喜樹堿的藥物設(shè)計,靶向癌細胞死亡與基因

1、第八章第八章 喜樹堿的藥物設(shè)計，靶向癌喜樹堿的藥物設(shè)計，靶向癌細胞死亡與基因細胞死亡與基因王偉寧王偉寧1.引言 喜樹堿是四十多年前發(fā)現(xiàn)一種植物抗癌藥物。拓撲異構(gòu)酶是一種非常重要的DNA操作酶，是唯一知道的喜樹堿的靶點，它結(jié)合在共價蛋白核酸復(fù)合物的界面。這主要與喜樹堿的化學(xué)與生物學(xué)的三個方面有關(guān)：一是以拓撲異構(gòu)酶為靶點合成的喜樹堿抗腫瘤衍生物，二是由拓撲異構(gòu)酶抑制劑誘導(dǎo)的細胞死亡機制，三是拓撲異構(gòu)酶抑制劑靶點所對應(yīng)的特定的DNA序列。作為設(shè)計抗癌藥物的首選天然產(chǎn)物，或是作為研究拓撲異構(gòu)酶對DNA新陳代謝的實驗工具。 20-(S)-Camptothecin (CPT)最早是在1966年，由美國的W

2、all等從中國特有的珙桐科植物喜樹中提取到的，由美國國立腫瘤研究所（NCI）動物模型上證實其抗腫瘤作用，并將其水溶性鈉鹽用于臨床試驗。在過去的四十年，從大量的植物科中發(fā)現(xiàn)了這種單萜吲哚類生物堿，包括茜草科、夾竹桃科、鉤吻科、茶茱萸科等。 盡管有抗腫瘤的活性，但是后來發(fā)現(xiàn)堿處理開環(huán)后藥物活性明顯下降，同時還伴隨著嚴重的毒性反應(yīng)包括嚴重的腹瀉、出血性膀胱炎，使得CPT類化合物的臨床研究就此中斷。1985年發(fā)現(xiàn)CPT特異作用于核內(nèi)蛋白拓撲異構(gòu)酶。二十年后，拓撲異構(gòu)酶仍是已知的CPT的唯一靶點，這使得這種生物堿成為真正的靶點抗癌制劑。2.喜樹堿：拓撲異構(gòu)酶-DNA復(fù)合體的分子鉗 DNA拓撲異構(gòu)酶是生物

3、體內(nèi)及其重要的細胞核內(nèi)酶，參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組和修復(fù)等所有關(guān)鍵的核內(nèi)過程。拓撲異構(gòu)酶為單體性100kDa的多肽，由染色體20q1213.2位基因編碼，可松解過度卷曲的DNA雙鏈，以利于復(fù)制及轉(zhuǎn)錄的進行。酶先與DNA結(jié)合，成為可斷裂復(fù)合物，在DNA磷酸二酯鍵上形成一個單鏈缺口，讓未受損的單鏈從缺口中回轉(zhuǎn)，使DNA松弛，以利于復(fù)制或轉(zhuǎn)錄，隨后將缺口連接。 CPT類化合物的作用機制是參與Topo作用過程中與DNA形成的“可切割復(fù)合物”，阻礙DNA鏈的閉合，導(dǎo)致細胞DNA單鏈斷裂（SSB），這種單鏈斷裂對細胞來說并不是致死性的，當可切割復(fù)合物與正在進行復(fù)制的DNA復(fù)制又相遇時，會繼發(fā)性的造成不可

4、逆的DNA雙鏈斷裂（DSB），最終引起細胞死亡。 因此，S期細胞對CPT類化合物特別敏感。另外，CPT穩(wěn)定的可切割復(fù)合物也作用于RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄過程，抑制RNA的合成，在DNA模板鏈形成不可逆的單鏈斷裂，并在啟動子區(qū)域引起少量雙鏈斷裂。 3. CPT衍生物的設(shè)計：永無止境 根據(jù)在A-B、C-D、E環(huán)上取代基位置的不同，可以將CPT衍生物分成三類。 第一類：A-B環(huán)的修飾。早期發(fā)現(xiàn)，A-B環(huán)被取代后不喪失活性。這個二元環(huán)上可以被許多官能團取代，特別是在7位、9位和10位上，盡管會保留甚至在某些情況下會提高天然產(chǎn)物的細胞毒性。當前已經(jīng)研發(fā)了兩種主要的抗癌藥拓撲替康和伊立替康，并且已經(jīng)用于臨床。

5、拓撲替康（拓撲替康（TPT），又名拓泊替康、和美新，結(jié)構(gòu)如圖。本品為CPT半合成衍生物，作用靶點為Topo，為S期抗腫瘤藥。臨床前研究表明，TPT抗腫瘤譜較廣，對L1210和P338白血病小鼠的活性及在體內(nèi)抗Lewis肺癌和B-16黑色素瘤的作用均優(yōu)于CPT。在人結(jié)腸癌異體移植物，TPT可以誘導(dǎo)腫瘤消退及延緩其生長。1996年，美國FDA批準其為治療卵巢癌的二線藥物。2000年，被批準為治療小細胞肺癌的二線藥。 不良反應(yīng)：1.骨髓抑制：中性粒細胞下降、血小板減少、貧血等，為主要限制性毒性。2.胃腸道反應(yīng)：惡心、嘔吐、腹瀉、便秘、腸梗阻、腹痛、口腔炎、厭食等。3.皮膚反應(yīng)：脫發(fā)，偶見嚴重的皮炎及

6、瘙癢。4.神經(jīng)肌肉反應(yīng)：頭痛、關(guān)節(jié)痛、肌肉痛、全身痛、感覺異常。5.呼吸系統(tǒng)反應(yīng)：可致呼吸困難。 6.肝臟：有時出現(xiàn)肝功能異常，轉(zhuǎn)氨酶升高。7.全身反應(yīng)：乏力、不適、發(fā)熱等。8.局部刺激：靜脈注射時，若漏出血管外可產(chǎn)生局部刺激、紅腫。 伊立替康（伊立替康（CPT-11）：又名開普拓，結(jié)構(gòu)如圖。1998年，被批準與5-FU（5-氟尿嘧啶）和葉酸聯(lián)用，作為治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的一線藥物，現(xiàn)在也是治療非小細胞肺癌的一線藥物。CPT-11是一個水溶性前藥，在體內(nèi)被羧酸酯酶代謝成活性形式SN-38，結(jié)構(gòu)如圖。SN-38是主要活性代謝產(chǎn)物，其活性比CPT-11強1001000倍。SN-38經(jīng)肝臟尿苷二磷酸葡萄

7、糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UDP-GT）生成葡萄糖醛酸化SN-38（SN-38G）。當SN-38G分泌進入腸道，腸道中細菌的-葡萄糖醛酸酶又能使之變回SN-38。存在藥物的肝腸循環(huán)。 不良反應(yīng)：1.胃腸道：遲發(fā)性腹瀉（給藥24h后發(fā)生的腹瀉）、惡心與嘔吐、厭食、腹痛及黏膜炎。2.血液學(xué)：中性粒細胞減少。3.急性膽堿能綜合癥：主要癥狀為：早發(fā)性腹瀉及其他癥狀，如用藥后第一個24小時內(nèi)發(fā)生：腹痛、結(jié)膜炎、鼻炎、低血壓、血管舒張、出汗、寒戰(zhàn)、全身不適、頭暈、視力障礙、瞳孔縮小、流淚、流涎增多，以上癥狀于阿托品治療后消失。4.其它作用：早期的反應(yīng)如呼吸困難、肌肉收縮、痙攣及感覺異常等均有報道。 除了拓撲替康和伊立

8、替康，還有很多A環(huán)和B環(huán)上被取代的CPT衍生物，如圖： 第二類：C-D環(huán)的修飾。對于C環(huán)和D環(huán)的衍生物，他們一般沒有活性或比CPT的活性低很多。在這一類中，唯一用于臨床開發(fā)的是C環(huán)修飾的衍生物DRF-1042，在5位有一個取代基，現(xiàn)在已經(jīng)進行到臨床期開發(fā)階段。 第三類：E環(huán)的修飾。A-B環(huán)或C-D環(huán)的修飾往往是增加CPT的水溶性，并且減少內(nèi)酯環(huán)E環(huán)開環(huán)形成無活性的羧化物形式。在以往的研究中，對CPT內(nèi)酯環(huán)E環(huán)的改造都會造成化合物失活，因此一直以來認為，E環(huán)是CPT的活性必須基團，在結(jié)構(gòu)修飾中一般都避免對E環(huán)的改造，而新一代的高喜樹堿，用七元環(huán)替代了六元內(nèi)酯環(huán)，能消除E環(huán)的分子內(nèi)氫鍵，降低羰基活

9、性。其中，二氟取代物Diflomotecan（BN280915）結(jié)構(gòu)如圖。 它是一種口服的拓樸異構(gòu)酶抑制劑，在臨床期開發(fā)階段，在體內(nèi)的穩(wěn)定性較topotecan好，副作用特別是胃腸道毒性似更少。另外，發(fā)現(xiàn)該類化合物中的BN280927兼有抑制Topo和Topo兩種酶的作用，但不形成Topo可切割復(fù)合物。該化合物對G0期的腫瘤細胞也有明顯的抑制作用，細胞水平的IC50低于SN38，并且對SN38的耐藥株也有很強的細胞毒作用。 4.DNA修復(fù)或細胞死亡 Topo介導(dǎo)的DNA損傷的修復(fù)機制是復(fù)雜的，同源重組在DNA損傷中起著重要作用。Topo介導(dǎo)的DNA損傷也涉及其它的DNA修復(fù)復(fù)合物，比如與Top

10、oIII相關(guān)的ReqQ解旋酶參與的堿基切除途徑。喜樹堿類藥物為細胞周期特異性藥物，主要作用于S期，并對G2+M期邊界有延緩作用；它能夠抑制DNA Topo將DNA斷端重新接上的正常功能，并進一步造成DNA鏈的斷裂損傷，從而控制DNA復(fù)制，阻斷RNA合成（即轉(zhuǎn)錄）、干擾細胞分裂周期（延遲G2期），最終導(dǎo)致癌細胞的死亡。當DNA損傷超過DNA修復(fù)的時候，細胞就會不可避免的趨向死亡。迄今為止，最好的描述由CPT誘導(dǎo)的細胞死亡機制稱為細胞凋亡。 Caspases（半胱天冬酶，胱門蛋白酶）（半胱天冬酶，胱門蛋白酶）是一類蛋白裂解酶，在細胞內(nèi)以無活性的酶原形式存在。半胱天冬酶具有半胱氨酸激活位點和底物裂解

11、位點，當作用于胞內(nèi)特異性底物后將引起細胞凋亡。但當它們被激活后并不會降解胞內(nèi)的所有蛋白，相反，它們只會選擇性的作用于自身的靶蛋白，在靶蛋白一級結(jié)構(gòu)中Asp（天冬氨酸）殘基的位置之后將靶蛋白裂解，介導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。5.拓撲異構(gòu)酶介導(dǎo)DNA斷裂的序列特異性靶點 Topo毒劑可以作為抗生素直接作用于細菌的Tope，也可以作為抗腫瘤制劑直接作用于真核生物的酶類。但是，一些局限性阻礙了它們的廣泛應(yīng)用。毒性是重要的不需要的次生效應(yīng)。比如，TopoII毒劑，會因為化療引起白血病。這些副作用與Tope有非常弱的序列特異性有關(guān)在裂解位點周圍只有一個或兩個堿基。比如，對于CPT來說，只在T和G之間斷裂。因此，化學(xué)

12、家們正致力于增加這些藥物的特異性。一種策略是，通過使用前體藥使藥物只在腫瘤細胞處釋放。另一種策略是，將藥物共價結(jié)合到DNA配體上，然后再將這個特異性序列結(jié)合到DNA上，從而增加DNA的特異性。 第二種策略的圖解6.喜樹堿類化合物的構(gòu)效關(guān)系 A、B、C環(huán)：1）在C-7、9、10位及11位引入不同的取代基，特別是7位和10位引入雙取代基，可干擾喜樹堿開環(huán)形式及喜樹堿與人血清白蛋白的結(jié)合，從而提高內(nèi)酯在體內(nèi)的穩(wěn)定性。2）在C-7、9；C-9、10；C-10、11間增加一個環(huán)，雖然不能增加內(nèi)酯環(huán)的穩(wěn)定性，但能增加體內(nèi)和體外的腫瘤活性。 3）在C-5、12、14位取代則活性降低或喪失。4）B環(huán)飽和，幾乎

13、無活性。 D、E環(huán)：1）20位的氧為活性必需，內(nèi)酯環(huán)氧被氮或硫取代，活性喪失。2）D環(huán)吡啶酮為抗腫瘤活性必需。3）20（S）異構(gòu)體較20（R）異構(gòu)體活性強10100倍。4）E環(huán)擴環(huán)成七元內(nèi)酯環(huán)，形成高喜樹堿能消除E環(huán)的分子內(nèi)氫鍵，降低羰基活性。 5）E環(huán)羥基可以酯化，以增大羰基的位阻并破壞分子內(nèi)氫鍵。其引入脂肪族氨基酸、大分子或糖均能增加藥物的穩(wěn)定性和水溶性。6）去除E環(huán)的AD四元環(huán)衍生物活性降低或喪失，說明喜樹堿的內(nèi)酯環(huán)是其抗腫瘤的關(guān)鍵部位。第九章第九章 靶向胸苷酸合成酶的抗葉靶向胸苷酸合成酶的抗葉酸藥物的癌癥治療酸藥物的癌癥治療1.引言 四氫葉酸衍生物是細胞一碳代謝中的重要輔酶。在某些氨基

14、酸、嘌呤和嘧啶的生物合成反應(yīng)中，四氫葉酸衍生物作為各種酶的特殊底物，提供羥甲基、甲?；图谆纫惶紗挝?，發(fā)揮著重要作用?？谷~酸藥物是以葉酸依賴性酶為靶點，設(shè)計合成的與這些酶的特殊底物（即葉酸輔酶）結(jié)構(gòu)相似的一類化合物，它們和酶結(jié)合后可阻止正常底物與酶的結(jié)合，從而干擾細胞的葉酸代謝和一碳代謝 一些抗葉酸藥物通過阻斷DNA生物合成中所需的嘌呤和嘧啶核苷酸的生物合成，導(dǎo)致腫瘤細胞的死亡，在臨床上用作抗腫瘤藥物。 最早用作抗腫瘤藥物靶點的葉酸依賴性酶是二氫葉酸還原酶（DHFR）。DHFR催化二氫葉酸還原成四氫葉酸，然后在其他酶的作用下生成四氫葉酸的各種活性衍生物。因此，它在葉酸代謝循環(huán)中處于中心地位。

15、 例如，抗葉酸藥物甲氨蝶呤（MTX），它作為一種葉酸還原酶抑制劑，主要抑制二氫葉酸還原酶而使二氫葉酸不能還原成有生理活性的四氫葉酸，從而使嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成過程中一碳基團的轉(zhuǎn)移作用受阻，導(dǎo)致DNA的生物合成受到抑制。主要用于兒童急性白血病和絨毛膜上皮癌，可作為免疫抑制劑應(yīng)用。 胸苷酸合成酶作為抗癌藥物的靶點 胸苷酸合成酶（TS）系有相同亞基構(gòu)成的同源二聚體胞漿酶，它參與體內(nèi)DNA生物合成所需的胸腺嘧啶核苷酸的起始合成過程，是該過程的限速酶。TS催化脫氧尿苷一磷酸（dUMP）的甲基化反應(yīng)，生成脫氧胸苷一磷酸（dTMP），在此過程中，5,10-亞甲基四氫葉酸提供甲基。此后dTMP發(fā)生

16、磷酸化形成脫氧胸苷三磷酸（dTTP），后者是DNA生物合成的必需物質(zhì)。這是細胞內(nèi)從頭合成dTTP的唯一途徑，因此TS是腫瘤化療的一個關(guān)鍵靶點，抑制TS將導(dǎo)致細胞“無嘧啶死亡”。 根據(jù)TS的結(jié)合特性，其抑制劑可分為嘧啶類似物（與TS底物位點結(jié)合）、葉酸類似物（與TS輔酶位點結(jié)合）及具有獨特結(jié)構(gòu)的TS抑制劑（它們不與底物結(jié)合位點和輔酶結(jié)合位點結(jié)合，但具有TS抑制活性）3類。 嘧啶類似物嘧啶類似物TS抑制劑：抑制劑：5-氟尿嘧啶（氟尿嘧啶（5-FU）：）：該藥首先在體內(nèi)轉(zhuǎn)變成氟尿嘧啶脫氧核苷酸與TS結(jié)合，再與輔酶5,10-亞甲基四氫葉酸作用，由于氟尿嘧啶脫氧核苷酸C-F鍵很穩(wěn)定，導(dǎo)致不能有效地合成胸

17、腺嘧啶脫氧核苷酸，使TS失活，從而抑制DNA的合成，最后導(dǎo)致腫瘤細胞死亡。 氟尿嘧啶是目前臨床上應(yīng)用最廣的抗嘧啶類藥物，對多種腫瘤如消化道腫瘤、乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、肝癌、膀胱癌等均有一定療效。 葉酸類似物葉酸類似物TS抑制劑：抑制劑：CB3717 ：是第一種有較高選擇性的葉酸結(jié)構(gòu)類似物TS抑制劑，在I期臨床試驗中表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性，在體外抗腫瘤試驗證明其對卵巢癌、乳腺癌、肺癌以及間皮癌都有明顯效果。但后來發(fā)現(xiàn)CB3717有非常嚴重的肝腎毒性并致強烈的機體反應(yīng)，因此該化合物退出了臨床研究。盡管如此，CB3717是葉酸類似物TS抑制劑的一個里程碑，它的成功合成為其它葉酸類似物TS抑制劑的

18、開發(fā)提供了先導(dǎo)。 雷替曲塞： 雷替曲塞是由英國的Royal Marsden醫(yī)院的癌癥研究署與Zeneca藥廠共同合作發(fā)展的藥物。它是一種葉酸的衍生物，可以與胸腺嘧啶合成酶（TS）結(jié)合而抑制其作用?，F(xiàn)已有10多個國家將雷替曲塞作為晚期結(jié)直腸癌的一線用藥。3項期臨床研究已報告該藥單藥治療結(jié)直腸癌的效能。它對結(jié)腸直腸癌細胞系的抑制作用強于5-氟尿嘧啶，并且毒副作用比5-氟尿嘧啶少。期實驗已評估雷替曲塞單藥治療其他腫瘤的效果。在乳腺癌（26%）、卵巢癌（7%）、小細胞肺癌（9%）和胰腺癌（12%）病人中，已觀察到完全反應(yīng)和部分反映。雷替曲塞和5-FU各自均能有效的治療晚期結(jié)直腸癌，兩者聯(lián)用可產(chǎn)生協(xié)同作用。 不良反應(yīng)：靜脈滴注本品后常見副作用為血液毒性包括骨髓抑制，中性粒細胞減少、血小板減少等，胃腸道副作用最常見有惡心、嘔吐、腹瀉，食欲不振。較少見黏膜炎、口炎（包括口腔潰瘍）、消化不良和便秘，一般患者耐受性良好，副作用發(fā)生率較低。 培美曲塞： 培美曲塞是一個多靶點抗葉酸細胞毒藥物，其作為一個廣譜、高效、低毒的分子靶向治療藥物，受到臨床廣泛關(guān)注。作用機制：培美曲塞主要通過抑制葉酸代謝途徑中多個關(guān)鍵酶的活性，影響