全二維氣相色譜原理及特性研究

1、全二維氣相色譜分離原理及特性研究1.概述2.全二維氣相色譜原理及優(yōu)點(diǎn)3.全二維氣相色譜調(diào)制器4.全二維氣相色譜分離特性研究4.前景展望圖1 全二維氣相色譜技術(shù)發(fā)展歷史1.概述 1990 年 1 月 Bushey 和Jorgensen 等最早提出用排阻色譜和反相 HPLC 實(shí)現(xiàn)全二維液相色譜,并首次提出了全二維色譜。5 月他們又用HPLC 和 CE 第一次實(shí)現(xiàn)了全二維 HPLC/CE。 1991 年 Phillips 和 Liu用他們以前在快速色譜中使用的在線熱調(diào)制器發(fā)展出了一種新的二維氣相色譜系統(tǒng)。由于采用這個(gè)系統(tǒng)全部的樣品均被分析，而不僅僅是被中心切割的餾分，因此這個(gè)系統(tǒng)被命名為全二維氣相色

2、譜，以區(qū)別傳統(tǒng)的二維氣相色譜。 1997 年，Marriott 和Kinghorn 等提出了徑向冷調(diào)制的全二維氣相色譜，原理是通過移動(dòng)的冷阱吸附和脫附組分進(jìn)行調(diào)制。 1998 年，Synovec 等首次報(bào)道了采用閥調(diào)制的全二維氣相色譜。 1999 年，美國(guó) Zoex 公司開發(fā)了狹槽式熱調(diào)制器并實(shí)現(xiàn)了全二維氣相色譜的商品化。 2000 年，Zoex公司的 Ledford 等改進(jìn)了狹槽式熱調(diào)制器，在調(diào)制管的末端交替使用冷氣和熱氣來對(duì)組分起捕集和脫附作用，改善了低沸點(diǎn)組分的調(diào)制效果，減小了峰寬。這種調(diào)制器不再使用移動(dòng)部件和厚液膜調(diào)制管，直接用第二維柱的一部分作為調(diào)制管，且第一維柱長(zhǎng)不受限制，柱系統(tǒng)的

3、更換和連接更簡(jiǎn)單、方便。 2.1 全二維氣相色譜原理 全二維氣相色譜是把分離機(jī)理不同且互相獨(dú)立的兩根色譜柱以串聯(lián)方式結(jié)合成的二維氣相色譜，兩根色譜柱由調(diào)制器連接，調(diào)制器起捕集、聚焦、再傳送的作用。經(jīng)第一根色譜柱分離后的每一個(gè)色譜峰，都經(jīng)調(diào)制器調(diào)制后再以脈沖方式送到第二根色譜柱進(jìn)一步分離。所謂全二維，意義在于此。通常第一根色譜柱使用非極性的常規(guī)高效毛細(xì)管色譜柱，采用較慢的程序升溫速率（通常 1-5/min）。第二根色譜柱通常使用對(duì)極性或構(gòu)型有選擇性的細(xì)內(nèi)徑短柱。組分在第二維的保留時(shí)間非常短，一般在 1-10 s，因此第二維的分離也可近似當(dāng)作恒溫分離。2.全二維氣相色譜原理及優(yōu)點(diǎn)圖2 全二維原理示

4、意圖 組分在第二維的快速分離使得到的色譜峰峰寬很窄，典型的第二維峰底寬為 100-600ms。這樣窄的色譜峰需用快速檢測(cè)器來采集信號(hào)構(gòu)建二維譜圖。全二維氣相色譜譜圖的生成如圖 2所示，分為調(diào)制、轉(zhuǎn)換和可視化三個(gè)步驟。第一根柱后流出的峰經(jīng)數(shù)次調(diào)制后進(jìn)入第二根色譜柱快速分離，經(jīng)由檢測(cè)器檢測(cè)得到原始數(shù)據(jù)文件。原始的數(shù)據(jù)文件根據(jù)所用的調(diào)制周期和檢測(cè)器的采集頻率進(jìn)行轉(zhuǎn)換得到二維矩陣數(shù)據(jù)。在矩陣譜圖中，不同調(diào)制周期的第二維譜圖按周期數(shù)并肩排列?？梢暬峭ㄟ^顏色、陰影或等高線圖的方式將峰在二維平面上呈現(xiàn)出來，有時(shí)也用三維圖形描述。1D chromatogramAt first column outletRa

5、w 2D chromatogramAt second column outletSecond-dimension chromatogramsStacked side by side2D colour plotModulationtransformationVisualization圖3 全二維氣相色譜譜圖的生成和可視化 2.2 全二維氣相色譜優(yōu)點(diǎn)（1）分辨率高、峰容量大。在一個(gè)正交的GCGC系統(tǒng)中，峰容量為其組成的兩根柱子各自峰容量的乘積，分辨率為兩根柱子各自分辨率平方加和的平方根。美國(guó)Southern Illinois 大學(xué)已成功地用此技術(shù)一次進(jìn)樣從煤油中分出一萬多個(gè)峰?？梢哉f，GCGC是目

6、前最高分辨率的儀器。（2）靈敏度高。經(jīng)第一支色譜柱分離后，餾分在調(diào)制器聚焦，再以脈沖形式進(jìn)樣（圖4），圖中的這個(gè)峰被調(diào)制了6次，信號(hào)強(qiáng)度比調(diào)制前放大了約20倍。因此，靈敏度可比通常調(diào)制前放大了約20-50倍。圖4 調(diào)制前后譜圖的變化（冷噴調(diào)制器調(diào)制周期為3s）（3）分析時(shí)間短。由于使用了兩根不同極性的柱子，因此樣品更容易分開，總分析時(shí)間反而比一維色譜短。（4）定性可靠性大大增強(qiáng)。兩個(gè)因素對(duì)此起作用，第一，大多數(shù)目標(biāo)化合物和化合物組可基線分離，減少了干擾；第二，峰被分離成容易識(shí)別的模式，同系物成員在第二維具有類似的保留值，而異構(gòu)體成員則形成“瓦片狀”排列，形成“結(jié)構(gòu)化”譜圖。3.1調(diào)制器 在GC

7、GC中，核心部件是安裝在兩柱之間的調(diào)制器，硬件開發(fā)研究主要集中在發(fā)展更可靠并易于操作的調(diào)制技術(shù)。調(diào)制器起到捕集、聚焦、再傳送的作用，相當(dāng)于第二維色譜柱的連續(xù)脈沖進(jìn)樣器。一個(gè)優(yōu)良的調(diào)制器需滿足的條件是: (1)能定時(shí)濃縮從第一柱流出的分析物 (2)能轉(zhuǎn)移很窄的區(qū)帶到第二柱的柱頭，起第二維的進(jìn)樣器的作用 (3)聚焦和再進(jìn)樣的操作應(yīng)是再現(xiàn)的，且非歧視性的。這種聚焦和再進(jìn)樣的過程應(yīng)是可以重現(xiàn)的，而且對(duì)所有物質(zhì)是非歧視性的。3.全二維氣相色譜儀器A、熱調(diào)制器 熱調(diào)制器是在全二維氣相色譜中最早出現(xiàn)的調(diào)制形式。調(diào)制器采用厚液膜固定相對(duì)第一維的流出物質(zhì)進(jìn)行捕集，采用瞬間提高溫度的方法，將物質(zhì)在固定相上脫附，達(dá)

8、到再進(jìn)樣的目的。 Phillips等設(shè)計(jì)的最早的全二維氣相色譜就是采用一個(gè)兩段涂金屬的毛細(xì)管，用于對(duì)柱1流出溶質(zhì)的富集和富集組分的快速熱脫附。盡管應(yīng)用這個(gè)調(diào)制器獲得了一些好的結(jié)果，但由于涂層常被燒壞或毛細(xì)管斷裂，不得不經(jīng)常替換。涂層的不均勻也給調(diào)制帶來一定問題。 為了克服金屬涂層二段調(diào)制器的缺陷，Ledford和PhillipS設(shè)計(jì)了一種基于移動(dòng)加熱技術(shù)的調(diào)制器（圖5），它使用一個(gè)步進(jìn)電機(jī)帶動(dòng)加熱元件（“掃帚”）運(yùn)動(dòng)通過毛細(xì)管來達(dá)到局部加熱的目的。此設(shè)計(jì)的最重要優(yōu)點(diǎn)四：該加熱器熱質(zhì)足夠大，可提供一個(gè)穩(wěn)定的很好控制的溫度。圖5 狹縫式熱調(diào)制器B、冷調(diào)制器 與特調(diào)制器不同，冷調(diào)制器利用冷阱或冷噴系

9、統(tǒng)進(jìn)行調(diào)制，是目前最為主要的調(diào)制方式。1997年Marriott和Kinghorn發(fā)展了一種基于移動(dòng)冷阱冷聚焦的調(diào)制技術(shù)稱之為徑向冷調(diào)制（LMCS）。調(diào)制器由移動(dòng)冷阱組成，形成可以徑向移動(dòng)的冷捕集調(diào)制系統(tǒng)，這種調(diào)制器的原理如圖4。圖6 徑向冷調(diào)制器（LCMS)結(jié)構(gòu)圖 由于冷阱的作用，第一維的流出譜帶以很窄的區(qū)帶寬度被保留在冷阱調(diào)制器的T（Trap）位（捕集）中，每隔幾秒，調(diào)制器從T位快速移動(dòng)到R（Release）位（釋放）。原先T位捕集區(qū)間的毛細(xì)管開始由爐子氣加熱，被捕集的餾分被立即釋放，以很窄的區(qū)帶在第二根柱的柱頭進(jìn)行第二次分離，同時(shí)，從第一根柱流出的餾分在釋放區(qū)間（R位）被捕集，避免了與前

10、一周期組分在第二柱的重疊。根據(jù)設(shè)定的調(diào)制時(shí)間，這個(gè)過程將重復(fù)，知道第一根柱分析結(jié)束。 這個(gè)方法的主要優(yōu)點(diǎn)是調(diào)制器中的毛細(xì)管加熱到正常的爐溫即可使其脫附，與狹縫式熱調(diào)制系統(tǒng)相比溫度上不受限制，可以分析沸點(diǎn)更高的物質(zhì)。明顯缺點(diǎn)是：調(diào)制器部分色譜柱的固定相長(zhǎng)期處于低達(dá)-50的物理狀態(tài)。C、閥調(diào)制器 閥調(diào)制器是有Synoves等在1998年提出來的。它的組成見圖7a：采用一個(gè)六通隔膜閥作為調(diào)制器，通過快速閥切換，第一根柱后流出的樣品經(jīng)分流后進(jìn)入第二根色譜柱，進(jìn)行第二次分離。由于使用分流進(jìn)樣，樣品的大部分被放空，只有10%-20%的餾分被送進(jìn)第二根柱檢測(cè)，因此檢測(cè)靈敏度要比其它調(diào)制技術(shù)低得多。在2000

11、年，Sleey等針對(duì)Synoves的閥調(diào)制技術(shù)作了改進(jìn)，改進(jìn)型的閥調(diào)制示意圖見圖7b。隔膜閥連接一個(gè)采樣管，且第一維柱和第二維柱采用不同的流量。通常第二維色譜柱的柱流量是第一維的20倍。一個(gè)循環(huán)中80%的時(shí)間用于采樣，20%的司機(jī)用于樣品轉(zhuǎn)移至第二維柱。圖7a 閥調(diào)制器結(jié)構(gòu)圖圖7b 閥調(diào)制器結(jié)構(gòu)圖3.2 檢測(cè)器 GCGC中第二維分離非常快，應(yīng)在一個(gè)脈沖周期內(nèi)完成第二維的分離，否則，前一脈沖的后流出組分可能會(huì)與后一脈沖的前面組分交叉或重疊，引起混亂。通常典型的第二維峰底寬度為100-600ms。峰寬主要與使用的調(diào)制器、第二維色譜柱的長(zhǎng)度、線速等有關(guān)。由于第二維近似是恒溫操作，對(duì)于給定的色譜條件來

12、說第二維的峰寬取決于保留時(shí)間。因此，檢測(cè)器的響應(yīng)時(shí)間應(yīng)非?？?。對(duì)于峰寬很窄的色譜峰的檢測(cè)需要快速檢測(cè)器?？焖贆z測(cè)器需要較小的內(nèi)部體積，較短的響應(yīng)時(shí)間和足夠高的數(shù)據(jù)采集頻率才能確保二維譜圖的準(zhǔn)確構(gòu)建?，F(xiàn)代FID檢測(cè)器的內(nèi)部體積幾乎可以忽略不計(jì)，且采集頻率高達(dá)50-200Hz，是被最廣泛采用的全二維氣相色譜檢測(cè)器。4.全二維氣相色譜分離性能研究4.1 引言 多維色譜的正交分離是指組成多維色譜的各維之間彼此不相關(guān)，產(chǎn)生的交叉信息為零。正交分離時(shí)，各維的保留彼此獨(dú)立，可用的峰容量等于多維色譜的最大峰容量一即各維峰容量的乘積。全二維氣相色譜是將兩根分離機(jī)理不同的色譜柱以串聯(lián)方式連接。在適當(dāng)?shù)纳V條件下，

13、可消除兩維保留機(jī)理相似的部分，使得二維的保留不相關(guān)，實(shí)現(xiàn)全二維氣相色譜的正交分離。 影響氣相色譜總分離效能指標(biāo)(K1或R)的因素有柱效、容量因子和相對(duì)保留時(shí)間，因此氣相色譜的優(yōu)化涉及色譜熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)，只有在優(yōu)化的色譜柱系統(tǒng)上才能獲得真正的最佳操作條件。全二維氣相色譜與一維氣相色譜相似，條件的優(yōu)化需要考慮柱系統(tǒng)、固定相、柱參數(shù)、柱溫及其流速對(duì)分離的影響。但在給定的柱系統(tǒng)條件下，在實(shí)際樣品分析中最常用的優(yōu)化因素是柱溫。4.2 全二維氣相色譜總分離性能指標(biāo)（K1或R）全二維氣相色譜兩根色譜柱以串聯(lián)方式連接，第一根色譜柱為常規(guī)色譜柱，第二根色譜柱為細(xì)內(nèi)徑短柱以實(shí)現(xiàn)快速分離。通常情況下，柱溫采用線性程

14、序升溫。組分在第二維的分離一般為2-10s，近似恒溫條件。當(dāng)兩柱置于同一柱箱時(shí)，組分在第一維柱后的流出溫度即為第二維的恒溫分離溫度。全二維氣相色譜條件最佳化的目的是使得給定混合物中感興趣組分的總分離效能指標(biāo)K1遵守 K1K1req R=1.7K1 同時(shí)總的分析時(shí)間最短。其中K1req是定量分析精度要求的總分離效能指標(biāo)。1DGC柱溫智能最佳化是圍繞最難分離物質(zhì)對(duì)及其交叉點(diǎn)的預(yù)測(cè)展開。全二維氣相色譜需綜合考慮兩維的分離能力。組分的總分離效能指標(biāo)包括第一維的總分效能指標(biāo)凡K1,1st，和第二維的總分離效能指標(biāo)K1,2nd。其中第二維的總分離效能指標(biāo)是針對(duì)在第一維共流出的組分，即出現(xiàn)在第二維相同調(diào)制周

15、期的組分。 組分流出第一根柱子時(shí)，第一維的總分離效能指標(biāo)R1st，可用下式計(jì)算:式中W1st(i)、W1st(i-1)分別為流出峰i、i-1在第一根柱上的峰底寬tr,1st(i) tr,1st(i-1)，其值等于(或小于)調(diào)制周期與組分的調(diào)制周期數(shù)的乘積。 類似的第一維柱后共流出的組分進(jìn)入第二根柱進(jìn)行進(jìn)一步的分離，在第二維同一周期的柱溫近似為恒溫。組分在第二維的總分離效能指標(biāo)K1,2nd可用下式計(jì)算:式中W1/2,2nd(i)、W1/2,2nd(i-1)分別為同一周期內(nèi)的流出峰i、i-1在第二根柱上的半峰寬(tr,2nd(i) tr,2nd(i-1)，其值可由組分在第二根柱上的保留時(shí)間來計(jì)算，

16、因其值是相對(duì)值也可以直接取色譜工作站采集的同一周期出峰的兩個(gè)組分的保留時(shí)間來計(jì)算。4.3 試劑和樣品圖8 標(biāo)準(zhǔn)樣品的GCGC譜圖4.4 結(jié)果與討論 圖中是38種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的GCGC分離譜圖，圖中第一維根據(jù)沸點(diǎn)分離，最底部的一條帶是C6-C15正構(gòu)烷烴等間距分布，第二維根據(jù)物質(zhì)的極性分離，依次是烯烴、苯系物、蔡系物的同系物成員排列成幾乎平行的直線，同系物成員的二維保留值近似一常數(shù)。充分利用了兩維空間，說明在適當(dāng)條件下GCGC可實(shí)現(xiàn)正交分離。4.4.1初始柱溫對(duì)GCGC分離影響圖9 初始柱溫對(duì)GCGC分離的影響 圖可以看到在起始柱溫25、30、40時(shí)，系列正構(gòu)烷烴同系物成員在最底部的一條線上，第二維

17、的保留時(shí)間近似為常數(shù)，可認(rèn)為組分在第二維的保留與第一維無關(guān)，兩維實(shí)現(xiàn)了正交分離。隨著起始溫度的增加，同系物成員在兩維上的分離表現(xiàn)出相關(guān)性，第一維流出較晚的在第二維流出也較晚。這是由于在較高的起始溫度下，兩維采用相同的柱溫程序，其第二維的柱溫升高引起的保留值下降不足以補(bǔ)償柱1流出的同系物成員揮發(fā)性的下降。此時(shí)，柱2的分離機(jī)理是部分揮發(fā)性和極性共同作用的結(jié)果，兩維固定相的揮發(fā)性作用使得保留相關(guān)。4.4.2 程序升溫速率對(duì)GCGC分離影響圖10 程序升溫對(duì)GCGC分離速率的影響 由圖可知，程升速率對(duì)二維流出溫度影響較大，隨著程升速率增加一維分辨率降低，組分在二維的流出溫度升高，二維保留降低，因此也降

18、低了二維的分離度。從圖中可以看出，程升速率為2/min時(shí)，一維的分辨率提高，但二維的流出溫度低，組分保留長(zhǎng)，調(diào)制周期6s，在一定程度上影響了一維的分離度。隨著程升速率的提高，調(diào)制周期縮短，圖c可看出程升速率為10/min，可采用25的調(diào)制周期，峰拖尾。20/min的升溫速率流出溫度高需要后恒，而且兩維的分離很差。圖中的結(jié)果表明，程升速率對(duì)分離具有較大影響。4.4.3 載氣線速對(duì)GCGC分離影響圖 11載速對(duì)GCGC分離影響 對(duì)第一維來說保持其他條件不變，增加線速會(huì)減少分析時(shí)間，流出溫度降低。對(duì)第二維來說，增加線速縮短分析時(shí)間，但同時(shí)分析溫度降低又使分析時(shí)間增長(zhǎng)。第二維的保留時(shí)間變化是兩者共同作

19、用的結(jié)果。圖中a，b，e，d分別對(duì)應(yīng)的是第一維 線速為30cm/s、30cm/s、30cm/s和30cm/s時(shí)LCO在二維的分離。從圖中可知線速變化對(duì)二維分離的影響不顯著。4.4.4 柱系統(tǒng)的匹配對(duì)GCGC分離的影響圖 12柱系統(tǒng)的選擇對(duì)GCGC分離影響 圖a第二維柱是中等極性的007-17柱，圖b的第二維柱是極性的BTR-CW-10NB-0.1F柱，圖c第二維柱是手性環(huán)糊精的cyclodex-B柱。圖a和圖b中組分的極性沿第二維方向逐漸遞增。二環(huán)的萘分布在單環(huán)芳烴的上部，圖a芳烴的同分異構(gòu)體聚堆分布，而圖b相同碳數(shù)的芳烴同分異構(gòu)體斜線排列。圖a，b正構(gòu)烷烴幾乎在一條線上，實(shí)現(xiàn)了正交分離。圖c

20、組分分布沒有規(guī)律性。對(duì)于圖c所用的柱系統(tǒng)而言，二維柱系統(tǒng)的分離機(jī)理均是揮發(fā)性、極性和手性共同作用，使樣品中的同系物、異構(gòu)體和對(duì)映異構(gòu)體等被分離，平面分布沒有呈現(xiàn)規(guī)律，不能實(shí)現(xiàn)正交分離的結(jié)果。只有非極性或弱極性的第一維柱配中等極性或極性的第二維柱才有可能實(shí)現(xiàn)GCGC的正交分離，充分利用兩維空間。4.4.5 柱參數(shù)對(duì)分離的影響 圖a，b，c，d對(duì)應(yīng)的第二維柱長(zhǎng)分別為70cm，75cm，105cm和150cm的一個(gè)周期的第二維分離譜圖。圖中出峰依次是C11烷烴，C6取代苯，C5取代苯和萘。從圖中可知當(dāng)柱長(zhǎng)由70mc增加至75cm、105cm和150cm時(shí)，調(diào)制周期由6s增加至7s，9s和11s，組分在第二維的保留時(shí)間分別增加了1.17倍，1.5倍和1.83倍。柱長(zhǎng)為150cm時(shí)，萘的第二維保留時(shí)間為10.6s。三環(huán)芳烴化合物在第二維的保留超過了12s。對(duì)于從柱1中流出一對(duì)物質(zhì)來說，第二維柱長(zhǎng)增加其相對(duì)保留時(shí)間不變。當(dāng)柱長(zhǎng)由70cm