中性檢驗(yàn)相關(guān)知識(shí)分析

1、（六）檢驗(yàn)分子水平自然選擇的方法在選擇主義與中性主義的爭(zhēng)論中，中性理論提出了很多的假設(shè)，其中的許多涉及到群體內(nèi)等位基因頻率分布，以及種內(nèi)-種間遺傳變異的關(guān)系。因此，可以利用統(tǒng)計(jì)學(xué)模型來(lái)驗(yàn)證中性學(xué)說(shuō)的正確性，即把中性理論作為統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)的零假設(shè)（null hypothesis），非中性選擇作為選擇性假設(shè)（alternative hypothesis），如果這個(gè)零假設(shè)被顯著地拒絕（significantly rejected），那么中性假設(shè)將被認(rèn)為是不合適的（Kimura and Ohta 1971）。關(guān)于在分子水平驗(yàn)證選擇的方法，Garrigan和Hedrick（2003）認(rèn)為可以按照種群的當(dāng)前世

2、代，種群的短期歷史和物種的長(zhǎng)期演化歷史三種時(shí)間尺度來(lái)劃分為三類。然而，選擇是一個(gè)長(zhǎng)期作用的過(guò)程，種群的當(dāng)前世代體現(xiàn)出來(lái)的臨時(shí)狀態(tài)無(wú)法真實(shí)反映選擇的作用；并且這種時(shí)間尺度的劃分也不利于尋找種內(nèi)-種間遺傳變異所反映的選擇信號(hào)。Nielsen（2005）則把選擇檢驗(yàn)分為群體遺傳學(xué)檢驗(yàn)（population genetic approaches）和比較數(shù)據(jù)檢驗(yàn)（comparative data approaches）。Biswas和Akey（2006）從基因組學(xué)的角度出發(fā)，將選擇檢驗(yàn)的方法分為種內(nèi)多態(tài)性，種內(nèi)多態(tài)性與種間分歧，和種間檢驗(yàn)三類。事實(shí)上，不論如何劃分，不同的檢驗(yàn)方法都有不同的數(shù)據(jù)類型作為檢

3、驗(yàn)對(duì)象。因此，在這篇綜述里我將按照數(shù)據(jù)類型的不同對(duì)目前常用的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)方法進(jìn)行整理和歸納。（1）基于群體內(nèi)等位基因頻率分布的中性檢驗(yàn)在核酸的堿基測(cè)序時(shí)代之前，群體遺傳多樣性的研究手段主要是對(duì)遺傳標(biāo)記的電泳圖譜進(jìn)行分析，其中等位基因的雜合度（allele heterozygosity）曾經(jīng)是一個(gè)普遍用于描述遺傳多樣性的指標(biāo)。以某單一等位基因位點(diǎn)為例，在一個(gè)個(gè)體數(shù)為1000的群體里，如果其中50個(gè)個(gè)體在該位點(diǎn)是雜合子，那么我們可以簡(jiǎn)單地把（Ho）=50/1000=0.05作為該位點(diǎn)的表觀雜合度；說(shuō)明該種群在以這個(gè)位點(diǎn)為遺傳標(biāo)記時(shí)得到的遺傳多樣性程度不高，即仍有95%的個(gè)體是純合子。這種評(píng)估方式適用于

4、小片段的蛋白質(zhì)或核酸序列（如幾十或者幾百個(gè)氨基酸或堿基），但不適用于較長(zhǎng)片段的研究。事實(shí)上，在自然狀態(tài)下，核酸水平上的變異是比較豐富的，尤其從大片段的尺度來(lái)看。例如比較兩條長(zhǎng)度為10,000 bp的等位基因，如此長(zhǎng)度的序列幾乎可以肯定他們是雜合的，因?yàn)樾蛄性介L(zhǎng)，里面的變異越豐富，那么可以想象該位點(diǎn)在群體里雜合度Ho接近1。因此，在對(duì)核酸序列進(jìn)行群體遺傳多樣性分析時(shí)，考慮兩條序列間存在多少差異所獲得的遺傳多樣性信息要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于判斷他們是純合子還是雜合子（Li 1997）。在后來(lái)發(fā)展起來(lái)的群體遺傳學(xué)研究中，有三個(gè)重要指標(biāo)被運(yùn)用于評(píng)估核酸遺傳多樣性（Nei 1987; Li 1997）。第一個(gè)是，即將

5、所研究群體的所有核酸序列中任意兩條不同序列的堿基差異數(shù)取平均值；這個(gè)指標(biāo)對(duì)等位基因頻率依賴很大。第二個(gè)是K，即分離位點(diǎn)數(shù)（number of segregating sites），現(xiàn)在也被稱為SNP（single nucleotide polymorphism），是指所有序列排列比對(duì)后存在變異的堿基位點(diǎn)數(shù)目；這個(gè)指標(biāo)依賴于等位基因數(shù)目而與等位基因頻率無(wú)關(guān)。第三個(gè)是Na，即等位基因數(shù)（number of alleles）。此外，有一個(gè)非常關(guān)鍵的反映種群動(dòng)態(tài)的參數(shù)將以上三個(gè)指標(biāo)在數(shù)學(xué)上聯(lián)系起來(lái)；這里=4Ne，其中Ne為有效種群大小，為每一代的序列突變率（Watterson 1975; Tajima

6、 1983）。有兩種公認(rèn)的估值，一個(gè)是Watterson估值（Wattersons estimator, W），把與K聯(lián)系起來(lái)，即W=K/a，其中a=1+1/2+1/3+ ? +1/(n1)（Watterson 1975）；另一個(gè)是Tajima估值（Tajimas estimator, T），即T=（Tajima 1983）。從理論上說(shuō)，在中性條件下，應(yīng)當(dāng)有T=W=4Ne的平衡狀態(tài)。因此，Tajima（1989）設(shè)計(jì)了D值檢驗(yàn)（Tajimas D），即D=(TW)/Var(TW)，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)模型來(lái)驗(yàn)證中性突變假說(shuō)。Tajimas D值檢驗(yàn)的作用原理是（Tajima 1989）：在原有的平衡狀態(tài)

7、中（T=W=4Ne），所以D=0。但是，如果群體中存在許多低頻率的等位基因（稀有等位基因），可以期望K/a不斷增大而并未受到嚴(yán)重影響，因?yàn)楹笳咧饕怯筛哳l率等位基因決定的。于是有TW，則DW，D0。Tajima（1989）把過(guò)多低頻率等位基因的存在歸咎為定向選擇時(shí)，選擇性清除下選擇性清除會(huì)削弱原有等位基因的在群體中的頻率，而使新等位基因以低頻率補(bǔ)充進(jìn)來(lái)成為稀有等位基因。相反，如果是中等頻率的等位基因占主導(dǎo)，則可能是平衡選擇的結(jié)果，或者是種群大小在經(jīng)歷瓶頸時(shí)使稀有等位基因丟失。因此，當(dāng)Tajimas D顯著大于0時(shí)，可用于推斷瓶頸效應(yīng)和平衡選擇；當(dāng)Tajimas D顯著小于0時(shí)，可用于推斷群體規(guī)

8、模放大和定向選擇。由于平衡選擇與定向選擇都屬于正選擇的范疇，因此，只要D值顯著背離0，就可能是自然選擇的結(jié)果；而當(dāng)D值不顯著背離0時(shí)，則中性零假說(shuō)則不能被排除。之后，F(xiàn)u和Li（1993）提出了與Tajimas D略為不同的方法來(lái)檢驗(yàn)中性進(jìn)化，即Fu and Lis D & F test。他們考慮的是可以獲得外類群的情況，因而對(duì)一組給定的等位基因序列可以構(gòu)建一顆有根樹。在這棵樹上，總突變數(shù)為y，內(nèi)部分枝突變數(shù)為yi，外部分枝的突變數(shù)目為ye，則y=yi+ye。這里y和ye的數(shù)學(xué)期望值分別為E(y)=a*，E(ye)= ，其中a=1+1/2+1/3+ ? +1/(n1)。如果發(fā)生了選擇作用，那么

9、外部分枝突變數(shù)將會(huì)偏離期望值，而內(nèi)部分枝突變數(shù)并未受到嚴(yán)重影響。因此，可根據(jù)與Tajimas D類似的策略，構(gòu)建統(tǒng)計(jì)模型來(lái)驗(yàn)證中性零假說(shuō)。此外，F(xiàn)ay和Wu（2000）構(gòu)建了H檢驗(yàn)（Fay and Wus H test），用以測(cè)試高頻率變異與中等頻率變異的差異。他們認(rèn)為在中性占主流的狀態(tài)下，并不期望會(huì)出現(xiàn)很多高頻率的變異，因而僅僅根據(jù)少數(shù)存在的高頻率的變異就可以推斷“搭車效應(yīng)”。在果蠅的一些低頻重組的區(qū)域中，H檢驗(yàn)觀察到了許多高頻率變異，因此，F(xiàn)ay和Wu（2000）推斷果蠅中的這些高頻變異可能是由于“搭車效應(yīng)”時(shí)正選擇保留了有利變異并使其以高頻率在群體中存在。到目前為止，Tajimas D，

10、Fu and Lis D & F test和Fay and Wus H test，可能是針對(duì)群體內(nèi)的等位基因頻率被運(yùn)用得最廣泛的中性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ停∟ielsen 2005）。D 0 suggests either a recent population bottleneck or some form of balancing selection.D 0 suggests either population expansion or purifying selection. A quick check in Web ofScience reveals that the paper in which

11、Tajima described this approach 4 has been citedover 3100 times since 1994|900 times since I last taught this course two years ago. Clearlyit has been widely used for interpreting patterns of nucleotide sequence variation. Althoughit is a very useful statistic, Zeng et al. 5 point out that there are

12、important aspects of thedata that Tajimas D does not consider. As a result, it may be less powerful, i.e., less ableto detect departures from neutrality, than some alternatives.（2）基于連鎖不平衡的中性檢驗(yàn)這里面首先涉及的參數(shù)是等位基因頻率（allele frequency），基因型頻率（genotype frequency）和單倍型頻率（haplotype frequency）。在無(wú)視連鎖的情況下，最簡(jiǎn)單的單一位點(diǎn)模

13、型是“哈迪溫伯格平衡”（HardyWeinberg equilibrium）模式。假設(shè)在單一位點(diǎn)上有兩種等位基因A和a，那么該群體存在三種基因型：AA，Aa和aa。如果用p表示A的等位基因頻率，q表示a的等位基因頻率，那么在經(jīng)典的Mendel的基因分離定律和獨(dú)立分配定律下，p2為AA的基因型頻率，2pq為Aa的基因型頻率，q2為aa的基因型頻率，則有p2+2pq + q2=1。哈迪溫伯格平衡模式認(rèn)為（Hardy 1908; Weinberg 1908），對(duì)于一個(gè)理想群體，即無(wú)窮大的隨機(jī)交配且沒(méi)有任何進(jìn)化壓力的群體，基因型頻率將以p2，2pq和q2的比例存在于隨機(jī)交配后的各代中，等位基因頻率不會(huì)

14、逐代發(fā)生改變，故而這個(gè)基因座位的基因庫(kù)不會(huì)發(fā)生進(jìn)化。事實(shí)上，當(dāng)兩對(duì)性狀或者考慮兩個(gè)等位基因座位時(shí)，我們必須考慮有可能的連鎖和重組現(xiàn)象。假設(shè)研究對(duì)象為兩個(gè)基因座位A和B，每個(gè)座位上的等位基因分別是A1和A2，B1和B2，那么用x來(lái)表示四種單倍型的頻率：A1B1：x11 A1B2： x12 A2B1： x21 A2B2： x22 而每一個(gè)等位基因的頻率表示為： A1： p1 = x11 + x12A2 ：p2 = x21 + x22B1： q1 = x11 + x21B2： q2 = x12 + x22假設(shè)兩個(gè)座位上的等位基因是自由地獨(dú)立地分配到后代中去，那么以A1B1為例，我們可以期望x11 (

15、e)= p1q1。這時(shí)單倍型頻率的觀察值x11 (o)與期望值x11 (e)之間的差異，就可以用來(lái)反映連鎖不平衡（linkage disequilibrium, LD）：D= x11 (o) p1q1。連鎖平衡（linkage equilibrium, LE）指的就是這種兩個(gè)座位上的等位基因是自由地獨(dú)立地分配到后代中去的現(xiàn)象，A與B的組合是完全隨機(jī)的，因此有D=0，即LD為零的狀態(tài)。我們其實(shí)可以把LE看作是雙位點(diǎn)版本的“哈迪溫伯格平衡”，只不過(guò)這里是單倍型頻率而不是基因型頻率。當(dāng)D0時(shí)，觀察值與期望值不符，我們就說(shuō)這兩個(gè)等位基因處于連鎖不平衡狀態(tài)。事實(shí)上，重組能打斷連鎖關(guān)系而使在很多代以后LD

16、趨向于0。假設(shè)c（0x11=(1c)x11+c p1q1，也可以寫成 x11p1q1=(1c) (x11p1q1)，即 D1=(1c)D0。擴(kuò)展到第n代時(shí)，有Dn=(1c)nD0。如果n趨向于+，則(1c)n趨向于0，這時(shí)Dn=0。如果兩位點(diǎn)在物理距離上越接近，連鎖越緊密，被重組的可能性就越低，則Dn0的速率就越慢。在前面提到的“搭車效應(yīng)”中，當(dāng)一個(gè)有利突變開始產(chǎn)生時(shí)，它是處于完全LD狀態(tài)的，即可視為與其構(gòu)成單倍型的所有基因完全連鎖，而其他單倍型因?yàn)椴淮嬖谶@個(gè)突變而被選擇性清除所消滅（Ennis 2007）。因此，搭車效應(yīng)，正選擇，選擇性清除，連鎖不平衡，基因重組以及群體結(jié)構(gòu)相聯(lián)系組成了一種情

17、況極為復(fù)雜的局面，使得基于LD檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)模型的設(shè)計(jì)成為一個(gè)難度極高的挑戰(zhàn)。盡管如此，近幾年，已經(jīng)發(fā)展出了一些檢驗(yàn)方法用于檢測(cè)與LD相關(guān)聯(lián)的自然選擇，包括LRH test（Sabeti et al. 2002），iHS test （Voight et al. 2006），LDD test （Wang et al. 2006）等。然而，這些檢驗(yàn)效力如何，還需要更多的研究結(jié)果來(lái)提供證據(jù)。（3）基于種群分化的檢驗(yàn)Wright（1931）首先給出了群體遺傳分化系數(shù)Fst的計(jì)算公式，用以評(píng)估亞群體的分化程度。Cavalli-Sforza（1966）認(rèn)為自然選擇可能會(huì)對(duì)群體亞分化形成貢獻(xiàn)，因此首次建議用群體間

18、的分化程度來(lái)推斷自然選擇的作用。隨后，基于這一想法，大致有兩種類型的方法被用于自然選擇的測(cè)試。一種是Lewontin-Krakauer test（Lewontin and Krakauer 1973），其作用原理是：群體間的基因流（gene flow）會(huì)使大多數(shù)位點(diǎn)形成較為平均的遺傳分化程度，除了一些明顯的異常值（outliers）。大體上，這些異常值可以反映兩個(gè)方向上的選擇：適應(yīng)性選擇能在某些位點(diǎn)上產(chǎn)生異常的高水平遺傳分化，而平衡選擇則有可能產(chǎn)生低于平均水平的遺傳分化。因此，從異常位點(diǎn)與正常位點(diǎn)的遺傳分化程度的比較可以推斷自然選擇。然而，最初的這種Lewontin-Krakauer test

19、被Nei和Maruyama（1975）以及Robertson（1975）所批評(píng)，認(rèn)為在許多群體模型中，該檢驗(yàn)中Fst的期望方差無(wú)效。盡管如此，這種思想近年來(lái)有逐漸抬頭的勢(shì)態(tài)，尤其在運(yùn)用到基因組大尺度數(shù)據(jù)的時(shí)候。例如Akey等(2002)在基因組尺度對(duì)人類不同群體的Fst進(jìn)行了測(cè)算推斷其中的選擇作用；Beaumont與他的同事（Beaumont and Nichols 1996; Beaumont and Balding 2004）則設(shè)計(jì)了更為復(fù)雜的統(tǒng)計(jì)學(xué)模型來(lái)檢測(cè)群體亞分化水平上的異常基因位點(diǎn)。另一種方法是檢測(cè)不同位點(diǎn)在不同種群中的雜合度水平。例如Schlotterer等（1997）和Schl

20、otterer（2002）認(rèn)為在不同種群中通過(guò)比較多位點(diǎn)的雜合度，可以把選擇的作用和種群統(tǒng)計(jì)學(xué)效應(yīng)區(qū)分開來(lái)。兩個(gè)不同群體大小的種群，小種群在基因組上的期望變異水平都應(yīng)低于大種群。但是受到選擇的單位點(diǎn)的變異程度則可能會(huì)比基因組水平的差異更低。因此，把群體結(jié)構(gòu)與多個(gè)單位點(diǎn)變異聯(lián)合考慮，則可能推斷出基因組上的哪些區(qū)域有可能受到了選擇。以上的基于種群分化的檢驗(yàn)盡管還沒(méi)有得到非常普及地應(yīng)用，但事實(shí)上，最近的一些研究表明（Nielsen 2005），“選擇性清除”會(huì)強(qiáng)烈地影響群體的亞分化水平，尤其是當(dāng)“選擇性清除”沒(méi)有來(lái)得及涉及到所有研究群體的時(shí)候，這種作用更明顯。因此，基于群體分化程度來(lái)尋找自然選擇的信

21、號(hào)，仍然是一種可行的思路。（4）基于種內(nèi)多態(tài)性和種間分歧度之間數(shù)據(jù)比較的檢驗(yàn)中性理論預(yù)言，在中性狀態(tài)下，種內(nèi)多態(tài)性（intraspecific polymorphism）與種間分歧度（interspecific divergence）之間呈正相關(guān)?；谶@種預(yù)測(cè)，有兩種檢驗(yàn)方法先后被提出，分別是HudsonKreitmanAguade (HKA) test和McDonald-Kreitman (MK) test。HKA檢驗(yàn)認(rèn)為（Hudson et al. 1987），在中性狀態(tài)下，對(duì)于不同的基因或者基因位點(diǎn)而言，即使他們之間的變異程度不同，但他們各自的種內(nèi)多態(tài)性與種間分歧度之間的比率將是相同的。

22、例如，組蛋白基因（histone）是一個(gè)相當(dāng)保守的基因，突變率很低，因此組蛋白基因種內(nèi)多態(tài)性程度很低，其種間變異度也很低。而對(duì)于某些非編碼序列來(lái)說(shuō)，其突變率很高，不論在種內(nèi)種間都體現(xiàn)了很高的變異水平。但是，在中性條件下，不論對(duì)于組蛋白基因還是非編碼序列，他們的種內(nèi)多態(tài)性與種間分歧度之間的比率將是相當(dāng)?shù)摹Ｈ绻匀贿x擇發(fā)生了作用，那么受選擇的基因，其種內(nèi)多態(tài)性與種間分歧度之間的比率將偏離中性狀態(tài)下的期望值。因此，通過(guò)同時(shí)比較兩個(gè)或者多個(gè)基因各自的種內(nèi)多態(tài)性與種間分歧度之比，HKA檢驗(yàn)可以檢測(cè)到自然選擇的作用。但是，HKA的一個(gè)很大的限制就是所研究的基因或者基因位點(diǎn)之間必須是相互獨(dú)立的，即不存在連鎖

23、關(guān)系。因?yàn)橐恍┭芯堪l(fā)現(xiàn)，連鎖位點(diǎn)所受到的選擇作用，影響的是種內(nèi)多態(tài)性而不是種間的分歧度水平（Maynard-Smith and Haigh 1974; Birky and Walsh 1988），因此，除了選擇作用之外，任何非中性的影響（如搭車效應(yīng)或選擇性清除）都會(huì)使種內(nèi)多態(tài)性偏離期望值。也就是說(shuō)，HKA所檢測(cè)到的自然選擇信號(hào)，有可能是所研究位點(diǎn)受到了選擇，也有可能是與其連鎖的位點(diǎn)受到了選擇而通過(guò)某些非中性效應(yīng)使所研究位點(diǎn)多態(tài)性發(fā)生了變化，盡管所研究位點(diǎn)仍然是遵循中性進(jìn)化的。隨后發(fā)展起來(lái)的MK檢驗(yàn)則避免了多基因或者多位點(diǎn)有可能存在的連鎖效應(yīng)所帶來(lái)的假陽(yáng)性信號(hào)。MK檢驗(yàn)的基本原理是（McDona

24、ld and Kreitman 1991）：僅僅考查某一基因分別在種內(nèi)和種間的非同義（nonsynonymous）與同義突變（synonymous）的比值。具體而言，針對(duì)A與B這兩個(gè)近緣物種，我們把基因G在這兩個(gè)物種里能發(fā)現(xiàn)的所有等位基因進(jìn)行匯總和排列比對(duì)后，關(guān)注其中存在變異的核苷酸替換位點(diǎn)而忽略無(wú)變異位點(diǎn)，即關(guān)注分離位點(diǎn)（segregating sites）或SNP（single nucleotide polymorphism）位點(diǎn)。在這些所有的變異位點(diǎn)中，假設(shè)某一位點(diǎn)如果在來(lái)自物種A的所有等位基因里都是堿基C，而在來(lái)自物種B的所有等位基因里都是堿基T，那么針對(duì)A與B這兩個(gè)近緣物種而言，這個(gè)變異位點(diǎn)我們定義為被固定的替換位點(diǎn)（