質(zhì)修飾尤其是組蛋白修飾是否通過(guò)調(diào)控干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)不對(duì)稱(chēng)分裂影響干細(xì)胞干性的獲得和維持。A. 在miRNA 302/367集群/let-7誘導(dǎo)多能干細(xì)胞過(guò)程中，觀察重編程的干細(xì)胞分裂模式。B. 分析組蛋白修飾HDACs調(diào)控的重編程過(guò)程中干細(xì)胞的分裂模式。C. 確定HDAC1和HDAC2缺陷的ES 細(xì)胞中

33、對(duì)稱(chēng)不對(duì)稱(chēng)分裂的比例及其與干性維持的相關(guān)性。2研究miRNA和蛋白質(zhì)修飾與轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞周期及特異信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之間的相互作用關(guān)系。A. 采用免疫沉淀Argonaute-RISCs-基因芯片技術(shù)鑒定miRNA 302/367集群/let-7下游靶信號(hào)基因是否涉及干細(xì)胞核心轉(zhuǎn)錄因子、Wnt、Notch、FGF、TGFb等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞周期調(diào)控信號(hào)分子、細(xì)胞凋亡調(diào)控信號(hào)分子和染色質(zhì)重塑分子等，證實(shí)miRNA 302/367/let-7可影響這些信號(hào)分子，調(diào)控細(xì)胞分裂模式，獲得并維持干細(xì)胞干性。B. 研究組蛋白修飾，尤其是組蛋白去乙?；窰DACs修飾，是否通過(guò)特異信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)及細(xì)胞周期的關(guān)鍵因子

34、調(diào)控干細(xì)胞分裂模式和干性獲得和維持。C. 在HDAC1和HDAC2缺陷的ES細(xì)胞中，觀察特異的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)或影響細(xì)胞周期的關(guān)鍵因子是否缺失。3. 探索miRNA和蛋白質(zhì)修飾與從果蠅及線(xiàn)蟲(chóng)模式動(dòng)物中的和新發(fā)現(xiàn)的調(diào)控干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)不對(duì)稱(chēng)分裂的關(guān)鍵分子的相互作用關(guān)系。A. 建立特異的miRNA啟動(dòng)子報(bào)告體系，研究其與的如PAR-aPKC蛋白復(fù)合物PAR蛋白等、Notch、Wnt 信號(hào)通路分子以及干細(xì)胞標(biāo)記CD133, CD117和轉(zhuǎn)錄因子Gata6等的作用關(guān)系。B. 研究組蛋白修飾，尤其是組蛋白去乙?；窰DACs修飾，與的調(diào)控干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)不對(duì)稱(chēng)分裂的關(guān)鍵分子的哺乳類(lèi)同源分子的作用關(guān)系。C. 用以上方法，

35、探討miRNA和蛋白質(zhì)修飾與從果蠅及線(xiàn)蟲(chóng)模式動(dòng)物中新發(fā)現(xiàn)的調(diào)控干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)不對(duì)稱(chēng)分裂的關(guān)鍵分子的作用機(jī)制。4. 利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)系統(tǒng)分析蛋白質(zhì)修飾尤其是組蛋白修飾以探索蛋白質(zhì)修飾與干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)不對(duì)稱(chēng)分裂的關(guān)系。A. 系統(tǒng)分析HDACs敲除小鼠細(xì)胞組蛋白以及其它蛋白質(zhì)修飾，尤其是乙?；淖兓?。B. 系統(tǒng)分析干細(xì)胞分化 (包括對(duì)稱(chēng)與不對(duì)稱(chēng)分裂) 前后組蛋白修飾的變化，為探明蛋白質(zhì)修飾調(diào)控干細(xì)胞干性維持的機(jī)制提供依據(jù)。承當(dāng)單位：同濟(jì)大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院生物物理所課題負(fù)責(zé)人：張玉珍，教授，同濟(jì)大學(xué)學(xué)術(shù)骨干：俞作仁、楊福全、李麗預(yù)算經(jīng)費(fèi)：23課題四：運(yùn)用果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)研究調(diào)控干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)分裂的新機(jī)

36、制研究目標(biāo): 利用模式動(dòng)物果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)研究所具備的直觀、高效、快捷等技術(shù)優(yōu)勢(shì)，依據(jù)同源蛋白在不同的動(dòng)物里往往具有類(lèi)似的生理生化功能的原理，結(jié)合遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法，研究特異哺乳類(lèi)干細(xì)胞標(biāo)記物如前列腺干細(xì)胞CD133+、CD117+外表特征在果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)中相應(yīng)的同源基因的功能和分子機(jī)理，尤其在組織干細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)分裂方面的作用新機(jī)制，從而提醒及探討其小鼠同源基因?qū)τ诩?xì)胞分裂模式在哺乳類(lèi)干細(xì)胞干性維持中的生理功能，并為上皮干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)/不對(duì)稱(chēng)分裂調(diào)控與干性維持研究提供新的信息和研究方向。研究?jī)?nèi)容: 1. 在果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)中，提醒干細(xì)胞標(biāo)記物如CD133和CD117同源基

37、因的功能及突變體的表型。A. 在果蠅中，重點(diǎn)研究CD133同源基因CG42310、CG7740和CD117同源基因CG8222對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的分裂模式及上皮細(xì)胞形成及構(gòu)造維持的作用。利用遺傳方式，明確CG42310與CG7740之間的關(guān)系。B. 在線(xiàn)蟲(chóng)egl-15CD117)和F08B12.1CD133突變體內(nèi)，利用高分辨率活體時(shí)序顯微成像技術(shù)，通過(guò)熒光標(biāo)記不同的細(xì)胞器如紡錘體、染色體和細(xì)胞膜等，比擬肌肉干細(xì)胞以及表皮干細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)分裂動(dòng)態(tài)過(guò)程。C. 驗(yàn)證模式動(dòng)物果蠅線(xiàn)蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與小鼠實(shí)驗(yàn)的相關(guān)性。在果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)突變體里驗(yàn)證小鼠CD133和CD117基因的相關(guān)功能，并分析GFP標(biāo)記的鼠源CD117和

38、CD133蛋白在果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)里的亞細(xì)胞定位和動(dòng)態(tài)變化。2. 說(shuō)明果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)CD133和CD117同源蛋白的亞細(xì)胞定位A. 構(gòu)建果蠅基因G42310、CG7740和CG8222及線(xiàn)蟲(chóng)基因EGL-15及F08B12.1融合蛋白質(zhì)粒，并制備相應(yīng)抗體。免疫熒光標(biāo)記觀察其在不同發(fā)育期亞細(xì)胞定位。B. 構(gòu)建表達(dá)綠色熒光蛋白GFP融合蛋白的果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)品系，觀察同源蛋白在細(xì)胞周期不同階段的動(dòng)態(tài)變化。3. 說(shuō)明CD133及CD117的分子通路。A. 選擇CG42310、CG7740及CG8222做誘餌，利用二次親和純化Tandem-Affinity-Purification TAP和質(zhì)譜分析的方法，發(fā)現(xiàn)新的結(jié)合蛋

39、白，并分析其功能。B. 利用正向遺傳學(xué)如EMS誘變的方法篩選抑制線(xiàn)蟲(chóng)egl-15突變體在線(xiàn)蟲(chóng)產(chǎn)卵egg-laying表型方面的抑制子suppressor，發(fā)現(xiàn)egl-15分子通路及上、下游的基因。C. 說(shuō)明二次親和純化方法識(shí)別的果蠅蛋白生理功能及線(xiàn)蟲(chóng)正向遺傳學(xué)篩選到的基因功能，確認(rèn)它們是否與上述CD133、CD117同源蛋白作用在同一信號(hào)通路上。D. 發(fā)現(xiàn)小鼠內(nèi)與這些新基因同源的基因，與其它課題組合作，檢測(cè)其與對(duì)稱(chēng)/不對(duì)稱(chēng)分裂調(diào)控及對(duì)前列腺干細(xì)胞干性維持的分子功能。承當(dāng)單位：浙江大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院生物物理所課題負(fù)責(zé)人：嚴(yán)慶豐，教授，浙江大學(xué)學(xué)術(shù)骨干：楊小杭、李薇、席詠梅 預(yù)算經(jīng)費(fèi)：25四、年度方

40、案年度研究?jī)?nèi)容預(yù)期目標(biāo)第一年1. 利用干細(xì)胞的標(biāo)記物譬如CD133、CD117、中心體和紡錘體的標(biāo)記物、免疫組化及實(shí)時(shí)成像等方法，研究哺乳類(lèi)干細(xì)胞在組織正常發(fā)育過(guò)程中或在成纖維細(xì)胞重編程過(guò)程中細(xì)胞的分裂模式、干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)與不對(duì)稱(chēng)分裂的比例及其作用。2. 在特異miRNA302/367集群和蛋白質(zhì)修飾HDACs調(diào)控重編程過(guò)程中，運(yùn)用標(biāo)記熒光蛋白實(shí)時(shí)示蹤成像技術(shù)觀察重編程的干細(xì)胞分裂模式。3. 在果蠅中，重點(diǎn)研究干細(xì)胞標(biāo)記物CD133同源基因CG42310、CG7740和CD117同源基因CG8222對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分裂模式及上皮細(xì)胞形成及構(gòu)造維持的作用。4. 在線(xiàn)蟲(chóng)egl-15CD117同源基因)和F

41、08B12.1CD133同源基因突變體內(nèi)，利用高分辨率活體時(shí)序顯微成像技術(shù)，通過(guò)熒光標(biāo)記不同的細(xì)胞器如紡錘體、染色體和細(xì)胞膜等，比擬干細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)分裂動(dòng)態(tài)過(guò)程。1. 建立可行的哺乳類(lèi)干細(xì)胞的分裂模式實(shí)時(shí)成像觀察系統(tǒng)，結(jié)合免疫組化，闡述干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)與不對(duì)稱(chēng)分裂在哺乳類(lèi)組織正常發(fā)育過(guò)程或在成纖維細(xì)胞重編程過(guò)程中的作用及機(jī)制。2. 說(shuō)明特異miRNA和蛋白質(zhì)修飾通過(guò)調(diào)控干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)不對(duì)稱(chēng)分裂模式影響干細(xì)胞干性的獲得和維持。3. 明確干細(xì)胞標(biāo)記物CD133和CD117三個(gè)同源基因CG42310、CG7740和CG8222的蛋白功能及變異體表型，提醒干細(xì)胞外表特征抗原CD133和CD117的蛋白功能及信號(hào)分子

42、機(jī)理。4. 明確CD117蛋白的線(xiàn)蟲(chóng)同源基因?qū)φ{(diào)控線(xiàn)蟲(chóng)干細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)分裂的影響；提醒F08B12.1同源蛋白在線(xiàn)蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中的生理功能。第二年1. 采用宮體胚胎電轉(zhuǎn)導(dǎo)和RNAi技術(shù)，研究快速基因干擾相關(guān)中心體蛋白基因CP110、CDK5RAP2等對(duì)哺乳類(lèi)神經(jīng)上皮干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)分裂的影響。2. 研究特異信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)如Wnt及其相關(guān)的分子(包括beta-catenin、Wnt5a、Frizzled、Axin2等)與哺乳類(lèi)干細(xì)胞分裂模式及干細(xì)胞干性維持的關(guān)系。3. 檢測(cè)現(xiàn)有重編程過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞分裂模式、細(xì)胞周期關(guān)鍵基因表達(dá)變化，研究Numb基因在細(xì)胞重編程過(guò)程中的表達(dá)變化。4. 采用免疫沉

43、淀Argonaute-RISCs-基因芯片技術(shù)鑒定miRNA 302/367集群過(guò)表達(dá)/let-7缺失誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的特異下游靶信號(hào)基因是否涉及干細(xì)胞核心轉(zhuǎn)錄因子、Wnt、Notch、FGF、TGFb等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞周期調(diào)控信號(hào)分子、細(xì)胞凋亡調(diào)控信號(hào)分子和染色質(zhì)重塑分子等。5. 研究果蠅CG42310、CG7740、CG8222變異體和線(xiàn)蟲(chóng)EGL-15及F08B12.1變異體，用細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)方法、進(jìn)一步深入分析變異體表型；鑒定CG42310與CG7740、CG8222之間的關(guān)系及其協(xié)同作用蛋白的生理功能；利用正向遺傳學(xué)如EMS誘變的方法篩選，發(fā)現(xiàn)線(xiàn)蟲(chóng)egl-15分子通路及上、下游的基

44、因。1. 明確中心體蛋白調(diào)控哺乳類(lèi)神經(jīng)上皮干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)分裂的分子機(jī)制。2. 提醒干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)分裂是否及如何通過(guò)特異信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)影響哺乳類(lèi)干細(xì)胞干性維持的機(jī)制。3. 將說(shuō)明PAR蛋白、Cyclins、CDKs、p27、Numb等基因在重編程過(guò)程中的變化，并初步研究其與Oct4等干細(xì)胞因子的關(guān)系。4. 探索miRNA和蛋白質(zhì)修飾誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的細(xì)胞分子機(jī)制，證實(shí)miRNA 302/367集群過(guò)表達(dá)/let-7缺失可影響干細(xì)胞核心轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞周期調(diào)控信號(hào)分子、細(xì)胞凋亡調(diào)控信號(hào)分子和染色質(zhì)重塑分子等調(diào)控細(xì)胞分裂模式，獲得并維持干細(xì)胞干性。5. 在果蠅或線(xiàn)蟲(chóng)中，通過(guò)分析變異體表型和變異性狀

45、，提醒這些同源基因在上皮/ 肌肉和神經(jīng)干細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)分裂方面的影響；分析CG42310與CG7740、CG8222之間的關(guān)系，確定哪一個(gè)起主導(dǎo)作用；發(fā)現(xiàn)新的結(jié)合蛋白，說(shuō)明這些蛋白在上皮細(xì)胞構(gòu)造、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)干細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)分裂中的作用和可能的相關(guān)性。第三年1. 研究上皮干細(xì)胞干性因子Bmi、Nanog等及外表標(biāo)志分子CD117、CD133等對(duì)上皮干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)分裂的影響。2. 利用免疫組織化學(xué)技術(shù)，在組織再生修復(fù)、重建過(guò)程中不同的時(shí)間點(diǎn)，觀察體內(nèi)特定微環(huán)境下的干細(xì)胞分裂模式及分化過(guò)程；采用干細(xì)胞標(biāo)記物CD133、CD117等，從腫瘤組織中純化、別離、三維培養(yǎng)干細(xì)胞，觀察其克隆及細(xì)胞球形成及

46、在體成瘤過(guò)程中干細(xì)胞的分裂模式及分化過(guò)程。3. 利用重編程過(guò)程中細(xì)胞周期變化和分裂模式實(shí)時(shí)標(biāo)記跟蹤系統(tǒng)，開(kāi)展關(guān)鍵基因?qū)χ鼐幊逃绊懷芯俊?. 進(jìn)一步探索miRNA和蛋白質(zhì)修飾誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的細(xì)胞分子機(jī)制，研究組蛋白修飾，尤其是組蛋白去乙?；窰DACs修飾，是否通過(guò)特異信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)及細(xì)胞周期的關(guān)鍵因子調(diào)控干細(xì)胞分裂模式和干性獲得和維持。在HDAC缺陷的ES 細(xì)胞中，觀察特異的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)或影響細(xì)胞周期的關(guān)鍵因子是否缺失。5. 驗(yàn)證模式動(dòng)物果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與小鼠實(shí)驗(yàn)的相關(guān)性：構(gòu)建表達(dá)綠色熒光蛋白GFP融合蛋白的果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)品系，觀察同源蛋白在細(xì)胞周期不同階段的動(dòng)態(tài)變化；利用小鼠CD133和CD11

47、7基因過(guò)表達(dá)載體，通過(guò)轉(zhuǎn)基因，拯救果蠅變異體表型。1. 從干細(xì)胞干性因子和外表標(biāo)志分子角度，進(jìn)一步深入系統(tǒng)地說(shuō)明哺乳類(lèi)干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)分裂的分子機(jī)制。2. 探索干細(xì)胞的分裂模式及分化過(guò)程在組織再生修復(fù)、重建、腫瘤病變中的作用及其機(jī)制。3. 找到2-3個(gè)對(duì)重編程起重要影響的細(xì)胞周期、分裂模式關(guān)鍵基因，并初步說(shuō)明其作用機(jī)理。4. 說(shuō)明組蛋白修飾調(diào)控干細(xì)胞干性獲得并維持的特異信號(hào)分子可能也與干細(xì)胞核心轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞周期調(diào)控信號(hào)分子、細(xì)胞凋亡調(diào)控信號(hào)分子和染色質(zhì)重塑分子相關(guān)。5. 在果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)突變體里驗(yàn)證小鼠CD133和CD117基因的相關(guān)功能，確定果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)CD133和CD117同源蛋白的亞細(xì)胞定位。第四年1.