紫外-可見光檢測器(1)

1、紫外-可見光檢測器第一節(jié)工作原理和主要性能一、工作原理1.朗伯-比耳定律紫外-可見光檢測器是通過測定樣品在檢測池中吸收紫外-可見光的大小來確定樣品含量的。該檢測器測量的是物質(zhì)對光的吸收，屬于吸收光譜分析類型的儀器，無論采取什么設(shè)計(jì)方法，其工作原理都是基于光的吸收定律朗伯-比耳定律。該定律指出，當(dāng)一束單色光輻射通過物質(zhì)溶液時(shí)，如果溶劑不吸收光，則溶液的吸光度與吸光物質(zhì)的濃度和光經(jīng)過溶液的距離成正比。,1=abc=lg-y=Igr/=r=-k式中，I是透過光強(qiáng)度，Io是入射光強(qiáng)度，T為透過率，A為吸光度(absorbance)又稱光密度(opticaldensity:OD)或消光值(extinct

2、ion,E),b是光在溶液中經(jīng)過的距離，一般為吸收池厚度，c是吸光物質(zhì)溶液的濃度，a為吸光系數(shù)。如果溶液濃度單位采用mol/L,b的單位為cm,則相應(yīng)的吸光系數(shù)為摩爾吸光系數(shù)(molarabsorptivity)或摩爾消光系數(shù)，單位為L/(molcm),用符號e表示，則A-ebc(431)由上式可見，吸光度與吸光系數(shù)、溶液濃度和光路長度成直線關(guān)系，也就是說對于給定的檢測池(此時(shí)b一定)，在固定的波長下(e為定值)，紫外-可見光檢測器應(yīng)輸出一個(gè)與樣品濃度(c)成正比的光吸收信號一一吸光度(A)。而實(shí)際上檢測器光電元件的輸出信號與透過率成正比，所以為了定量計(jì)算方便，在儀器采用對數(shù)放大器，將透過率轉(zhuǎn)

3、換成吸光度，此時(shí)儀器輸出信號與樣品濃度成正比。故紫外可見光檢測器屬于濃度敏感型檢測器。2 .摩爾吸光系數(shù)與分子結(jié)構(gòu)紫外-可見光檢測器的靈敏度很大程度上取決于樣品的摩爾吸光系數(shù)。摩爾吸光系數(shù)表明物質(zhì)分子對特定波長輻射的吸收能力，是物質(zhì)的重要特性。e的大小與物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、波長有關(guān)，不同類型物質(zhì)的e值差別很大。這是由于這些物質(zhì)分子中某些基團(tuán)的存在。當(dāng)用光照射時(shí)，基團(tuán)中的電子吸收光能發(fā)生能級改變，同時(shí)伴隨著振動和轉(zhuǎn)動能級的改變，形成特征的強(qiáng)吸收帶。這些基團(tuán)稱作生色團(tuán)(或發(fā)色團(tuán))，它們都含有不飽和鍵或未共用電子對，如CC、C0、SC、C-N、NN、N0等，能產(chǎn)生石兀及n-兀的躍遷。由于躍遷時(shí)吸收的能量

4、較低，在近紫外區(qū)和可見光區(qū)出現(xiàn)吸收。不飽和鍵的存在是有機(jī)物發(fā)色（指在200nm-1000nm波長光譜區(qū)內(nèi)產(chǎn)生吸收峰）的主要條件。另外，某些基因本身不產(chǎn)生吸收峰，但與生色團(tuán)相連時(shí)，常常引起吸收峰位移和吸收強(qiáng)度改變，這些基團(tuán)稱為助色團(tuán)。主要的助色團(tuán)有羥基、姓氧基、氨基、烷氧基、芳氨基等。這些基團(tuán)都能引起氧原子上或氮原子上未共用電子的共腕作用，由于助色團(tuán)的存在，使生成因吸收峰的波長向長波方向移動。表4-3-1列出了各類有機(jī)化合物及基團(tuán)的紫外光譜區(qū)的最大吸收波長和相應(yīng)的摩爾吸光系數(shù)。除有機(jī)化合物外，許多金屬離子和非金屬離子也可利用紫外-可見光吸收進(jìn)行檢測。表4-3-1一些發(fā)色基團(tuán)的最大吸收波長？max

5、和相應(yīng)的摩爾吸光系數(shù)&發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)nni八I*null1*cm1)t/1L*mnl1*rm1)醛基01S51000硫醯依1%瓶X)2151600腦越Xft195硫麗塞-MiJ95J-MXJ二硫化物一一194550025540)演化構(gòu)-Br208300除化物260400騰1H)乙烷化物175-ISO6000颯一班IHO希XOJ119()51MK)會感化物一、一/JW54)0()的應(yīng)美s7匚-C/X190SOOO謝/195inoo270-28518-30瑜胴X-S/205強(qiáng)酯一C00H20550陛CHQ210強(qiáng)2S0-3()011-J8續(xù)表發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)入一Fwe/Cf/mnl1Xi門加rHl.

6、-nnd1,rm1段酸200-21050-70亞颯、/2J0I5(X)硝星化合物一罩k210強(qiáng)亞硝酸酯-ONO220230l(W02(X10300-40010偶象-235-4003-25笨-1670(120269()0聯(lián)笨34620000蔡220112000275沔(10蕙2521990003757900紫外-可見光檢測器傳統(tǒng)上只能檢測具有紫外-可見光吸收的物質(zhì)。近年來發(fā)展的間接光度色譜，采用一般的紫外-可見光檢測器，檢測非紫外-可見光吸收物質(zhì)，使其應(yīng)用范圍擴(kuò)大。3 .檢測波長測定時(shí)一般都選擇在對樣品有最大吸收的波長下進(jìn)行，以獲得最大的靈敏度和抗干擾能力。但應(yīng)特別注意在選擇測定波長時(shí)，必須考慮

7、到所使用的流動相的紫外吸收性質(zhì)。也就是說，使用紫外）可見光檢測器時(shí)，溶劑不應(yīng)吸收測定波長的紫外光，樣品測定波長應(yīng)當(dāng)在溶劑紫外吸收波長上限以上，噪聲降至10-410-5au,才能保證檢測的靈敏度，才能用于梯度洗脫。溶劑吸收波長的上限，就是透過波長的下限。表4-3-2列出了液相色譜中常用溶劑透過波長的下限。波長的下限規(guī)定為溶劑在以空氣為參比，樣品池厚度為1cm的條件下，恰好產(chǎn)生1.0吸光度時(shí)相對應(yīng)的波長值，即溶劑透過率為10%時(shí)的波長。溶劑中如果含有吸收紫外光的雜質(zhì)，同樣會使檢測背景提高，靈敏度降低，且用作梯度洗脫時(shí)會引起嚴(yán)重漂移。因此，液相色譜系統(tǒng)對溶劑純度要求較高，一般應(yīng)使用分光純或分析純?nèi)軇?/p>

8、，在有條件時(shí)，色譜純?nèi)軇槭走x。應(yīng)注意不能使用化學(xué)純及純度更低的溶劑。有時(shí)需要對溶劑進(jìn)行專門純化處理。表4-3-2常用溶劑透過波長下限溶劑名稱遺過波長下限nm|利名稱通過波長下限，口聞酎330甲酸乙能260乙睛2101乙酸乙酯260呆280I甘油220三濱甲烷湖次烷210雷酸丁BB255己任2W丁觸235甲爵2W二碗化磷如1甲基環(huán)己烷210四氯化碳2651甲戢甲酯265氯仿245|硝基甲烷380環(huán)己烷210|正戌烷210二氨乙蟒230異丙醇21()一氧甲烷2J01時(shí)唉305甲酸皆.胺270四氯代乙掩2%二氧六環(huán)220甲苯285二乙酰2卬同二甲羊290壞戊烷2102.2，4-三甲基戊烷210甲乙

9、南330異辛燒210二甲莘N0乙SJ220異內(nèi)瞌220甲桔樣丁酮330氯代網(wǎng)燒225四氫映喃22():乙膝2751戌醇2104 .理論估算檢測限各種物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)差別很大，因此檢測靈敏度也有較大不同。根據(jù)朗伯-比耳定律，可從理論上估算紫外-可見光檢測器的檢測限、最小檢測量和最低檢測濃度。表4-3-3列出了紫外-見光檢測器對不同類型化合物的理論檢測限、最小檢測量的估算值。表4-3-3紫外吸收檢測器的理論檢測限物質(zhì)檢祗限/（y（nL）（噪聲水平10W）最小檢測后/（g）（8p,檢測池）飽和博基化合物202X1LL6xIO-1笨20(1L5X1(HL2*1(T*笨甲醛110003.8xIO-g3

10、.0x10tU蕙22(XMX)3.5x10102.8xIGc二、檢測器的性能（一）噪聲和漂移光學(xué)吸收檢測器的噪聲主要來源于檢測器和分離系統(tǒng)兩方面。最常用的確定噪聲來源的方法是系統(tǒng)地改變流動相的流速，如果噪聲與流速變化正相關(guān)，則噪聲可能來源于分離系統(tǒng)；當(dāng)噪聲與流速變化嚴(yán)格成正比關(guān)系時(shí)，可以確定噪聲一定來源于分離系統(tǒng)。1 .來源于檢測器的噪聲對于光學(xué)吸收檢測器，當(dāng)沒有樣品吸收時(shí)，檢測信號是與波長有關(guān)的光強(qiáng)、光學(xué)系統(tǒng)的傳播效率和光電轉(zhuǎn)換效率的函數(shù)。如果光電轉(zhuǎn)換效率低，則輸出信號小，接近于光電轉(zhuǎn)換元件的自然噪聲?？梢酝ㄟ^采用強(qiáng)光源或?qū)捵V帶的辦法來增加光強(qiáng)，提高信噪比。如果僅提高放大器的放大倍數(shù)，會同時(shí)

11、放大噪聲，信噪比也得不到提高。許多光學(xué)吸收檢測器使用笊燈做光源，隨著使用時(shí)間的增加，笊燈光強(qiáng)降低，噪聲不斷加大。另外，由于靜電作用，檢測器在使用過程中易于從周圍環(huán)境中吸塵，覆蓋在光學(xué)元件上的塵埃降低了光的傳播效率，提高光的散射，因此對檢測不利。強(qiáng)紫外光的照射還會使一些光學(xué)材料徐層發(fā)生降解，也會慢慢增加噪聲。檢測器的信噪比一年可降低四分之一或更多。2 .來源于分離系統(tǒng)的噪聲早期紫外-可見光檢測器對流動相流速的變化非常敏感，因此也導(dǎo)致了恒流泵的使用和發(fā)展。溫度變化引起流動相折射率改變是紫外-可見光檢測器流速靈敏度產(chǎn)生的主要原因。入射光進(jìn)入檢測池之前必須通過空氣-光窗和光窗-流動相兩個(gè)界面，入射光因

12、此產(chǎn)生了反射或散射損失，具有與化合物吸光相同的效果（大約是10-4）o當(dāng)介質(zhì)之間折射率的差異較大時(shí)，會有更多的光被反射、散射損失掉。由于折射率對溫度的變化非常敏感（大多數(shù)溶劑折射率的溫度系數(shù)在10-4-10-3之間），因此需要控制檢測池流動相的溫度，利用熱平衡減少光損失。熱交換器是熱平衡的典型設(shè)備。除溫度外，流動相折射率的變化還與其壓力有關(guān)。泵的脈沖導(dǎo)致流動相壓力變化，也會引起流動相折射率的改變，而影響通過流動相的紫外光傳播?？梢杂迷黾用}沖阻尼器的方法來改善壓力基線噪聲。檢測池內(nèi)氣泡的存在，是檢測器噪聲的重要來源。原因是檢測池內(nèi)一個(gè)很微小的氣泡都會形成一個(gè)反射面，造成光的反射、散射損失，引起吸

13、光誤差。使用經(jīng)充分脫氣的流動相通過檢測池可以避免氣泡。提高檢測池壓力，是防止氣泡形成的較好辦法。具體做法是在檢測器出口設(shè)置限制器（1m*0.25mm聚四氟乙烯管），使之保持一定的反壓；或者在檢測器出口處接一根舊的短柱。但應(yīng)注意增加的壓力不能太高，如果超過規(guī)定的壓力限，可能引起檢測池的破裂，色譜參數(shù)也可能發(fā)生變化。氣泡內(nèi)含氧時(shí)，在波長小于260mm處經(jīng)常可以觀察到很高的噪聲水平，此時(shí)流動相用氮?dú)饷摎馐窍皆肼暤挠行侄?。除了會引起檢測器產(chǎn)生噪聲外，流動相溫度的緩慢變化、光學(xué)元件如光源等的迅速老化還會引起檢測器的漂移?，F(xiàn)代紫外-可見光檢測器的漂移更多的來自流動相組成的改變，尤其是進(jìn)行梯度洗脫時(shí)

14、。為彌補(bǔ)梯度洗脫造成的漂移，可采用雙柱分離、雙光束檢測的辦法以差減去除漂移，但操作繁瑣；或者將含有樣品的流動相和不含樣品的空白流動相先后進(jìn)行同樣的梯度洗脫，將兩者差減后，去除漂移。另外，還可用化學(xué)方法加入負(fù)梯度物質(zhì)，進(jìn)行負(fù)向補(bǔ)償流動相溶劑造成的基線漂移。但此時(shí)由于本底提高，要求紫外-可見光檢測器有較大的線性范圍。（二）線性范圍朗伯-比耳定律只適用于單色光和均勻非散射溶液。對于連續(xù)光源，當(dāng)單色器色散能力較低時(shí)，得到的是具有一定波長范圍的較寬譜帶，吸光系數(shù)近似為常數(shù)，導(dǎo)致對定律的偏離。不僅使線性范圍變小，而且吸收峰不敏銳。朗伯-比耳定律中的儀器偏差是定量分析的根本性限制。當(dāng)待測物質(zhì)濃度較大時(shí)，這種

15、偏差表現(xiàn)為響應(yīng)曲線的斜率變小。此時(shí)吸光質(zhì)點(diǎn)的光散射較大，特別是在紫外區(qū)，散射更為嚴(yán)重。雜散光作為主要光源被光敏元件檢測，光電轉(zhuǎn)換元件和其它電子元件的靈敏度較差等原因都會導(dǎo)致對朗伯-比耳定律的偏離，進(jìn)而使檢測器線性范圍降低。為了克服非單色光引起的偏離，應(yīng)盡量設(shè)法得到比較窄的入射光譜帶，這就需要較好的單色器和合適的狹縫寬度。棱鏡和光柵的譜帶寬度僅幾個(gè)納米，一般已夠用。檢測限與線性范圍有著相互依賴的關(guān)系。狹縫寬度大，光通量增加，有利于靈敏檢測，但線性范圍??；狹縫寬度過窄，又會降低信噪比。另外，將入射光波長選擇在被測物的最大吸收波長（？max）處，不僅測定靈敏度高，而且在?max附近的一個(gè)很小的范圍內(nèi)吸收曲線較為平坦，吸光系數(shù)相差不大，因此由雜散光引起的偏離就會比其它波長處小得多，而且因波長不穩(wěn)定引起的偏差也會較小。檢測的精確度、準(zhǔn)確度都較高（圖4-3-1）。圖中虛線和實(shí)線表示相同的光譜，只是移位了1mm。（三）溫度影響與氣相色譜檢測器相比，液相色譜檢測器的溫度效果要小得多。但為了在保留時(shí)間和峰面積方面取得較大的精確度和準(zhǔn)確度，將噪聲盡可能地降低，檢測器的溫度控制仍是有益的。除了前面所說的流動相溫度變化引起折射率改變之外，一些化合物的紫外吸收光譜也會隨溫度變化而改變，其中染料分子的吸收光譜變化較大，甲苯吸光度的溫度。系數(shù)可達(dá)-0.75%/C。還有的化合物，因分子結(jié)構(gòu)隨溫度改變