干細(xì)胞-成體干細(xì)胞課件

1、成體干細(xì)胞成體干細(xì)胞第一頁，共五十一頁。第二頁，共五十一頁。一、定義一、定義成體干細(xì)胞是指一群成體干細(xì)胞是指一群分布在成體組織分布在成體組織中中尚尚未分化未分化的、具有的、具有自我更新自我更新(gngxn)(gngxn)、并負(fù)有、并負(fù)有構(gòu)構(gòu)建和補(bǔ)充建和補(bǔ)充某種組織的各種類型細(xì)胞潛能某種組織的各種類型細(xì)胞潛能的干細(xì)胞的干細(xì)胞, ,又稱組織特異性干細(xì)胞又稱組織特異性干細(xì)胞( () )。 第三頁，共五十一頁。傳統(tǒng)傳統(tǒng)(chuntng)觀點(diǎn)觀點(diǎn) q干細(xì)胞一旦干細(xì)胞一旦(ydn)(ydn)分化成熟，就不再分裂增殖了分化成熟，就不再分裂增殖了；q成體干細(xì)胞的發(fā)育潛能是限能或少能的；成體干細(xì)胞的發(fā)育潛能是限

2、能或少能的；q成體干細(xì)胞只能分化為特定組織器官若干類型細(xì)胞。成體干細(xì)胞只能分化為特定組織器官若干類型細(xì)胞。 第四頁，共五十一頁。轉(zhuǎn)折點(diǎn)轉(zhuǎn)折點(diǎn)q19971997年初，英國科學(xué)家年初，英國科學(xué)家WilmutWilmut等用體外培養(yǎng)、高度分化的母羊乳等用體外培養(yǎng)、高度分化的母羊乳腺細(xì)胞核移植腺細(xì)胞核移植(yzh)(yzh)入去核卵細(xì)胞，克隆出了入去核卵細(xì)胞，克隆出了 “DollyDolly”。 q表明某些高度分化的體細(xì)胞核仍表明某些高度分化的體細(xì)胞核仍具有一套完整具有一套完整(wnzhng)(wnzhng)的遺傳信的遺傳信息，能指導(dǎo)胚胎發(fā)育成為一個完整息，能指導(dǎo)胚胎發(fā)育成為一個完整(wnzhng)(

3、wnzhng)的新個體。的新個體。 q在特定的條件在特定的條件(tiojin)(tiojin)下，分化的體細(xì)胞仍具下，分化的體細(xì)胞仍具發(fā)育的全能性。發(fā)育的全能性。 第五頁，共五十一頁。與胚胎干細(xì)胞相比，成體干細(xì)胞具有許多與胚胎干細(xì)胞相比，成體干細(xì)胞具有許多(xdu)優(yōu)勢：優(yōu)勢：v成體干細(xì)胞不存在組織相容性的問題，治療時可避免長成體干細(xì)胞不存在組織相容性的問題，治療時可避免長期應(yīng)用期應(yīng)用(yngyng)免疫抑制劑對患者的傷害。免疫抑制劑對患者的傷害。v胚胎干細(xì)胞能分化成各種細(xì)胞類型，但這種分化是胚胎干細(xì)胞能分化成各種細(xì)胞類型，但這種分化是“非定位性非定位性”的。目前，尚不能控制胚胎干細(xì)胞在特定的

4、的。目前，尚不能控制胚胎干細(xì)胞在特定的部位部位(bwi)分化成相應(yīng)的細(xì)胞，容易導(dǎo)致畸胎瘤。分化成相應(yīng)的細(xì)胞，容易導(dǎo)致畸胎瘤。v成體干細(xì)胞也具有類胚胎干細(xì)胞的高度分化能力。成體干細(xì)胞也具有類胚胎干細(xì)胞的高度分化能力。第六頁，共五十一頁。目前目前(mqin)(mqin)，比較一致的看法是：，比較一致的看法是： v成體干細(xì)胞是一種尚未終末分化成體干細(xì)胞是一種尚未終末分化(fnhu)(fnhu)的、處于干細(xì)胞的、處于干細(xì)胞/ /祖祖細(xì)胞或前體細(xì)胞狀態(tài)的成體細(xì)胞；細(xì)胞或前體細(xì)胞狀態(tài)的成體細(xì)胞；v正常正常(zhngchng)(zhngchng)生理?xiàng)l件下，傾向分化為所在特定組織的若生理?xiàng)l件下，傾向分化為所

5、在特定組織的若干種細(xì)胞；干種細(xì)胞； v外界條件誘導(dǎo)下，成體干細(xì)胞能超越該特定組織，分化成其外界條件誘導(dǎo)下，成體干細(xì)胞能超越該特定組織，分化成其他的功能細(xì)胞，補(bǔ)充參與損傷組織的修復(fù)等。他的功能細(xì)胞，補(bǔ)充參與損傷組織的修復(fù)等。 第七頁，共五十一頁。多能性多能性 廣廣泛泛性性 遷遷移移性性 可調(diào)控可調(diào)控(dio (dio kn)kn)性性 增生增生(zngshng)(zngshng)活躍活躍組織（如黏組織（如黏膜、骨髓）膜、骨髓）不活躍組不活躍組組織（如神組織（如神經(jīng)脂肪、肺經(jīng)脂肪、肺部）。部）。 體內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)體內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)分化的中介環(huán)分化的中介環(huán)節(jié)。節(jié)。BlauBlau等將干細(xì)等將干細(xì)胞借助于循環(huán)穿胞借

6、助于循環(huán)穿梭于組織的特性梭于組織的特性成為成為“干細(xì)胞干細(xì)胞高速公路高速公路”。 高度依賴于干細(xì)胞所處的高度依賴于干細(xì)胞所處的三維空間結(jié)構(gòu)三維空間結(jié)構(gòu)和和多維的分化信號多維的分化信號。微環(huán)境中的微環(huán)境中的細(xì)胞因子細(xì)胞因子、同種或異種細(xì)胞之間的接觸同種或異種細(xì)胞之間的接觸、細(xì)胞外、細(xì)胞外基質(zhì)成分基質(zhì)成分等對成體等對成體細(xì)胞的分化方向與進(jìn)程起到重要的調(diào)控作用。細(xì)胞的分化方向與進(jìn)程起到重要的調(diào)控作用。 第八頁，共五十一頁。q成熟的組織內(nèi)的確存在由胚胎時殘留下來的多能成熟的組織內(nèi)的確存在由胚胎時殘留下來的多能干細(xì)胞。干細(xì)胞。 qVerfaillieVerfaillie等證實(shí)在成體許多組織中余存著一等證

7、實(shí)在成體許多組織中余存著一種稀有數(shù)量的胚胎樣原始干細(xì)胞，表達(dá)胚胎干細(xì)種稀有數(shù)量的胚胎樣原始干細(xì)胞，表達(dá)胚胎干細(xì)胞的遺傳標(biāo)志，體外的培養(yǎng)條件也基本類似于胚胞的遺傳標(biāo)志，體外的培養(yǎng)條件也基本類似于胚胎干細(xì)胞。胎干細(xì)胞。 第九頁，共五十一頁。q可塑性是細(xì)胞融合的結(jié)果可塑性是細(xì)胞融合的結(jié)果(ji gu)(ji gu)。 q2020世紀(jì)初期，通過世紀(jì)初期，通過(tnggu)(tnggu)細(xì)胞融合產(chǎn)生雜合體而改變細(xì)胞命細(xì)胞融合產(chǎn)生雜合體而改變細(xì)胞命運(yùn)，例如將肌母細(xì)胞與纖維母細(xì)胞融合后，可在纖維母細(xì)胞內(nèi)運(yùn)，例如將肌母細(xì)胞與纖維母細(xì)胞融合后，可在纖維母細(xì)胞內(nèi)觀察到肌蛋白表達(dá)；觀察到肌蛋白表達(dá)； q將鼠骨髓細(xì)胞

8、或神經(jīng)細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞共同培養(yǎng)后，骨髓細(xì)將鼠骨髓細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞共同培養(yǎng)后，骨髓細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞會產(chǎn)生明顯的逆向分化，獲得胚胎干細(xì)胞特征；胞和神經(jīng)細(xì)胞會產(chǎn)生明顯的逆向分化，獲得胚胎干細(xì)胞特征； 第十頁，共五十一頁。q最近有研究人員將熱休克的小氣道上皮細(xì)胞與骨髓間質(zhì)干最近有研究人員將熱休克的小氣道上皮細(xì)胞與骨髓間質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)，觀察到間質(zhì)干細(xì)胞與損傷的氣道細(xì)胞融合新細(xì)胞共同培養(yǎng)，觀察到間質(zhì)干細(xì)胞與損傷的氣道細(xì)胞融合新生出氣道上皮，而且融合率大于生出氣道上皮，而且融合率大于1%1%，推測在，推測在體內(nèi)出現(xiàn)急性器官體內(nèi)出現(xiàn)急性器官(qgun)(qgun)衰竭和組織壞死時有可能通過細(xì)胞融合完

9、成組織修復(fù)衰竭和組織壞死時有可能通過細(xì)胞融合完成組織修復(fù). . 第十一頁，共五十一頁。q細(xì)胞由成熟細(xì)胞由成熟(chngsh)(chngsh)狀態(tài)去分化為較原始狀態(tài)，隨后再狀態(tài)去分化為較原始狀態(tài)，隨后再分化為成熟分化為成熟(chngsh)(chngsh)的其他類型細(xì)胞，的其他類型細(xì)胞，“克隆羊多利克隆羊多利”明明確顯示確顯示細(xì)胞的遺傳信息可以被再程序化，體細(xì)胞可以去分化細(xì)胞的遺傳信息可以被再程序化，體細(xì)胞可以去分化成為多能干細(xì)胞成為多能干細(xì)胞. . q低等脊椎動物的研究，顯示損傷部位可以出現(xiàn)與胚胎低等脊椎動物的研究，顯示損傷部位可以出現(xiàn)與胚胎發(fā)育類似的未分化細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)，嶸螺的研究表明發(fā)育類似的

10、未分化細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)，嶸螺的研究表明(biomng)(biomng)其通過局部已分化終末細(xì)胞去分化完成修復(fù)功能其通過局部已分化終末細(xì)胞去分化完成修復(fù)功能. . 第十二頁，共五十一頁。 分化分化就是受精卵發(fā)育成成體的過程中，細(xì)胞完成結(jié)構(gòu)功能定向改變的過程，實(shí)質(zhì)是基因選擇性表達(dá)的結(jié)果。 去分化去分化就是脫分化，分化細(xì)胞失去其特有結(jié)構(gòu)而變成具有未分化細(xì)胞特征的過程。 在動物中, 去分化細(xì)胞具有胚胎間質(zhì)細(xì)胞的功能。在植物中, 去分化細(xì)胞成為薄壁細(xì)胞, 稱為(chn wi)愈傷組織(callus)。去分化往往隨之又發(fā)生再分化(redifferentiation)。 第十三頁，共五十一頁。第十四頁，共五十一

11、頁。骨髓由不同類型多種細(xì)胞成分組成的組織，除了分化骨髓由不同類型多種細(xì)胞成分組成的組織，除了分化(fnhu)(fnhu)的的血細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞等，還存在兩類成體干細(xì)胞：血細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞等，還存在兩類成體干細(xì)胞： v一類是造血干細(xì)胞（一類是造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell,HSChematopoietic stem cell,HSC）, ,能生成能生成(shn chn)(shn chn)各種血細(xì)胞；各種血細(xì)胞； v另一類是間質(zhì)干細(xì)胞（另一類是間質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cellmesenchymal stem cell，MSCMSC），），能生成內(nèi)皮細(xì)胞

12、、脂肪細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等。能生成內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等。 v體外培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞，體外培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞，HSCHSC細(xì)胞呈懸浮集落生長，而細(xì)胞呈懸浮集落生長，而MSCMSC細(xì)細(xì)胞則貼壁生長，通過換液很容易把兩者分開。胞則貼壁生長，通過換液很容易把兩者分開。 第十五頁，共五十一頁。v間質(zhì)干細(xì)胞間質(zhì)干細(xì)胞 q證明可分化為包括骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪證明可分化為包括骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪(zhfng)(zhfng)細(xì)胞細(xì)胞和肌肉細(xì)胞等，也能分化成內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)胚層的肝細(xì)胞。和肌肉細(xì)胞等，也能分化成內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)胚層的肝細(xì)胞。 q當(dāng)當(dāng)MSCMSC細(xì)胞移植入小劑量射線照射的宿主，則造血系統(tǒng)和胃腸細(xì)胞移植

13、入小劑量射線照射的宿主，則造血系統(tǒng)和胃腸道組織道組織(zzh)(zzh)有所增多，表明有所增多，表明MSCMSC細(xì)胞在異常環(huán)境中，細(xì)胞分化細(xì)胞在異常環(huán)境中，細(xì)胞分化的可塑性增加。的可塑性增加。 第十六頁，共五十一頁。v造血造血(zo xu)(zo xu)干細(xì)胞干細(xì)胞 qHSCHSC移植至不同的體內(nèi)微環(huán)境，可分化為移植至不同的體內(nèi)微環(huán)境，可分化為3 3個胚層的各種類型細(xì)個胚層的各種類型細(xì)胞，包括心肌、骨骼肌、血管胞，包括心肌、骨骼肌、血管(xugun)(xugun)內(nèi)皮系統(tǒng)、肝細(xì)胞、肺泡、食道內(nèi)皮系統(tǒng)、肝細(xì)胞、肺泡、食道、腸道、胃、膽管以及皮膚和神經(jīng)細(xì)胞等。、腸道、胃、膽管以及皮膚和神經(jīng)細(xì)胞等。

14、 qHSCHSC細(xì)胞在體外培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在體外培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)(fxin)(fxin)血細(xì)胞系之間，即淋巴細(xì)胞系血細(xì)胞系之間，即淋巴細(xì)胞系與髓性細(xì)胞系之間和系內(nèi)也存在分化方向的轉(zhuǎn)變。與髓性細(xì)胞系之間和系內(nèi)也存在分化方向的轉(zhuǎn)變。 第十七頁，共五十一頁。Hematopoiesis 造血(zo xu)Hematopoietic stem cellCommon lymphoid progenitor （淋巴(ln b)系）Common myeloid progenitor （髓系）NK cellB cellT cellGran/Mac progenitorErythro/Plt progenitorRB

15、CPlateletmacrophageneutrophilbasophileosinophil第十八頁，共五十一頁。q神經(jīng)系統(tǒng)中一類能自我更新，并產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)中一類能自我更新，并產(chǎn)生(chnshng)(chnshng)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞。細(xì)胞的前體細(xì)胞。 q主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(xtng)(xtng)的兩個神經(jīng)發(fā)生區(qū)域：腦的的兩個神經(jīng)發(fā)生區(qū)域：腦的海馬區(qū)和次腦室區(qū)，以及包括脊髓等其他非神經(jīng)性的區(qū)域。海馬區(qū)和次腦室區(qū)，以及包括脊髓等其他非神經(jīng)性的區(qū)域。 第十九頁，共五十一頁。q通過個體發(fā)育不同階段通過個體發(fā)育不同階段(jidun)(jidun)

16、的神經(jīng)干細(xì)胞移植至宿主不同的神經(jīng)干細(xì)胞移植至宿主不同部位，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞移植分化為神經(jīng)細(xì)胞的潛能具有發(fā)育階部位，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞移植分化為神經(jīng)細(xì)胞的潛能具有發(fā)育階段段(jidun)(jidun)的依賴性，說明成體中的神經(jīng)干細(xì)胞分化潛能受到一的依賴性，說明成體中的神經(jīng)干細(xì)胞分化潛能受到一定的限制。定的限制。 q19991999年，年，BjornsonBjornson將從成年小鼠腦組織分離將從成年小鼠腦組織分離(fnl)(fnl)的神經(jīng)干細(xì)胞移的神經(jīng)干細(xì)胞移植入經(jīng)植入經(jīng)X X射線照射過的小鼠骨髓部位，分化出血液細(xì)胞，開創(chuàng)射線照射過的小鼠骨髓部位，分化出血液細(xì)胞，開創(chuàng)了成體干細(xì)胞跨越組織或胚層分化研究

17、的先例。了成體干細(xì)胞跨越組織或胚層分化研究的先例。 第二十頁，共五十一頁。q對肝干細(xì)胞存在與否的問題對肝干細(xì)胞存在與否的問題(wnt)(wnt)一直有爭論。一直有爭論。 q對發(fā)育中的肝臟具有自我更新能力的細(xì)胞進(jìn)行單克隆培養(yǎng)和對發(fā)育中的肝臟具有自我更新能力的細(xì)胞進(jìn)行單克隆培養(yǎng)和分析，證明其內(nèi)的卵圓形細(xì)胞在體外能大量分析，證明其內(nèi)的卵圓形細(xì)胞在體外能大量(dling)(dling)增殖，細(xì)胞移增殖，細(xì)胞移植后可分化，表明肝卵圓形細(xì)胞是肝干細(xì)胞，具有分化為肝細(xì)植后可分化，表明肝卵圓形細(xì)胞是肝干細(xì)胞，具有分化為肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的雙潛能性。胞和膽管上皮細(xì)胞的雙潛能性。 第二十一頁，共五十一頁。q肝干

18、細(xì)胞的鑒定肝干細(xì)胞的鑒定(jindng)(jindng) 肝干細(xì)胞本身缺乏特異性標(biāo)志肝干細(xì)胞本身缺乏特異性標(biāo)志(biozh)(biozh)，分離和鑒定帶來了困難。，分離和鑒定帶來了困難。 雙潛能的肝干細(xì)胞雙潛能的肝干細(xì)胞(xbo)(xbo)同時表達(dá)肝細(xì)胞同時表達(dá)肝細(xì)胞(xbo)(xbo)和膽上皮細(xì)胞和膽上皮細(xì)胞(xbo)(xbo)的的標(biāo)志物，細(xì)胞標(biāo)志物，細(xì)胞(xbo)(xbo)角蛋白角蛋白CK7CK7和和CK19CK19為膽上皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志；為膽上皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志； 白蛋白白蛋白(ALB)(ALB)、甲胎蛋白甲胎蛋白(AFP)和肝代謝酶細(xì)胞色素和肝代謝酶細(xì)胞色素P450P450可可 作特

19、異性標(biāo)志物；作特異性標(biāo)志物； 細(xì)胞角蛋白細(xì)胞角蛋白CK8CK8和和CK18CK18在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和膽上皮細(xì)胞都有表達(dá)。在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和膽上皮細(xì)胞都有表達(dá)。肝干細(xì)胞一般除了其特有的形態(tài)學(xué)外，常結(jié)合上述特有標(biāo)志，通過肝干細(xì)胞一般除了其特有的形態(tài)學(xué)外，常結(jié)合上述特有標(biāo)志，通過免疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞檢測和原位雜交等方法予以鑒定。免疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞檢測和原位雜交等方法予以鑒定。 第二十二頁，共五十一頁。q肝干細(xì)胞的可塑性肝干細(xì)胞的可塑性 雙潛能卵圓形細(xì)胞不僅能分化為肝細(xì)胞和膽上皮細(xì)胞，當(dāng)分別移雙潛能卵圓形細(xì)胞不僅能分化為肝細(xì)胞和膽上皮細(xì)胞，當(dāng)分別移植到胰腺和十二指腸時，還能跨組織分化為胰腺細(xì)胞和腸上皮細(xì)

20、胞植到胰腺和十二指腸時，還能跨組織分化為胰腺細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞，表明肝干細(xì)胞在適當(dāng)，表明肝干細(xì)胞在適當(dāng)(shdng)(shdng)的微環(huán)境中能被誘導(dǎo)分化為內(nèi)胚層的其的微環(huán)境中能被誘導(dǎo)分化為內(nèi)胚層的其他組織細(xì)胞，目前，還未見有跨胚層分化的直接例證。他組織細(xì)胞，目前，還未見有跨胚層分化的直接例證。 卵圓形細(xì)胞異常卵圓形細(xì)胞異常(ychng)(ychng)分化或分化突然停止有可能發(fā)生肝細(xì)胞癌。分化或分化突然停止有可能發(fā)生肝細(xì)胞癌。 第二十三頁，共五十一頁。q肌肉的生長、更新和修復(fù)是由衛(wèi)星細(xì)胞肌肉的生長、更新和修復(fù)是由衛(wèi)星細(xì)胞(xbo)(xbo)（satellite cellssatellite cel

21、ls）介導(dǎo)的，一般認(rèn)為這就是骨骼肌干細(xì)胞。）介導(dǎo)的，一般認(rèn)為這就是骨骼肌干細(xì)胞。 q近年的研究表明，從肌肉分離的干細(xì)胞不僅能分化出肌肉，近年的研究表明，從肌肉分離的干細(xì)胞不僅能分化出肌肉，還能產(chǎn)生還能產(chǎn)生(chnshng)(chnshng)血液細(xì)胞成分。血液細(xì)胞成分。 q骨骼肌干細(xì)胞不僅存在于骨骼肌組織，而且具有分化的可骨骼肌干細(xì)胞不僅存在于骨骼肌組織，而且具有分化的可塑性，甚至塑性，甚至(shnzh)(shnzh)跨越胚層分化為肝細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞?？缭脚邔臃只癁楦渭?xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞。 第二十四頁，共五十一頁。第二十五頁，共五十一頁。v近年的研究已表明間質(zhì)干細(xì)胞（近年的研究已表明間質(zhì)干細(xì)胞（MSCM

22、SC）能向軟骨、骨、脂）能向軟骨、骨、脂肪、造血基質(zhì)和神經(jīng)元樣等細(xì)胞分化，使其首選為組織工程肪、造血基質(zhì)和神經(jīng)元樣等細(xì)胞分化，使其首選為組織工程(gngchng)(gngchng)中的種子細(xì)胞。中的種子細(xì)胞。 v最初最初(zuch)(zuch)，用含血清的完全培養(yǎng)基或無血清化學(xué)限定性，用含血清的完全培養(yǎng)基或無血清化學(xué)限定性培養(yǎng)液使孵化培養(yǎng)液使孵化4.54.5日齡雞胚肢芽的骨髓日齡雞胚肢芽的骨髓MSCMSC原代培養(yǎng)獲得成原代培養(yǎng)獲得成功。功。 v隨后，大鼠、人和兔的骨髓隨后，大鼠、人和兔的骨髓MSCMSC原代和繼代培養(yǎng)也有進(jìn)展。原代和繼代培養(yǎng)也有進(jìn)展。 第二十六頁，共五十一頁。取大鼠股骨，取大鼠

23、股骨，TyrodesTyrodes液洗滌液洗滌(xd)(xd)干凈干凈 用注射器吸用注射器吸10ml10ml含血清的含血清的DMEMDMEMLGLG培養(yǎng)液，將針頭插入除去培養(yǎng)液，將針頭插入除去骨骺后的股骨一端骨骺后的股骨一端(ydun)(ydun)的骨髓腔，注入培養(yǎng)液的骨髓腔，注入培養(yǎng)液 從骨的另一端收集，反復(fù)抽吸，打散成細(xì)胞懸液從骨的另一端收集，反復(fù)抽吸，打散成細(xì)胞懸液調(diào)節(jié)有核細(xì)胞密度至調(diào)節(jié)有核細(xì)胞密度至5 510107 7個個/ml/ml，接種到直徑為，接種到直徑為10mm10mm的培養(yǎng)的培養(yǎng)皿中皿中 37,5%CO2 37,5%CO2 每隔每隔3 34 4天換液一次，一般經(jīng)天換液一次，一

24、般經(jīng)2 2周左右可形成一些較大的細(xì)周左右可形成一些較大的細(xì)胞克隆胞克隆 第二十七頁，共五十一頁。o原代培養(yǎng)物中多為成纖維樣細(xì)胞，紅細(xì)胞在此培養(yǎng)液中不能存活，而且原代培養(yǎng)物中多為成纖維樣細(xì)胞，紅細(xì)胞在此培養(yǎng)液中不能存活，而且(r qi)(r qi)不不貼壁，通過換液而洗除。貼壁，通過換液而洗除。 oMSCMSC中混雜的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞，造血細(xì)胞等，由于中混雜的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞，造血細(xì)胞等，由于(yuy)(yuy)它們的貼壁黏附能它們的貼壁黏附能力不同，通過調(diào)整胰蛋白酶力不同，通過調(diào)整胰蛋白酶EDTAEDTA的消化時間，保證在短暫消化時間內(nèi)，使的消化時間，保證在短暫消化時間內(nèi)，使MSCMSC與

25、培養(yǎng)皿底脫離，而其他細(xì)胞仍貼附于培養(yǎng)皿底，從而使與培養(yǎng)皿底脫離，而其他細(xì)胞仍貼附于培養(yǎng)皿底，從而使MSCMSC在傳代期間進(jìn)一步得到在傳代期間進(jìn)一步得到純化。純化。 第二十八頁，共五十一頁。oMSCMSC生長呈長梭形，成索密集生長呈長梭形，成索密集(mj)(mj)排列。排列。 o鑒定包括鑒定包括(boku)(boku)人在內(nèi)的人在內(nèi)的MSCMSC的直接標(biāo)志物的直接標(biāo)志物SH2SH2、SH3SH3、CD44CD44、CD71CD71、CD94CD94、CD124CD124、CD14CD14、CD34CD34等。等。 o還可通過檢測還可通過檢測(jin c)(jin c)它們成骨和成軟骨能力予以鑒定

26、。它們成骨和成軟骨能力予以鑒定。 第二十九頁，共五十一頁。v胚胎發(fā)育中最早出現(xiàn)造血胚胎發(fā)育中最早出現(xiàn)造血(zo xu)(zo xu)功能的組織是卵黃囊功能的組織是卵黃囊。 v胎兒胎兒(ti r)(ti r)出生前，胚胎肝臟是主要的造血組織，內(nèi)含較多的出生前，胚胎肝臟是主要的造血組織，內(nèi)含較多的造血干細(xì)胞，人胚發(fā)育至造血干細(xì)胞，人胚發(fā)育至6 6個月后，骨髓組織造血功能逐漸明顯，而個月后，骨髓組織造血功能逐漸明顯，而肝臟的造血功能逐漸減少。肝臟的造血功能逐漸減少。 v出生后，造血細(xì)胞主要存在于紅髓內(nèi)。出生后，造血細(xì)胞主要存在于紅髓內(nèi)。 第三十頁，共五十一頁。 紅髓：紅髓：脾臟白髓周圍的區(qū)域，包括脾

27、索和脾竇，脾索含大量B細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，由脾索圍成的脾竇內(nèi)充滿(chngmn)血液。脾索和脾竇壁的巨噬細(xì)胞能吞噬和清除血液中衰老紅細(xì)胞和病原體。 第三十一頁，共五十一頁。脾臟內(nèi)部可分為紅髓及白髓。紅髓的主要功能是過 濾和儲存血液，由脾索及血竇組成，但因?yàn)槠洳缓斎肓馨凸?，所以脾臟不能過濾淋巴的功能。而白髓的主要功能則為對抗外來微生物及感染(gnrn)。 在正常狀態(tài)下一般摸不到脾臟，如果仰臥或右側(cè)臥位可能觸摸到脾臟邊緣即可認(rèn)為是脾大，近年來B超在臨床的廣泛應(yīng)用： 第三十二頁，共五十一頁。引起脾大的原因有： （1）感染性脾大。各種急、慢性感染如傷寒、副傷寒、黑熱病、血吸蟲病、瘧疾

28、、病毒性肝炎、敗血癥、晚期梅毒(mid)等. （2）郁血性脾腫大。斑替氏綜合征、肝硬化、慢性心力衰竭致心原性肝硬化、慢性縮窄性心包炎、門靜脈或脾靜脈血栓形成。 （3）增生性脾大。見于某些血液病如白血病、溶血性貧血、惡性淋巴瘤等。 （4）其它。脾臟惡性腫瘤較罕見、脾臟囊腫、播散性紅斑狼瘡、皮肌炎、結(jié)節(jié)性多動脈炎、高雪氏病等。 因脾臟大原因較復(fù)雜，除少數(shù)人為生理性外，都應(yīng)在醫(yī)生指導(dǎo)下尋找病因，并要定期復(fù)查。 第三十三頁，共五十一頁。v神經(jīng)神經(jīng)(shnjng)(shnjng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)和建系，必須滿足兩個基本條件：干細(xì)胞體外培養(yǎng)和建系，必須滿足兩個基本條件： q具有永生具有永生(yngshng)

29、(yngshng)化特性化特性即在細(xì)胞周期內(nèi)不斷地復(fù)制增殖，產(chǎn)生大量子代細(xì)胞；即在細(xì)胞周期內(nèi)不斷地復(fù)制增殖，產(chǎn)生大量子代細(xì)胞； q具有神經(jīng)干細(xì)胞世系遺傳顯性特性具有神經(jīng)干細(xì)胞世系遺傳顯性特性 即神經(jīng)干細(xì)胞表型，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境和條件下，它可分化為神經(jīng)元和包即神經(jīng)干細(xì)胞表型，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境和條件下，它可分化為神經(jīng)元和包括星形細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞及括星形細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞及SchwannsSchwanns細(xì)胞等在內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)細(xì)胞等在內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。胞。 第三十四頁，共五十一頁。q早期胚胎的神經(jīng)早期胚胎的神經(jīng)(shnjng)(shnjng)管和神經(jīng)管和神經(jīng)(shnjng)(shnjng)嵴或胎兒的腦嵴或

30、胎兒的腦組織是體外培養(yǎng)神經(jīng)組織是體外培養(yǎng)神經(jīng)(shnjng)(shnjng)干細(xì)胞的最理想材料來源。干細(xì)胞的最理想材料來源。 q首要問題是維持其分裂、增殖首要問題是維持其分裂、增殖(zngzh)(zngzh)的能力。的能力。 基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基是一種特定的是一種特定的N2N2液。添加因子有葡萄糖、人胰島素、人轉(zhuǎn)鐵蛋白、液。添加因子有葡萄糖、人胰島素、人轉(zhuǎn)鐵蛋白、黃體酮、二氫氯丁二胺、硒酸鈉、谷氨酰胺和肝素等。黃體酮、二氫氯丁二胺、硒酸鈉、谷氨酰胺和肝素等。 細(xì)胞傳代細(xì)胞傳代時，用手術(shù)刀片沿著神經(jīng)球中間的縱橫軸切割成四等份，則神經(jīng)干細(xì)時，用手術(shù)刀片沿著神經(jīng)球中間的縱橫軸切割成四等份，則神經(jīng)干細(xì)

31、胞可維持穩(wěn)定而快速的生長。胞可維持穩(wěn)定而快速的生長。 第三十五頁，共五十一頁。未分化的神經(jīng)干細(xì)胞一般每隔未分化的神經(jīng)干細(xì)胞一般每隔7 71010天細(xì)胞數(shù)可增加一天細(xì)胞數(shù)可增加一倍，一般可傳倍，一般可傳3535代，歷時代，歷時(l sh)(l sh)一年，在這期間，細(xì)胞系可分一年，在這期間，細(xì)胞系可分化為神經(jīng)元、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞等多能性?；癁樯窠?jīng)元、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞等多能性。 第三十六頁，共五十一頁。限制成體干細(xì)胞應(yīng)用的主要因素限制成體干細(xì)胞應(yīng)用的主要因素(yn s)(yn s)是來源困難是來源困難 成體干細(xì)胞在體外傳代中成體干細(xì)胞在體外傳代中端粒酶活性很快下降端粒酶活性很快

32、下降(xijing)(xijing)，可能是造成成體干細(xì)胞不能在體外大量擴(kuò)增的主，可能是造成成體干細(xì)胞不能在體外大量擴(kuò)增的主要原因要原因. . 第三十七頁，共五十一頁。1 1、異質(zhì)性、異質(zhì)性 2 2、干細(xì)胞所處環(huán)境、干細(xì)胞所處環(huán)境(hunjng)(hunjng) 3 3、可塑性的調(diào)控、可塑性的調(diào)控(dio kn)(dio kn) 4 4、分化、分化(fnhu)(fnhu)細(xì)胞的功能細(xì)胞的功能 5 5、體外增殖、體外增殖 第三十八頁，共五十一頁。1 1、異質(zhì)性（、異質(zhì)性（heterogeneityheterogeneity） o指由于不同遺傳機(jī)制而產(chǎn)生指由于不同遺傳機(jī)制而產(chǎn)生(chnshng)(

33、chnshng)相同或類似的表現(xiàn)型。異質(zhì)性相同或類似的表現(xiàn)型。異質(zhì)性在某種程度上是干細(xì)胞固有的特性。在某種程度上是干細(xì)胞固有的特性。 o成體干細(xì)胞的可塑性是否與干細(xì)胞異質(zhì)性直接相關(guān)？一種干細(xì)胞與成體干細(xì)胞的可塑性是否與干細(xì)胞異質(zhì)性直接相關(guān)？一種干細(xì)胞與其組織來源及歸宿其組織來源及歸宿(u xi)(u xi)之間的確切關(guān)系？等，還需要深入的研究。之間的確切關(guān)系？等，還需要深入的研究。 第三十九頁，共五十一頁。2 2、干細(xì)胞所處環(huán)境、干細(xì)胞所處環(huán)境(hunjng)(hunjng) o環(huán)境的信號對干細(xì)胞的分化命運(yùn)環(huán)境的信號對干細(xì)胞的分化命運(yùn)(mngyn)(mngyn)有著重要影響。有著重要影響。 如

34、，小鼠造血干細(xì)胞和胰腺干細(xì)胞都能分化出肝細(xì)胞，并能修復(fù)小鼠受如，小鼠造血干細(xì)胞和胰腺干細(xì)胞都能分化出肝細(xì)胞，并能修復(fù)小鼠受損的肝組織，但，移植造血干細(xì)胞和胰腺干細(xì)胞對修復(fù)小鼠受損的肝組損的肝組織，但，移植造血干細(xì)胞和胰腺干細(xì)胞對修復(fù)小鼠受損的肝組織的效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)比移植成熟織的效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)比移植成熟(chngsh)(chngsh)肝干細(xì)胞本身差得多。肝干細(xì)胞本身差得多。 o干細(xì)胞在接受亞致死劑量照射等異常環(huán)境下被觀察到干細(xì)胞在接受亞致死劑量照射等異常環(huán)境下被觀察到“可塑性可塑性”現(xiàn)象，人們還難以解釋?，F(xiàn)象，人們還難以解釋。 第四十頁，共五十一頁。3 3、可塑性調(diào)控、可塑性調(diào)控(dio (dio kn)k

35、n) 外源性外源性內(nèi)源性內(nèi)源性v體液因子、同種或異種細(xì)胞的接觸、細(xì)胞外基質(zhì)等的作用體液因子、同種或異種細(xì)胞的接觸、細(xì)胞外基質(zhì)等的作用v大多數(shù)干細(xì)胞的可塑性研究是基于組織損傷而造成大多數(shù)干細(xì)胞的可塑性研究是基于組織損傷而造成(zo chn)(zo chn)的微環(huán)境的微環(huán)境一般認(rèn)為轉(zhuǎn)錄一般認(rèn)為轉(zhuǎn)錄(zhun l)(zhun l)因子在其中起著重要的作用。因子在其中起著重要的作用。尚在尚在起步階段起步階段第四十一頁，共五十一頁。成體干細(xì)胞成體干細(xì)胞“可塑性可塑性”調(diào)控調(diào)控(dio kn)(dio kn)的解釋的解釋( (4 4種種) )： q機(jī)體中存在著多種來源機(jī)體中存在著多種來源(liyun)(l

36、iyun)和不同分化方向的成體和不同分化方向的成體干細(xì)胞群體，能定向地向各自的組織來源干細(xì)胞群體，能定向地向各自的組織來源(liyun)(liyun)的細(xì)胞分化的細(xì)胞分化； q機(jī)體中存在著一種多潛能的成體機(jī)體中存在著一種多潛能的成體(chn t)(chn t)干細(xì)胞，在不同的微干細(xì)胞，在不同的微環(huán)境信號刺激下，可向不同組織的細(xì)胞方向分化；環(huán)境信號刺激下，可向不同組織的細(xì)胞方向分化； 第四十二頁，共五十一頁。q特定特定(tdng)(tdng)組織來源的成體干細(xì)胞，除了向該組織的細(xì)胞分組織來源的成體干細(xì)胞，除了向該組織的細(xì)胞分化外，在特殊信號的刺激下，可重新編程，繼續(xù)分化為其他類型化外，在特殊信號

37、的刺激下，可重新編程，繼續(xù)分化為其他類型的細(xì)胞；的細(xì)胞； q某種成體干細(xì)胞與特定組織來源的干細(xì)胞發(fā)生融合，某種成體干細(xì)胞與特定組織來源的干細(xì)胞發(fā)生融合，產(chǎn)生產(chǎn)生(chnshng)(chnshng)具有兩種細(xì)胞的遺傳物質(zhì)且染色體數(shù)量也是正具有兩種細(xì)胞的遺傳物質(zhì)且染色體數(shù)量也是正常細(xì)胞兩倍的常細(xì)胞兩倍的“雜交細(xì)胞雜交細(xì)胞”，因而獲得了后者的分化潛能，因而獲得了后者的分化潛能。 第四十三頁，共五十一頁。4 4、分化、分化(fnhu)(fnhu)細(xì)胞的功能細(xì)胞的功能 v檢測終末分化檢測終末分化(fnhu)(fnhu)細(xì)胞的特定蛋白或標(biāo)志物的表達(dá)，很少細(xì)胞的特定蛋白或標(biāo)志物的表達(dá)，很少檢測終末分化檢測終

38、末分化(fnhu)(fnhu)細(xì)胞的功能，有些不同類型的細(xì)胞卻具有細(xì)胞的功能，有些不同類型的細(xì)胞卻具有相同的標(biāo)志。相同的標(biāo)志。 v檢測到某種標(biāo)志檢測到某種標(biāo)志(biozh)(biozh)就證明該細(xì)胞或組織具有正常功能持有就證明該細(xì)胞或組織具有正常功能持有質(zhì)疑質(zhì)疑，特別是干細(xì)胞的異質(zhì)性和類型以及環(huán)境的復(fù)雜性使得，特別是干細(xì)胞的異質(zhì)性和類型以及環(huán)境的復(fù)雜性使得人們對體外培養(yǎng)的干細(xì)胞移植入體內(nèi)能否發(fā)揮預(yù)期功能表示人們對體外培養(yǎng)的干細(xì)胞移植入體內(nèi)能否發(fā)揮預(yù)期功能表示懷疑。懷疑。 v要確定供體干細(xì)胞的終末分化狀態(tài)，應(yīng)該基于細(xì)胞要確定供體干細(xì)胞的終末分化狀態(tài)，應(yīng)該基于細(xì)胞表面標(biāo)表面標(biāo)志的鑒別志的鑒別和和細(xì)胞功能細(xì)胞功能證明這兩方面的依據(jù)。證明這兩方面的依據(jù)。 第四十四頁，共五十一頁。5 5、體外增殖、體外增殖(zngzh)(zngzh) v尚無有效的能較長期在體外維持未分化狀態(tài)并大量增殖的尚無有效的能較長期在體外維持未分化狀態(tài)并大量增殖的體外培養(yǎng)體外培養(yǎng)(piyng)(piyng)方法。方法。 v大多數(shù)成體干細(xì)胞是用于再生醫(yī)學(xué)大多數(shù)成體干細(xì)胞是用于再生醫(yī)學(xué)(yxu)(yxu)作細(xì)胞治療的目的作細(xì)胞治療的目的，通常設(shè)計使用兩種手段：，通常設(shè)計使用兩種手段： q將分離的成體干細(xì)胞直接移植入動物或病人的損害組織器官，將分離