EPO的雜質(zhì)檢測方法

1、12005級生命科學基地班級生命科學基地班張毅榮張毅榮 王王 薇薇23 原理： 供試品中的外源DNA經(jīng)變性為單鏈后吸附于固相膜上，在一定溫度下可與相匹配的單鏈DNA復性而重新結(jié)合成為雙鏈DNA。將特異性單鏈DNA探針標記后，與吸附在固相膜上的供試品單鏈DNA雜交，并使用與標記物相應的顯示系統(tǒng)顯示雜交結(jié)果，與已知含量的陽性DNA比對后，可測定供試品中外源DNA的含量。4試劑：lDNA標記和檢測試劑盒l(wèi)DNA雜交膜 尼龍膜或硝酸纖維素膜l2%蛋白酶K溶液 稱取蛋白酶K0.20g，溶于滅菌水10ml中，分裝后儲藏于-20 備用。l3%牛血清白蛋白溶液 稱取牛血清白蛋白0.03g，溶于滅菌水10ml中

2、。l1mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液（pH8.0） 用鹽酸調(diào)pH值至8.0l5.0mol/L氯化鈉溶液0. 0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液（pH8.0）.l5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液（pH8.0）。5l20%十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液 用鹽酸調(diào)pH至7.2。l蛋白酶緩沖液（pH8.0）量取1mol/L Tris溶液1.0ml(pH8.0),5mol/L氯化鈉溶液2.0ml，0.5mol/L EDTA溶液（pH8.0）2.0ml，20%SDS溶液2.5ml, 加滅菌水至10ml。lTE緩沖液（pH8.0) 量取1mol/L Tris溶液（pH8.0）10ml,0.5mo

3、l/L EDTA溶液（pH8.0）2ml, 加滅菌水 至1000ml。l1%魚精DNA溶液 精密稱取魚精DNA0.01g,置10ml量瓶中，用TE緩沖液溶解并稀釋至刻度，搖勻，用7號針頭反復抽打以剪切DNA成為小分子，分裝后貯藏于 -20 備用。lDNA稀釋液 取1%魚精DNA溶液50l，加TE緩沖液至10ml。6探針標記和陽性對照的探針標記和陽性對照的DNA的制備的制備7 將待提取的細胞基質(zhì)懸液的細胞濃度調(diào)整為每lml含 107個細胞。取懸液lml，離心，在沉淀中加裂解液400 l 混勻，37作用12-24小時后，加入飽和酚溶液450l , 劇烈混合，以每分鐘10000轉(zhuǎn)離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上

4、層液體，以飽和酚溶液450 l 重復抽提一次; 轉(zhuǎn)移上層液體，加入三氯甲烷450 l ，劇烈混勻，以每分鐘10000轉(zhuǎn)離心10分鐘; 轉(zhuǎn)移上層液體，加入pH5.2的3mol/L醋酸鈉溶液40 l ，充分混合，再加入-20以下的無水乙醇1ml ,充分混合，-20以下作用2小時，以每分鐘15000轉(zhuǎn)離心15分鐘; 用適量-2070%乙醇溶液洗滌沉淀1次，以每分鐘15000轉(zhuǎn)離心15分鐘，棄上清液，保留沉淀，吹至干燥后，加適量滅菌TE緩沖液溶解，RNase酶切，酚/三氯甲烷抽提，分子篩純化DNA, 即得。8鑒定陽性對照品的DNA純度: 10%瓊脂糖凝膠電泳法:無RNA和寡核昔酸存在;分光光度法:A2

5、60 /A 280 比值應在1.8-2.0之間。 用于陽性對照和標記探針的DNA在使用前應進行酶切或超聲波處理，使其片斷大小適合于DNA雜交和探針標記。探針的標記 按試劑盒使用說明書進行。9測定法斑點雜交法 (1)蛋白酶K預處理按下表對供試品、陽性和陰性對照進行加樣，混合后37保溫4小時以上，以保證酶切反應完全。10注意事項: 1） Dl、D2、D3為稀釋的陽性DNA對照。用DNA稀釋液稀釋至每1ml中含DNA1000ng。然后依次10倍稀釋成10ng/100l (D1)、1ng/100 l (D2) 、100pg/100l (D3)三個稀釋度; 如成品使用劑量較大，而且 DNA限量要求（10

6、0pg/劑量）較嚴格時，則需要提高DNA檢測靈敏度，相應的陽性DNA對照應稀釋成100pg/100l (D1)、10pg/100 l (D2) 、1pg/100l (D3)三個稀釋度。陰性對照為DNA稀釋液。11 2） 用DNA稀釋液將供試品(原液)稀釋至每100l含1人份劑量。 3） 加入3%牛血清白蛋白溶液適量，是為了使陽性對照和陰性對照中含有一定的蛋白質(zhì)與供試品(通常為蛋白質(zhì))的酶切條件保持一致;如供試品為其他物質(zhì)，則應改用其他相應物質(zhì)。12(2)點膜 用TE緩沖液浸潤雜交膜后，將預處理的供試品、陽性對照、陰性對照置100水浴加熱10分鐘，迅速冰浴冷卻，以每分鐘8000轉(zhuǎn)離心5秒，用抽濾

7、加樣器點樣于雜交膜(因有蛋白質(zhì)沉淀，故要視沉淀多少確定加樣量，以避免加入蛋白質(zhì)沉淀。所有供試品與陽性對照、陰性對照加樣體積應一致，或按同樣比例加樣)。晾干后置80真空干烤1小時以上。13 （3）雜交及顯色 按試劑盒使用說明書進行。 將膜置于預雜交液中(5* SSC, Blockingreagent 1%w/v, N-lauroylsarcosine sodium salt0.1%w/v, SDS 0. 02 % w/v) 68預雜交4h,置膜于含25ng/ml探針的雜交液中，68雜交16h。 為了降低雜交膜背景，膜片的洗滌用2*SSC,0.1%SDS室溫洗2次，15min/次，后用0.1*SS

8、C,0 .1 % SDS洗二次，每次15min，不斷振搖后將膜置于l0ml Buffer I (0. lmol/L Tris-HCl pH7. 5 0.15mol/L NaCI)中，靜置1min，再將膜置于Buffer (Buffer I加入1 % Blocking reagent)中30min，再置于含150mU/ml Anti-digoxigenin-AP conjugate的Buffer中37 40min。待反應完畢后，用BufferI洗膜2次，15min/次，用Buffer (100mmo1/L Tris-HCl pH9. 5，100mmo1/L NaCI, 50mmo1/LMgCl2

9、)平衡5min后，取l0ml Buffer加人400l 顯色液浸勻，將膜片置于其中，暗處顯色。當斑點清晰后，用注射用水洗膜，室溫晾干。 14結(jié)果判定 陽性對照應顯色，其顏色深度與DNA含量相對應，呈一定的顏色梯度，陰性對照應不顯色，或顯色深度小于陽性DNA對照D3，試驗成立。將供試品與陽性對照進行比較，根據(jù)顯色的深淺判定供試品中外源性DNA的含量。1516： 將已知抗體包被微量反應板和待測抗原發(fā)生特異性免疫反應，再加酶標抗體和底物，根據(jù)顯色反應對抗原進行定性或定量。1718 1.抗BSA單抗的制備及篩選 用BSA免疫BALB/c小鼠，共3次，每次間隔2-3周。取脾，SP2/0骨髓瘤細胞融合，篩

10、選陽性克隆，檢測單抗亞型。大量制備并純化單抗。2抗BSA多克隆抗體的制備及標記 用BSA免疫白兔3次，每次間隔1周，采血，硫酸銨沉淀及層析純化，蛋白定量，采用過碘酸鈉一乙二醇方法標記辣根過氧化物酶(HRP)。193. EL1SA夾心法 將定量后的單抗稀釋到1:400后包被96孔酶標板，4包被過夜，37封閉1h。分別加入0-40 ng/ml濃度BSA的標準溶液，每濃度2孔，100 l /孔。以稀釋液作為空白對照。待測樣品分別測定原倍和2倍稀釋后濃度。37孵育1 h,PBST-Tween 20洗滌。加入1:12 000稀釋度的酶標抗BSA多克隆抗體，100 ll /孔，室溫30 min。PBST-

11、Tween 20洗滌。加入TMB顯色，100l /孔，室溫10 min。加入1 mol/LHCl終止。測定A450，以0 ng/ml標準溶液的A值消零。以BSA含量為橫坐標，A值(兩孔均值)為縱坐標，繪制標準曲線。應為一直線相關(guān)。2021 本法系用火焰光度法火焰光度法測定供試品中鈉離子含量。某些含堿金屬或堿土金屬元素的供試品溶液用噴霧裝置以氣溶膠形式引入火焰光源中，靠火焰的熱能將供試品元素原子化并激發(fā)出它們的特征光譜 ，通過光電檢測系統(tǒng)測量出待測元素特征光譜的發(fā)光強度可求出供試品中待測元素的含量。通常借比較對照品溶液和供試品溶液的發(fā)光強度，求得供試品中待側(cè)元素的含量。 22 精密量取供試品0.

12、5ml,置50ml量瓶中,用水稀釋至刻度，即為供試品溶液。按火焰光度法測定，在589nm波長處測定供試品溶液的發(fā)光強度。另精密稱取于110干燥至恒重的氯化鈉0.293g,置100ml量瓶中，用水稀釋至刻度，再精密量取該溶液0.9ml、1.1ml、1.3ml、1.5ml、1.7ml，分別置50ml量瓶中，用水稀釋至刻度，制成0. 9mmol/L、1. 1mmol/L、1.3mmol/L、1.5 mmol/L、1.7mmol/L的系列標準鈉溶液，同法操作。 用系列標準鈉溶液的濃度對其相應的發(fā)光強度作直線回歸處理，將供試品溶液發(fā)光強度代入回歸方程，求得供試品溶液鈉離子濃度為(mmol/L),，再乘以

13、供試品的稀釋倍數(shù)(100),計算出供試品鈉離子含量。23 高效液相色譜法高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動相帶入柱內(nèi)，各成分在柱內(nèi)被分離，并依次進入檢測器，由記錄儀、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號。 應用HPLC對樣品進行分離分析，主要根據(jù)樣品的性質(zhì)選擇分離類型及相應的色譜柱，流動相，檢測器等。24 色譜條件 用苯乙烯二乙烯基苯共聚物為基質(zhì)的陽離子交換色潛柱(H+)，粒度9m或8m, 內(nèi)徑7.8mm, 柱長300mm; 柱溫為50; 流動相為0.004mol/L硫酸溶液，流速為每分鐘0.8ml，示差折光檢測器。25

14、精密稱取經(jīng)減壓干燥至恒重的枸椽酸鈉0.735g，置100ml量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，精密量取5.0ml、10.0ml、15.0ml，分別置25ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻, 即得相對應的5.0mmol/L、10.0mmol/L、15.0mmol/L枸檬酸離子對照品溶液。分別精密量取20l，注入液相色譜儀，記錄色譜圖; 另精密量取供試品溶液1 ml,置15 ml離心管中，精密加1.5%磺基水楊酸溶液lml ,混勻。室溫下以每分鐘2000轉(zhuǎn)離心10分鐘。取上清液，同法測定。 用對照品溶液的枸櫞酸離子濃度對峰面積進行直線回歸，求得回歸方程，計算出供試品溶液枸櫞酸鈉含量(mmol/L)，再乘

15、以供試品稀釋倍數(shù)，計算出供試品枸櫞酸離子含量(mmol/L).26 鑒于家兔法費時較長，操作繁瑣，近年來發(fā)展了體外熱原試驗法即鱟試驗法，其原理是利用鱟(Limus polyphemus)的變形細胞溶解物(amebecyte lysate)與內(nèi)毒素之間的凝集反應凝集反應來檢測或定量內(nèi)毒素。 通過凝膠限量試驗來檢測由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定。2728 凝膠法細菌內(nèi)毒素檢查用水系指內(nèi)毒素含量小于0. 015EU/ml的滅菌注射用水。 試驗所用的器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。常用的方法是在250干烤至少60分鐘，也可采用其他確證不干擾細菌內(nèi)毒

16、素檢查的適宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和一與微量加樣器配套的吸頭等，應選用標明無內(nèi)毒素并且對試驗無干擾的器械。試驗操作過程應防止微生物的污染。29 供試品溶液的制備供試品溶液的制備 某些供試品需進行復溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試品溶液的pH值在6.0-8.0的范圍內(nèi)。 對于過酸、過堿或本身有緩沖能力的供試品，需調(diào)節(jié)被測溶液(或其稀釋液)的pH值，可使用酸、堿溶液或鱟試劑生產(chǎn)廠家推薦的適宜的緩沖液調(diào)節(jié)pH值。酸或堿溶液須用細菌內(nèi)毒素檢查用水在已去除內(nèi)毒素的容器中配制。緩沖液必須經(jīng)過驗證不含內(nèi)毒素和干擾因子。3031式中L為供試品的細菌內(nèi)毒素限值;c為供試品溶液的濃度

17、，如供試為注射用無菌粉末或原料藥，則MVD取1,計算供試品的最小有效稀釋濃度c=/L; 為在凝膠法中鱟試劑的標示靈敏度(EU/ml)。 32 根據(jù)鱟試劑靈敏度的標示值（）將細菌內(nèi)毒素國家標準品或細菌內(nèi)毒素工作標準品用細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘，然后制成2、0.5和0.25四個濃度的內(nèi)毒素標準溶液，每稀釋一步均應在旋渦混合器上混勻30秒。取分裝有0. 1ml鱟試劑溶液的10* 75mm試管或復溶后的0. 1ml/支規(guī)格的鱟試劑原安瓶18支，其中16管分別加入0.1ml 不同濃度的內(nèi)毒素標準溶液， 每一個內(nèi)毒素濃度平行做4管; 另外2管加0.1ml細菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性

18、對照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37士1的恒溫器 中，保溫60分鐘士2分鐘。3334 將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180度若管內(nèi)形成凝膠，且不變形、不從管壁滑脫者為陽性;未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形并從管壁滑脫者為陰性。 保溫和拿取試管過程應避免受到振動造成假陰性結(jié)果。35 當最大濃度2管均為陽性，最低濃度0.25管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗方為有效。按下式計算反應終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值(c)。 c=lg-1(X/4)式中X為反應終點濃度的對數(shù)值(lg)。反應終點濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個是陽性結(jié)果的濃度。 當c在0.5-2

19、(包括0.5和2)時，方可用于細菌內(nèi)毒素檢查，并以標示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度。363738 Et =lg-1(Xt/4) Es =lg-1(Xs/4)0.5-2(包括0.5和2)(包括0.5Es和2Es)39 按下表制備溶液A,B,C和D。使用稀釋倍數(shù)為最大有效稀釋倍數(shù)并且已經(jīng)排除干擾的供試品溶液來制備溶液A和B。按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。 凝膠限量試驗溶液的制備注: A為供試品溶液, B為供試品陽性對照，C為陽性對照，D為陰性對照。40 保溫60分鐘+2分鐘后觀察結(jié)果。若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性，陽性對照溶液C的平行管均為陽性，試驗有效。

20、 若溶液A的兩個平行管均為陰性，判供試品符合規(guī)定;若溶液A的兩個平行管均為陽性，判供試品不符合規(guī)定。若溶液A的兩個平行管中的一管為陽性，另一管為陰性，需進行復試。復試時，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判供試品符合規(guī)定;否則判供試品不符合規(guī)定。41 本法系生物制品的非特異性毒性的通用安全驗檢查制品中是否污染外源性毒性物質(zhì)以及是否存在意外的不安全因素。 原理：用一定劑量的藥物按指定的操作方法和給藥途徑給予規(guī)定體重的某種試驗動物，觀察其毒性反應。反應的判斷以試驗動物的死亡與否為終點。42 - 除另有規(guī)定外，每批供試品用5只小鼠，注射前每只小鼠稱體重，應為18-22g。每只小鼠腹腔注射供試品0.5ml,觀察7天。觀察期內(nèi),小鼠應全部健存，且無異常反應，到期時每只小鼠體重應增加，供試品判為合格。如不符合上述要求，可用10只小鼠復試一次，判定標準同前。43 可見異物是指存在于注射劑中，在規(guī)定條件下目視可以觀測到的任何不溶性物質(zhì)。 實驗室檢測時應避免引入可見異物。當復溶凍干制劑時，或盛裝供試品的容器(如不透明、不規(guī)則形狀容器等)不適于檢測，需轉(zhuǎn)移至潔凈透明的適宜容器中時，均應在l00級潔凈環(huán)境(如層流凈化臺)中