各種酶切位點的保護堿基引物設(shè)計必看

1、各種酶切位點的保護堿基酶不同，所需要的酶切位點的保護堿基的數(shù)量也不同。一般情況下，在酶切位點以外多出3個堿基即可滿足幾乎所有限制酶的酶切要求。在資料上查不到的，我們一般都隨便加3個堿基做保護。寡核苷酸近末端位點的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides)為了解不同內(nèi)切酶對識別位點以外最少保護堿基數(shù)目的要求，NEB采用了一系列含識別序列的短雙鏈寡核苷酸作為酶切底物進行實驗。實驗結(jié)果對于確定雙酶切順序?qū)袔椭ū热缭诙嘟宇^上切割位點很接近時），或者當(dāng)切割位點靠近DNA末端時也很有用。在本表中沒有列出的酶，則通常

2、需在識別位點兩端至少加上6個保護堿基，以確保酶切反應(yīng)的進行。實驗方法：用-32PATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下標(biāo)記0.1A260單位的寡核苷酸。取1 µg已標(biāo)記了的寡核苷酸與20單位的內(nèi)切酶，在20°C條件下分別反應(yīng)2小時和20小時。反應(yīng)緩沖液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及適量的NaCl或KCl（視酶的具體要求而定）。20%的PAGE（7 M尿素）凝膠電泳分析，經(jīng)放射自顯影確定酶切百分率。本實驗采用自連接的寡核苷酸作為對照。若底物有較長的回文結(jié)構(gòu)，切割效率則可能因為出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)而降低。酶寡核苷酸序列鏈長

3、切割率%2 hr20 hrAcc IGGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 8 10 120 0 00 0 0Afl IIICACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG8 10 120 >90 >900 >90 >90Asc IGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA8 10 12>90 >90 >90>90 >90 >90Ava ICCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA8 10 1250 >90 >90>90 >9

4、0 >90BamH ICGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG8 10 1210 >90 >9025 >90 >90Bgl IICAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC8 10 120 75 250 >90 >90BssH IIGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA8 10 120 0 500 0 >90BstE IIGGGT(A/T)ACCC9010BstX IAACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAA

5、CCAATGCATTGGATGCAT22 24 270 25 250 50 >90Cla ICATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG8 8 10 120 0 >90 500 0 >90 50EcoR IGGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG8 10 12>90 >90 >90>90 >90 >90Hae IIIGGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA8 10 12>90 >90 >90>90 >90 >90Hind

6、 IIICAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG8 10 120 0 100 0 75Kpn IGGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG8 10 120 >90 >900 >90 >90Mlu IGACGCGTC CGACGCGTCG8 100 250 50Nco ICCCATGGG CATGCCATGGCATG8 140 500 75Nde ICCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAA

7、TTCCC8 10 12 18 20 220 0 0 0 75 750 0 0 0 >90 >90Nhe IGGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG8 10 120 10 100 25 50Not ITTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA12 16 20 24 280 10 10 25 250 10 10 90 >90Nsi ITGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCT

8、GCAGTT12 2210 >90>90 >90Pac ITTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG8 10 120 0 00 25 >90Pme IGTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG8 10 12 240 0 0 750 25 50 >90Pst IGCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT8 14 22 24

9、 260 10 >90 >90 00 10 >90 >90 0Pvu ICCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA8 10 120 10 00 25 10Sac ICGAGCTCG81010Sac IIGCCGCGGC TCCCCGCGGGGA8 120 500 >90Sal IGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA28 30 320 10 100 50 75Sca IGAGTACTC AAAAGT

10、ACTTTT8 1210 7525 75Sma ICCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA6 8 10 120 0 10 >9010 10 50 >90Spe IGACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG8 10 12 1410 10 0 0>90 >90 50 50Sph IGGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT8 12 140 0 100 25 50Stu IAAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT8 10 12>

11、90 >90 >90>90 >90 >90Xba ICTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG8 10 12 140 >90 75 750 >90 >90 >90Xho ICCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG8 10 120 10 100 25 75Xma ICCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA8 10 12 140 25 50 >900 75 >90 >902.雙酶切的問題參看目錄，選

12、擇共同的buffer。其實，雙酶切選哪種buffer是實驗的結(jié)果，takara公司從1979年開始生產(chǎn)限制酶以來，做了大量的基礎(chǔ)實驗，也積累了很多經(jīng)驗，目錄中所推薦的雙酶切buffer完全是依據(jù)具體實驗結(jié)果得到的。有共同buffer的，通常按照常規(guī)的酶切體系，在37進行同步酶切。但BamH I在37下有時表現(xiàn)出star活性，常用30單切。兩個酶切位點相鄰或沒有共同 buffer的，通常單切，即先做一種酶切，乙醇沉淀，再做另一種酶切。 3.酶切底物DNA，切不開1）底物DNA上沒有相應(yīng)的限制酶識別位點，或酶切位點被甲基化。2）PCR引物的酶切位點前沒有保護堿基或引物合成有誤，致使沒有正

13、確的酶切位點存在。PCR產(chǎn)物酶切前盡量進行精制以更換buffer。由于PCR產(chǎn)物中帶入的其它物質(zhì)，會影響酶切，據(jù)報道，通常PCR產(chǎn)物的添加量占總反應(yīng)體積25%以下沒有問題。3）酶切條件的確認，包括反應(yīng)溫度和反應(yīng)體系等。同樣的DNA，同樣量，用不同的限制酶切情況可能不同，由于DNA的空間結(jié)構(gòu)造成的。同樣的DNA，不同的反應(yīng)體系，酶切效果也可能不同，由于一些空間因素或不可測因素造成的。4）公司出售的限制酶都是液體狀態(tài)，都是根據(jù)最佳反應(yīng)體系配制了濃度，不可以再用buffer稀釋，因為酶濃度和活性之間不呈直線對應(yīng)關(guān)系，酶濃度越稀，相對活性越低，并且越不穩(wěn)定，有時便會出現(xiàn)底物DNA不能被切斷的現(xiàn)象。不同公司的酶和buffer不要交叉使用，否則可能會影響酶切效果。5）酶的識別位點上的堿基被甲基化?？梢赃x用不受甲基化影響的同裂酶，或?qū)①|(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入甲基化酶欠損的宿主菌中，重新制備DNA，也可以使用PCR的方法對DNA進行擴增，再做酶切。常用的有XbaI容易受甲基化影響，通常選用GM33做宿主菌轉(zhuǎn)化。6）底物不純，含有限制酶阻害物質(zhì)，影響酶切作用，需要重新純化DNA。一般做乙醇沉淀純化即可。如果質(zhì)粒中含鹽或酚等，都會影響酶切效果。 4.DNA經(jīng)酶切后，電泳無帶或出