多抗制備方案[1]

1、兔多抗制備方案一、材料(一)動物：健康成年家兔，雄性，體重23公斤。(二)器材：剪刀、鑷子、注射器(2ml、50ml)附針頭(16號、12號、9號)、稱量瓶(10ml)、量筒、動物固定架、滅菌三角燒瓶(200ml)、手術器械一套、血管夾、黑絲線、塑料放血管等。(三)試劑1.滅菌生理鹽水；2.抗原：合成多肽（5mg）凍干粉；純化蛋白5mg/ml；（凍干粉可以先加入1ml滅菌生理鹽水稀釋成5mg/ml，使用時在取適量；也可以按實際情況使用，節(jié)約使用）3.75%酒精；4.弗氏完全佐劑（FCA）sigma產(chǎn)品；5. 弗氏不完全佐劑(FIA) sigma產(chǎn)品；二、免疫方法抗原劑量為1mg/每只每次，具體

2、方法如下：1用剪刀剪去家兔兩后腳掌的部分兔毛，以75%酒精消毒皮膚；2第一次免疫:將1mgIgG抗原用生理鹽水稀釋至0.5ml，再加入等體積的弗氏完全佐劑(即FCA 0.5ml)，用2ml注射器充分混勻后于兩只后足墊(即腳掌皮下)0.5ml；3第二次免疫：與第一次間隔10-14天，將1mgIgG抗原用生理鹽水稀釋至0.5ml，再加入等體積的弗氏不完全佐劑(即FIA 0.5ml)，用2ml注射器充分混勻后于背部皮下多點注射，每點注射0.1ml；4第三次免疫：與第二次間隔10-14天, 注射部位、劑量均同第二次；5與第三次免疫間隔5-7天后，從耳靜脈采血0.51.0ml，分離血清，以雙相瓊脂擴散試

3、驗測定免疫血清的抗體效價(即試血)。效價至少應達到116以上時才能放血。6若效價未達到要求，可用不加佐劑的抗原液(鼠IgG)耳靜脈內(nèi)注射免疫。即于1周內(nèi)注射3次，分別為0.1、0.3、0.5ml。間隔1周再試血。如效價達到要求應立即放血。三、放血(一)心臟采血法1.家兔仰面，四肢縛于動物固定架上(或由助手抓住四肢固定)；2.剪去左胸部兔毛，消毒皮膚；3.用左姆指摸到胸骨劍突處，食指及中指放在右胸處輕輕向左推心臟，并使心臟固定于左胸側位置。然后，以左拇指觸摸心臟搏動最強的部位（一般在第三和第四肋骨之間）；4.用50ml注射器(連接16號針頭)，傾針45°角度，對準心搏最強處刺入心臟抽血

4、；5.將抽取的血液立即注入無菌三角燒瓶中，待凝固后分離血清。(二)頸動脈放血法1.家兔仰臥同上固定。頭部略放低以暴露頸部。剃毛及消毒皮膚；2.沿頸部中線切開皮膚約10cm，分離皮下組織，直至暴露出氣管兩側的胸鎖乳突肌；3.分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織，暴露出頸總動脈后使之游離；4.于動脈下套入兩根黑絲線，分別置于遠心及近心端。結扎遠心端的絲線。近心端的動脈用血管夾夾??；5.用尖頭小剪刀在兩根絲線間的動脈璧上剪一小口，插入塑料放血管。再將近心端的絲線結扎固定于放血管上，以防放血管滑脫；5. 松開血管夾，使血液流入滅菌三角燒瓶中。一般一只家兔可放血80100ml。四、分離血清將三角燒瓶

5、的血置37溫箱1小時，再置4冰箱內(nèi)34小時。待血液凝固血塊收縮后，用毛細滴管吸取血清。于3000rpm離心15分鐘，取上清加入防腐劑(0.01硫柳汞或0.02疊氮鈉，最終濃度)，分裝后置4冰箱中保存?zhèn)溆谩？贵w的具體效價目前可以不用ELIAS做，直接用瓊脂雙向擴散實驗在免疫三次后測下效價是否達到要求即可。弗氏體即弗氏佐劑是目前動物實驗中最常用的佐劑，分為不完全弗氏佐劑和完全弗氏佐劑。不完全弗氏佐劑是液體石蠟與羊毛脂混合而成，組分比為15：1，可根據(jù)需要而定，通常為2：1。不完全佐劑中加卡介苗(最終濃度為220mg/ml)或死的結核分枝桿菌，即為完全弗氏佐劑（FCA）。乳化方法：（1）研磨法：先將

6、佐劑加熱并取適量放入無菌的玻璃研缽內(nèi)，待冷卻后再緩緩滴入等體積的抗原溶液，邊滴邊按同一方向研磨，滴加抗原的速度要慢。待抗原全部加入后，繼續(xù)研磨一段時間，使之成為乳白色粘稠的油包水乳劑。本法適于制備大量的佐劑抗原，缺點是研缽壁上粘附大量乳劑，抗原損失較大。（2）注射器混合法：將等量的弗氏佐劑和抗原溶液分別吸入兩個注射器內(nèi)，兩注射器之間以一細膠管相連，注意排凈空氣，然后交替推動針管，直至形成粘稠的乳劑為止。本法優(yōu)點是容易做到無菌操作，抗原損失少，適用于制備少量的抗原乳劑。但同時難以乳化完全，個別抗原，用塑料注射器根本推不動，而用玻璃注射器又有滲漏。制備好的乳化劑經(jīng)鑒定才能適用。鑒定方法是將乳化劑滴

7、入冷水中，若保持完整不分散，成滴狀浮于水面，即乳化完全，為合格的油包水劑。（3）超聲：實驗室條件好點的，比如說有超聲破碎儀的，一定要控制超聲頻率和時間，超聲容易激發(fā)一些自由基，對抗原有未知損害。乳化方法要根據(jù)抗原和需要而定。瓊脂雙擴散試驗一、原理在溶液中的可溶性多價抗原與血清抗體相遇，當兩者的比例適當時可以形成一種網(wǎng)狀的不溶性的大分子復合物，發(fā)生免疫沉淀反應。當這樣的抗原和相應的抗體在含有電解質(zhì)的瓊脂凝膠中相對擴散時，在抗原與抗體的比例適當處會形成可見的沉淀線。利用這種反應檢測抗原抗體反應的實驗技術叫免疫雙擴散實驗，是免疫沉淀反應的一種。免疫雙擴散常用于動物免疫效果的檢測和血清抗體效價的測定。

8、沉淀線的特征與位置不僅取決于抗原抗體的特異性及相互間濃度比例，而且與其分子大小及擴散速度相關。當抗原抗體存在多種系統(tǒng)時，可呈現(xiàn)多條沉淀線以至交叉反應。二、實驗材料1 抗原：用0.01M PBS （pH7.2）或生理鹽水稀釋成 lmg/mL 人IgG ；2 抗血清：兔抗人IgG 血清；3 實驗試劑：0.01M PBS （pH7.2），1%瓊脂糖；4 實驗用具：11cm培養(yǎng)皿，200µL 微量可調(diào)加樣器及吸頭，1.5mL 無菌尖底離心管，打孔器。三、操作步驟11%瓊脂糖配制：稱取瓊脂糖1g，加入0.01M PBS （pH7.2）100mL ，微波爐中小功率加熱，使瓊脂完全溶化。2倒平板：

9、取干凈11cm培養(yǎng)皿3 個平放于實驗臺（臺面要水平），將融化的 1%瓊脂糖趁熱倒培養(yǎng)皿中（約加15mL），使瓊脂糖厚度達3mm，在室溫下放置使瓊脂糖冷卻凝固。3打孔：將瓊脂糖平板放在畫好的打孔式樣的樣板上，用自制打孔器（內(nèi)徑3-5 毫米）在瓊脂上照樣板打孔，打出兩組呈梅花狀排列的小孔。用針頭小心地將打好的孔中的瓊脂挑出，當心不要碰傷了孔周圍的瓊脂。4抗原稀釋：取1.5mL 無菌尖底離心管6 支排列于離心管架上并做好標記，在每管各加入生理鹽水 50µL，吸取1:10 稀釋的 lmg/mL IgG 50µL 加入第1 管中并充分混勻；自第1 管中吸出 50µL加入第2

10、 管中，經(jīng)充分混勻后吸出50µL加入第3 管中，如此依次 2×稀釋至第 6 管，混勻后吸出 50µL棄去。此時1-6 管所含人IgG 的稀釋度為1:2、1:4、1:8、1:16 、1:32 、1:64 。5抗血清稀釋：取1.5mL 無菌尖底離心管8 支排列于離心管架上并做好標記，在每管各加入生理鹽水 50µL，吸取鼠抗或兔抗人IgG 血清50µL加入第 1 管中并充分混勻；自第 1 管中吸出 50µL加入第 2 管中，經(jīng)充分混勻后吸出50µL加入第 3 管中，如此依次 2×稀釋至第6 管，混勻后吸出 50µ

11、;L棄去。此時 1-6管所含免疫血清的稀釋度為1:2、1:4、1:8、1:16 、1:32 、1:64 。6加樣：在每組呈梅花狀排列的小孔的中央孔中加一滴稀釋抗原約30µL的免疫血清，周圍孔加不同稀釋度抗血清。加樣時將每孔加滿即可，注意不要使溢出孔外。7孵育蓋上培養(yǎng)皿蓋放37溫箱中過夜。8結果觀察將培養(yǎng)皿從塑料盒中取出，在散射光的背景下（培養(yǎng)皿后方約15cm處用手或深色物擋住）觀察，或在凝膠成像系統(tǒng)上用白光光源觀察抗體孔與適當稀釋的抗原孔之間的白色沉淀線，有沉淀線為陽性，否則陰性。ELISA測定兔、鼠抗血清效價（這個目前可以不用做）近幾十年來免疫學分析方法迅猛發(fā)展，特別是在使用抗原和

12、抗體標記分析技術后，檢測敏感性和特異性比原來許多經(jīng)典的免疫學分析方法得到極大提高。上世紀50 年代建立免疫熒光技術（IFA ），60年代放射免疫分析技術（RIA ）出現(xiàn)，在 70 年代初期又建立了酶標記抗原或抗體的分析技術。由于酶的高效生物催化作用，一個酶分子在數(shù)分鐘內(nèi)可以催化幾十、幾百個底物分子發(fā)生反應，產(chǎn)生了放大作用，使得原來極其微乎其微的抗原或抗體在數(shù)分鐘后就可被識別出來，這種技術被稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗法（Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay ，ELISA ），本法自70年代初期由 VA N Wee men和Schuars，Enagvall 和Perlma

13、rn 等相繼分別報道后，現(xiàn)已引起廣泛重視。ELISA 的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，

14、間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。二、實驗材料1 抗原：用0.01M PBS （pH7.2）稀釋成 lmg/mL IgG ；2 抗血清：兔抗人IgG 血清；3 實驗試劑：0.01M PBS （pH7.2），0.01M碳酸鹽緩沖液（1.59 g NaCO3，2.93 g NaHCO3，加 ddH2 O至1000 mL ），0.01M PBST（pH7.2，含 0.05 Tween-20），1%BSA，HRP-羊抗鼠IgG ，HRP-羊抗兔IgG ，TMB/H2O2底物液，2M H2 SO4；4 實驗用具：96 孔酶標板，200µL 微量可調(diào)加樣器及吸頭，5mL 無

15、菌試管，洗板機，酶標儀。三、操作步驟1抗原稀釋：取5mL 無菌試管8 支排列于離心管架上并做好標記，在每管各加入0.01M碳酸緩沖液（pH9.6）2.34mL，吸取260µL lmg/mL 人IgG 加入第1 管中并充分混勻；自第 1 管中吸出1.3mL 加入第2 管中，經(jīng)充分混勻后吸出1.3mL 加入第3 管中，如此依次 2×稀釋至第 8 管，混勻后吸出 1.3mL 棄去。此時1-8 管抗原的稀釋度為 1:20 、1:40 、1:80 、1:160、1:320、1:640、1:1024 、1:2048 。2抗血清稀釋：取5mL 無菌試管12支排列于離心管架上并做好標記，在

16、每管各加入0.01M PBS（pH7.2），0.9mL，吸取1:50 稀釋的鼠抗或兔抗人 IgG 血清0.9mL 加入第1 管中并充分混勻；自第1 管中吸出 0.9mL 加入第2 管中，經(jīng)充分混勻后吸出0.9mL 加入第3 管中，如此依次2×稀釋至第12 管，混勻后吸出 0.9mL棄去。此時 1-12 管所含免疫血清的稀釋度為 1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600 、1:3200 、1:6400 、1:12800、1:51200、1:102400 、1:204800 、1:409600 。3包被酶標板：在96 孔酶標板 A 行各孔加入1:20 稀釋的人 IgG

17、 100µL ，B-H 行各孔依次加入其余各稀釋度的人IgG 100µL ，于37溫浴 1 小時后將酶標板平放在濕盒中4過夜。4封閉取出96孔酶標板，設置程序用洗板機吸凈或甩干各孔中包被液，將 96孔酶標板倒扣在吸水紙上叩干，每孔各加入用0.01M PBST（pH7.2）稀釋的 1%BSA 100µL，37 孵育 1 小時。5洗板取出96 孔酶標板，設置程序用0.01M PBST（pH7.2）洗板機洗酶標板各孔3 次，每次浸泡1min?；蛉斯は窗寮疵靠准訚M0.01M PBST （pH7.2），浸泡 3-5 分鐘，甩干后再重復洗滌操作2 次，將96孔酶標板倒扣在吸水紙上叩干或拍干。6加抗血清：在96孔酶標板 1 列各孔加入1:100 稀釋的人IgG100µL，2-12 列各孔依次加入其余各稀釋度的人IgG100µL，12列最后 4 孔留作對照，H12 不加任何血清留作空白對照、G12 和F12 孔加入未免疫動物血清作陰性對照，E12 孔加入免疫動物未稀釋血清做陽性對照，將酶標板平放在濕盒中37孵育1 小時。7洗板操作同步驟5。8加酶標二抗在9