脊髓損傷基因治療的研究進展

1、脊髓損傷基因治療的研究進展    關鍵詞： 脊髓損傷 基因治療 1990年美國首次成功地進行腺苷脫胺酸（ adenosine deam inase， aDA）缺乏的基因治療（ gene therapy）以來，基因治療已成為當前生物醫(yī)學中進展最快的領域之一1?；蛑委熢诩顾钃p傷（ spinal cordIn-jury， sCI）后軸突再生中亦可望成為有效的手段之一25。利用外源基因在靶細胞（包括神經(jīng)元）中的表達，以改變神經(jīng)元某些內在特性，從而進一步探索 sCI后神經(jīng)元的存活能力，再生特性和功能恢復的分子機理，最終為 sCI的治療探討新途徑是目前治療 sCI

2、的研究方向。它有助于把 sCI治療提到一個新的水平。值得我們進一步研究。一、 sCI基因治療有關分子生物學基礎基因轉移（ gene transrer）是實現(xiàn)基因治療的關鍵技術6。因此，基因治療的首要步驟是轉導基因的分子構建。一般轉導基因由目的基因 cDNA，啟動子增強子和載體三部分組成。目的基因重組時除本身特有的（ cD-NA）序列外，通常還需進行必要的修飾，如轉錄起始修飾，翻譯起始，內含子和聚腺苷酸化信號等的修飾。用于重組的啟動子增強子，一般有三種：強組成型（ strongconstita-tive），管家型（ housekeeping），及組織持異型啟動子（ tissuesepcific）

3、，其中最常用為第一型7。理想的體內基因轉移載體要求：轉移具有細胞靶向性，導入基因的表達可調控，而且轉移的方法簡便易行。用于 sCI的基因轉移載體主要是逆轉錄病毒載體（ retroviralvector），即乳腺病毒、莫羅尼小鼠白血病病毒和勞斯肉瘤病毒等。構建轉錄病毒載體的基本原理是：病毒的長末端重復序列（ longterrminalrepeat， lTR）可以對插入的外源基因進行有效轉錄，這樣先在體外構建反轉錄病毒前病毒 dNA載體，即酶切去除基因組中的反式作用區(qū)域（ gag， polenv基因區(qū)域），產(chǎn)生缺陷型的反轉錄病毒，這種病毒只具有控制感染和整合的序列（即順式作用區(qū)域）。缺陷型病毒載體

4、必須依賴包裝細胞提供的蛋白質才能完成包裝，產(chǎn)生帶有外源基因的偽病毒。它能感染受體細胞，載體 dNA將依靠其 lTR整合入受體細胞染色體基因組，這樣外源基因被帶入宿主細胞并得以表達2、3、6、7。逆轉錄病毒載體感染率高，最常用于體外間接基因治療，其缺點是要求靶細胞必須有增殖和分裂特性8。此外， cao（1995）9等研究用陽離子脂質體直接注入 cNS作基因轉移獲得成功。但因陽離子脂質體對 cNS有毒性，故目前致力于發(fā)展非病毒技術，一種陽離子多聚體一聚乙烯亞胺（ polyetnyl enimine）業(yè)已用于基因轉移10。另有 selle6（1993）等報道的復制缺陷腺病毒也是一種適用于神經(jīng)系統(tǒng)的理

5、想載體。在 sCI治療中，由于受體細胞要植入脊髓內，因此所用受體細胞應當符合一定的標準4、6：容易獲取和繁殖；移植后能長期存活且能繼續(xù)分裂和具有活力。無免疫源性及形成腫瘤的危險。目前已用于 sCI試驗有雪旺氏細胞（ schwann cell， sC）和成纖維細胞2、3、11。此外，肌母細胞也是具有應用前景的較好受體細胞，研究表明肌母細胞轉移至 cNS至少可活6個月，且無腫瘤源性12?；蛑委煹膶嵤?，有賴于將目的基因準確、高效地轉入靶細胞，并使之安全，高效和可控地表達?；蛑委熤谢蜣D移的策略主要有兩種，即活體外法（ exvivo approach）和在體法（ invivo approach）。

6、活體外法就是在體外先對適當細胞進行遺傳修飾，使其表達和分泌特定的重組蛋白，然后將修飾細胞移植入活體神經(jīng)組織，通過神經(jīng)遞質替代或神經(jīng)營養(yǎng)因子（ neurotrophic factor， nTF）和其它治療因子的引入恢復正常的神經(jīng)功能。這種方法尤其適于因缺乏 nTF或神經(jīng)遞質前體分子等可擴散物質所致的 cNS疾病。如帕金森氏病（ parkinson s diesease， pD）及 cNS損傷。在體法是利用適當?shù)闹亟M病毒或化學基因轉移載體將目的基因及有治療作用的重組蛋白直接轉移，效率較低，故較少采用。此外，活體外法可采用自體的工程細胞移植，在體外可對高表達細胞克隆進行篩選，有效的控制移植細胞的數(shù)量

7、和質量，應用立體定位和成像技術可以將工程細胞十分準確地移植到 cNS特定的區(qū)域內，以保證在局部產(chǎn)生高濃度的治療因子。二、基因治療 sCI的現(xiàn)狀和展望基因治療 sCI尚處于實驗探索階段。目前，主要是采用 nTF基因修飾雪旺氏細胞（ sC）或成纖維細胞后再將其植入鼠的脊髓損傷區(qū)，觀察其軸突再生的情況2、3、11。 tuszyski（1994）11將 nGF基因導入培養(yǎng)的 sC內，再將 sC移植到損傷的脊髓，發(fā)現(xiàn) sC在體內能穩(wěn)定地表達 nGF并促進軸突的再生。同年 tuszynski等2利用來源于莫洛氏鼠白血病的逆轉錄病毒載體，將人的 nGF基因導入鼠成纖維細胞中，再將成纖維細胞移植到半橫貫損傷的

8、鼠脊髓中（ t7平面）。1年后成纖維細胞仍能表達 nGF，電鏡及免疫組化（ cGRP）檢查，發(fā)現(xiàn)有大量的脊髓軸突再生（感覺纖維）。1996年， tuszynski等3采用同樣方法，又將 nGF基因導入成纖維細胞中，并將其移植到半橫斷損傷的鼠脊髓中（ t7平面），14月后，通過 rT pCR技術鑒定成纖維細胞仍表達 nGF。電鏡、免疫組化（ gFAP、 cHAT、 tH、5 hT， cGRP）檢查發(fā)現(xiàn)有大量的（感覺和運動）軸突再生。作者在國際上首次構造 po5 flanking介導的21.5KD髓鞘堿性蛋白微基因（暫命名為 pSVPoMcat）的基礎上，通過陽離子脂質體導入 sC中，然后再將基因

9、修飾的 sC移植入成鼠半橫斷損傷脊髓，觀察其對 sCI的再生修復作用，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn) pSVPoMcat微基因修飾 sC對 sCI后細胞凋亡有抑制作用13。當然利用基因轉移技術治療 sCI，目前還存在一些尚待解決的問題，第一是免疫排斥反應6，即宿主移植細胞的免疫排斥。因為盡管 cNS的免疫應答能力微弱，但對抗原較強的或種屬相關較遠的受體細胞，仍具有免疫排斥反應，因此，在細胞移植時應給予免疫抑制劑，最好使用自體工程細胞移植。亦可采用免疫隔離（ immuno isolation）法即使用微囊包膜（ mincroencapsulat）的工程細胞14。第二是移植細胞的長時間存活問題。因為在細胞移植部位，宿主

10、內源性細胞系統(tǒng)對局部組織損傷的病理生理反應過程可能使部分移植細胞死亡。如果移植入外來組織細胞的體積較大，還可能對宿主組織及細胞產(chǎn)生機械性擠壓，從而影響其結構與功能的完整性，因此，在移植方式上應該使用微移植（ microtransplantation， mit）技術。 nikknak（1994）15曾采用外徑僅5070 m微管的點移植量為0.2 l，而細胞密度很大（每微升達125.0個），達到以盡可能小的量，移植盡可能多的細胞則對宿主造成的創(chuàng)傷亦小。第三是遺傳修飾細胞移植后轉移基因的表達可能會隨著時間的延長而逐漸下降，以致失去治療作用。故而利用內源性或外源性調節(jié)因子主動調節(jié)轉移基因的表達極為重要15。綜上所述，在 sCI的再生修復治療中，盡管基因轉移所取得的結果均來自實驗報告，但卻具有十分誘人的臨床應用前景。隨著分子生物學的發(fā)展，我們可以把有絲分裂促進劑的基因插入在成熟神經(jīng)元的基因組、成熟神經(jīng)元便有可能一改不能分裂