基因克隆的載體

1、 基因克隆的載體基因克隆的載體 載體（載體（vectorvector）是由在細(xì)胞中能）是由在細(xì)胞中能夠自主復(fù)制的分子構(gòu)成的一種夠自主復(fù)制的分子構(gòu)成的一種遺傳成分，通過實(shí)驗(yàn)手段可使其它的遺傳成分，通過實(shí)驗(yàn)手段可使其它的片段連接在它的上面，而進(jìn)行片段連接在它的上面，而進(jìn)行復(fù)制，作為基因工程的載體，必須具復(fù)制，作為基因工程的載體，必須具備以下幾個(gè)性能：備以下幾個(gè)性能： 1 1、分子較小，可攜帶比較大的片段。、分子較小，可攜帶比較大的片段。 2 2、能獨(dú)立于染色體而進(jìn)行自主復(fù)制并且是高效的復(fù)制。、能獨(dú)立于染色體而進(jìn)行自主復(fù)制并且是高效的復(fù)制。 3 3、要有盡可能多種限制酶的切割位點(diǎn)，但每一種限制、要有

2、盡可能多種限制酶的切割位點(diǎn)，但每一種限制酶又要最少的切割位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)酶又要最少的切割位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn) multiple cloning sites ，MCSMCS） 。 4 4、有適合的標(biāo)記，易于選擇。、有適合的標(biāo)記，易于選擇。 5 5、有時(shí)還要求載體要能啟動(dòng)外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，、有時(shí)還要求載體要能啟動(dòng)外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，并且盡可能是高效的表達(dá)。并且盡可能是高效的表達(dá)。 6 6、從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于、從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實(shí)驗(yàn)室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制等等。在某些實(shí)驗(yàn)室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制等等。 載體載體功能功能克隆載體克隆載體: :

3、 克隆一個(gè)基因或克隆一個(gè)基因或DNADNA片斷片斷表達(dá)載體表達(dá)載體: : 用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá)用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá)整合載體整合載體: : 把一個(gè)基因插入到染色體組中把一個(gè)基因插入到染色體組中載載 體體來源：來源： 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 噬菌體載體噬菌體載體 柯斯質(zhì)粒載體柯斯質(zhì)粒載體 真核細(xì)胞克隆載體真核細(xì)胞克隆載體質(zhì)粒*受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片斷舉例 E.coli環(huán)狀 8*pUC18/19 , T-載體pGEM- 3z等 噬菌體E.coli線狀9 - 24kbEMBL系列， gt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀 10 kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35- 45kbpJB8,c2RB

4、, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV BAC (Bacterial Artificial Chromosome)E.coli環(huán)狀300 kbPel oBAC系列PAC (P1-derived Artificial chromosome)E.coli環(huán)狀100 - 2000 kbPCYPAC1YAC (Yeast Artificial chromosome )酵母細(xì)胞線性染色體100 - 2000 kbMAC (Mammalian Artificial Chromosome)哺乳類細(xì)胞線性染色體 1000 kb病毒載體動(dòng)物細(xì)胞環(huán)狀SV40 載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動(dòng)物細(xì)胞和

5、細(xì)菌環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，PBV,Ti質(zhì)粒載體的種類和特征載體的種類和特征第一節(jié)第一節(jié) 質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmidplasmid）載體）載體 質(zhì)粒是一種獨(dú)立于染色體外的小分子環(huán)狀質(zhì)粒是一種獨(dú)立于染色體外的小分子環(huán)狀DNADNA，一般大小約，一般大小約10106 610108 8D D，可自身復(fù)制和表，可自身復(fù)制和表達(dá)，有的質(zhì)粒還帶有可做為選擇性標(biāo)記的抗藥達(dá)，有的質(zhì)粒還帶有可做為選擇性標(biāo)記的抗藥性基因，所以質(zhì)粒經(jīng)過適當(dāng)改選后便可成為良性基因，所以質(zhì)粒經(jīng)過適當(dāng)改選后便可成為良好的載體。好的載體。 作為載體的質(zhì)粒大多是由天然質(zhì)粒經(jīng)人工適作為載體的質(zhì)粒大多是由天然質(zhì)粒經(jīng)人工適當(dāng)改造而成的，目前已有多種經(jīng)

6、改造的良好的當(dāng)改造而成的，目前已有多種經(jīng)改造的良好的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒載體。質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmidplasmid） 是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈?zhǔn)谴嬖谟诩?xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNADNA 分子。大小約為分子。大小約為 數(shù)千堿基對(duì)。常數(shù)千堿基對(duì)。常 有有1 31 3個(gè)抗藥個(gè)抗藥 性基因，以利于性基因，以利于 篩選。篩選。質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 克隆的質(zhì)粒載體克隆的質(zhì)粒載體 允許外源的允許外源的DNADNA插入，儲(chǔ)存。主插入，儲(chǔ)存。主要是要是DNADNA水平上的操作。水平上的操作。 基因表達(dá)的質(zhì)粒載體基因表達(dá)的質(zhì)粒載體 允許外源允許外源DNADNA的插入、儲(chǔ)存和表的插入、儲(chǔ)存和表達(dá)。達(dá)。一、一

7、、質(zhì)粒的生物學(xué)特性： 1、質(zhì)粒DNA的構(gòu)型： SC型 共價(jià)閉合環(huán)形DNA（cccDNA） OC型 開環(huán)DNA（ocDNA） L 型 線性DNA（cDNA） 2、不同質(zhì)粒的分子量大小差異相當(dāng)顯著： 106108D 3、作為載體的質(zhì)粒都含有三種共同的組分： 復(fù)制基因（replicator）、選擇性記號(hào)、克隆位點(diǎn) LOCSC4、質(zhì)粒DNA編碼著一些重要的非染色體控制的遺傳性狀。 抗性特征、代謝特征、修飾寄主生活方式的因子都等抗性特征、代謝特征、修飾寄主生活方式的因子都等5、質(zhì)粒DNA的類型： 接合型和非接合型；含大腸桿菌素Col質(zhì)粒和含抗菌 素抗性基因的R質(zhì)粒；F因子和F因子等。按接合轉(zhuǎn)移功能分類主

8、要基因按抗性記號(hào)分類非接合型質(zhì)粒自主復(fù)制基因，長(zhǎng)生大腸桿菌素基因Col質(zhì)粒自主復(fù)制基因，抗菌素抗性基因R質(zhì)粒(R因子) 接合型質(zhì)粒自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，細(xì)菌染色體區(qū)段F質(zhì)粒（ F因子）自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，大腸桿菌素基因Col質(zhì)粒自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，抗菌素抗性基因R質(zhì)粒(R因子)自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，大腸桿菌素基因Ent質(zhì)粒6 6、質(zhì)粒、質(zhì)粒DNADNA的復(fù)制類型：的復(fù)制類型： 低拷貝的質(zhì)粒（低拷貝的質(zhì)粒（1 13 3）：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒）：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒 （接合型）（接合型） 高拷貝的質(zhì)粒（高拷貝的質(zhì)粒（10601060）：松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒）：松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒（非

9、接合型）（非接合型） 7 7、質(zhì)粒的不親合性、質(zhì)粒的不親合性 在同一個(gè)大腸桿菌細(xì)胞，一般不能同時(shí)含有兩種不在同一個(gè)大腸桿菌細(xì)胞，一般不能同時(shí)含有兩種不同的。也稱為質(zhì)粒的不相容性。同的。也稱為質(zhì)粒的不相容性。 是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親源關(guān)系密切是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親源關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。存的現(xiàn)象。 質(zhì)粒的不親合性分子基礎(chǔ)，主要是由于它們?cè)趶?fù)制質(zhì)粒的不親合性分子基礎(chǔ)，主要是由于它們?cè)趶?fù)制功能之間的相互干擾造成的。功能之間的相互干擾造成的。（二二 ） 、質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的分離與純化的分

10、離與純化 1 1、氯化銫密度梯度離心法；、氯化銫密度梯度離心法； 2 2、堿變性法；、堿變性法； 3 3、微量堿變性法。、微量堿變性法。 1.氯化銫密度梯度離心法 1、質(zhì)粒DNA占總DNA的1%2%； 2、在細(xì)胞裂解及DNA分離過程中，大分子量的細(xì)菌染色體易斷裂成線性片斷，而質(zhì)粒DNA分子量小，結(jié)構(gòu)緊密仍保持完整的狀態(tài)； 3、染色劑溴化乙錠（EB）能摻入到DNA鏈的堿基中，導(dǎo)致鏈的解旋；而且形成的EB- DNA復(fù)合物中，EB含量越高，密度會(huì)越低。流程：流程： 首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸鈉首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸鈉（SDSSDS）來促進(jìn)大腸桿菌的細(xì)胞裂解。）來促進(jìn)大腸桿菌的細(xì)胞裂解。 將溴

11、化乙錠的氯化銫溶液加到清亮的將溴化乙錠的氯化銫溶液加到清亮的大腸桿菌裂解液中，大腸桿菌裂解液中，EBEB會(huì)嵌入到會(huì)嵌入到DNADNA鏈鏈的堿基中去。的堿基中去。 在在EBEB達(dá)到飽和時(shí)，進(jìn)行氯化銫密度達(dá)到飽和時(shí)，進(jìn)行氯化銫密度梯度離心。梯度離心。 2. 2.堿變性法：堿變性法： 根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNADNA與線性染色體與線性染色體DNADNA片斷之間，在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而發(fā)展出來片斷之間，在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而發(fā)展出來的。的。 在在PHPH值值12.012.012.512.5范圍內(nèi)時(shí)，線性的范圍內(nèi)時(shí)，線性的DNADNA會(huì)被變性而共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒會(huì)被變性而共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA

12、DNA卻卻不會(huì)被變不會(huì)被變性。性。 通過冷卻或恢復(fù)中性通過冷卻或恢復(fù)中性PHPH值使之復(fù)性，線性值使之復(fù)性，線性染色體形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而染色體形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而cccDNAcccDNA可以準(zhǔn)確迅可以準(zhǔn)確迅速?gòu)?fù)性，通過離心去除線性染色體，獲得含有速?gòu)?fù)性，通過離心去除線性染色體，獲得含有cccDNAcccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質(zhì)的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質(zhì)粒粒DNADNA3.3.堿變性法：堿變性法：1 1、取、取1.51.5毫升含質(zhì)粒的大腸桿菌過夜培養(yǎng)物，加在毫升含質(zhì)粒的大腸桿菌過夜培養(yǎng)物，加在微量離心管中，離心收集細(xì)胞沉淀；微量離心管中，離心收集細(xì)胞沉淀；2 2、加入、加入1001

13、00微升冰冷的微升冰冷的液，（液，（50mM50mM葡萄糖，葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA，45mg45mg溶菌酶）靜置溶菌酶）靜置5 5分鐘；分鐘；3 3、加入、加入200200微升微冷的微升微冷的液（液（0.2NaOH0.2NaOH，1.0%SDS1.0%SDS）緩緩緩緩混勻置室溫混勻置室溫5 5分鐘。分鐘。 6565度水浴一段時(shí)間會(huì)加強(qiáng)染色體度水浴一段時(shí)間會(huì)加強(qiáng)染色體DNADNA的變性作用。的變性作用。4 4、加入、加入150150毫升冰冷的毫升冰冷的PH=4.8PH=4.8的的3M3

14、M醋酸鈉，振蕩醋酸鈉，振蕩后，冰浴后，冰浴5 5分鐘。分鐘。5 5、離心的上清液用苯酚抽提數(shù)次，用乙醇沉淀收、離心的上清液用苯酚抽提數(shù)次，用乙醇沉淀收集質(zhì)粒集質(zhì)粒DNADNA。4.影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素： 1 1、寄主菌株的遺傳背景、寄主菌株的遺傳背景 使用使用endAendA基因發(fā)生突變的菌株，編碼核酸內(nèi)基因發(fā)生突變的菌株，編碼核酸內(nèi)切酶切酶從野生型的菌株中提取質(zhì)粒須采取的措施： 選擇最適的培養(yǎng)條件，以限制在細(xì)胞選擇最適的培養(yǎng)條件，以限制在細(xì)胞生長(zhǎng)期間，體內(nèi)核酸內(nèi)切酶生長(zhǎng)期間，體內(nèi)核酸內(nèi)切酶 的表達(dá)；的表達(dá)； 在純化質(zhì)粒在純化質(zhì)粒DNADNA的過程中，用加熱法的過程中，用加熱法核酸內(nèi)切酶核

15、酸內(nèi)切酶使失活；使失活； 采用最佳的實(shí)驗(yàn)流程，減少采用最佳的實(shí)驗(yàn)流程，減少核酸內(nèi)切核酸內(nèi)切酶酶的污染并在純化了質(zhì)粒的污染并在純化了質(zhì)粒DNADNA之后，迅速除之后，迅速除去污染的核酸酶。去污染的核酸酶。 2 2、質(zhì)粒的、質(zhì)粒的拷貝數(shù)拷貝數(shù)及分子的大小及分子的大小 插入分子量大的外源插入分子量大的外源DNADNA會(huì)引起質(zhì)?？綍?huì)引起質(zhì)粒拷貝數(shù)的下降。貝數(shù)的下降。（三）、質(zhì)粒載體的構(gòu)建與類型（三）、質(zhì)粒載體的構(gòu)建與類型 1. 1. 天然質(zhì)粒：天然質(zhì)粒：沒有經(jīng)過以基因克隆為目標(biāo)沒有經(jīng)過以基因克隆為目標(biāo) 的體外修飾改造的質(zhì)粒。的體外修飾改造的質(zhì)粒。 在大腸桿菌中，常見的可用于基因克隆的在大腸桿菌中，常見

16、的可用于基因克隆的天然質(zhì)粒有天然質(zhì)粒有EolE1、RSF2124和和pSC101等，等，但存在一定的局限性。但存在一定的局限性。 第一個(gè)用于基因克隆的天然質(zhì)粒第一個(gè)用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，它含有一個(gè)，它含有一個(gè)EcoR酶切位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)，一個(gè)四環(huán)素抗性選擇記號(hào)（一個(gè)四環(huán)素抗性選擇記號(hào)（Tetr ），插），插入外源片斷后不影響其復(fù)制功能，入外源片斷后不影響其復(fù)制功能，但該但該質(zhì)粒分子量較大，拷貝數(shù)低只具有抗菌質(zhì)粒分子量較大，拷貝數(shù)低只具有抗菌素抗性基因，無法使用插入失活技術(shù)選素抗性基因，無法使用插入失活技術(shù)選擇重組分子。擇重組分子。 ColE1 ColE1質(zhì)粒在其唯一的單切割位點(diǎn)質(zhì)粒

17、在其唯一的單切割位點(diǎn)EcoRlEcoRl中克隆外源中克隆外源DNADNA片斷后，可根據(jù)對(duì)片斷后，可根據(jù)對(duì)大腸桿菌素大腸桿菌素E1E1的免疫性選擇轉(zhuǎn)化子，不的免疫性選擇轉(zhuǎn)化子，不能合成大腸桿菌素能合成大腸桿菌素E1E1的菌落是具有重組的菌落是具有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。但對(duì)大腸桿菌素但對(duì)大腸桿菌素E1E1的免的免疫篩選，在化學(xué)上是相當(dāng)麻煩的。疫篩選，在化學(xué)上是相當(dāng)麻煩的。2. 2.質(zhì)粒載體必須具備的基本條件質(zhì)粒載體必須具備的基本條件 (1) 、具有復(fù)制起點(diǎn)；、具有復(fù)制起點(diǎn)； 自我增值的基本條件，一般具自我增值的基本條件，一般具一個(gè)一個(gè)復(fù)制子。復(fù)制子。 (2) 、具有抗菌素抗性；、具有抗菌

18、素抗性； 理想的質(zhì)粒載體具有理想的質(zhì)粒載體具有兩種兩種抗菌素抗性基因。抗菌素抗性基因。 (3) 、具有若干限制酶切、具有若干限制酶切單一單一位點(diǎn)（位點(diǎn)（CMS）；）； (4) 、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。 低分子量的質(zhì)粒易于操作，克隆外源片斷低分子量的質(zhì)粒易于操作，克隆外源片斷 后仍能有效的轉(zhuǎn)化給受體細(xì)胞同時(shí)低分子量后仍能有效的轉(zhuǎn)化給受體細(xì)胞同時(shí)低分子量的質(zhì)粒對(duì)限制酶具有多重識(shí)別位點(diǎn)的幾率也較低；的質(zhì)粒對(duì)限制酶具有多重識(shí)別位點(diǎn)的幾率也較低；較高的拷貝數(shù)可獲得大量的克隆基因較高的拷貝數(shù)可獲得大量的克隆基因以Ampr和Tetr為選擇性標(biāo)記，克隆位點(diǎn)在這兩個(gè)選

19、擇性標(biāo)記的單酶切位點(diǎn)上。選擇AmprTets或AmpsTetr的重組子。（4363bp） 3.質(zhì)粒載體的選擇記號(hào)質(zhì)粒載體的選擇記號(hào) 新陳代謝特性；新陳代謝特性； 對(duì)大腸桿菌素對(duì)大腸桿菌素E1的免疫性；的免疫性； 抗菌素抗性；抗菌素抗性； 四環(huán)素抗性、氨芐青霉素抗性、四環(huán)素抗性、氨芐青霉素抗性、 鏈霉素抗性、卡那霉素抗性鏈霉素抗性、卡那霉素抗性 大多數(shù)質(zhì)粒本身帶有抗菌素基因；大多數(shù)質(zhì)粒本身帶有抗菌素基因； 抗菌素抗性記號(hào)便于操作、易于選擇?？咕乜剐杂浱?hào)便于操作、易于選擇。4. 4.不同類型的質(zhì)粒載體不同類型的質(zhì)粒載體高拷貝的質(zhì)粒載體高拷貝的質(zhì)粒載體克隆的目的是為分離大量的高純度的克隆基因克隆的

20、目的是為分離大量的高純度的克隆基因低拷貝的質(zhì)粒載體低拷貝的質(zhì)粒載體 有些克隆的編碼基因，其產(chǎn)物含量過高會(huì)有些克隆的編碼基因，其產(chǎn)物含量過高會(huì)嚴(yán)重的干擾寄主細(xì)胞的正常新陳代謝活動(dòng)。嚴(yán)重的干擾寄主細(xì)胞的正常新陳代謝活動(dòng)。 編碼表面結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一些基因、調(diào)節(jié)細(xì)胞基編碼表面結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一些基因、調(diào)節(jié)細(xì)胞基礎(chǔ)代謝活動(dòng)的蛋白質(zhì)編碼基因以及囊纖維化跨礎(chǔ)代謝活動(dòng)的蛋白質(zhì)編碼基因以及囊纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因等。膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因等。 (1)(1)失控的質(zhì)粒載體失控的質(zhì)粒載體 復(fù)制控制是溫度敏感型的低拷貝的質(zhì)粒。復(fù)制控制是溫度敏感型的低拷貝的質(zhì)粒。ExampleExample： pBEU1pBEU

21、1和和pBEU2pBEU2質(zhì)粒，在質(zhì)粒，在3030度下，每個(gè)寄度下，每個(gè)寄主細(xì)胞只含有適量的拷貝數(shù)，當(dāng)培養(yǎng)溫度超過主細(xì)胞只含有適量的拷貝數(shù)，當(dāng)培養(yǎng)溫度超過3535度時(shí)，質(zhì)粒的復(fù)制將失去控制，每個(gè)細(xì)胞中度時(shí)，質(zhì)粒的復(fù)制將失去控制，每個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)便持續(xù)上升。在這種高溫環(huán)境下，細(xì)的拷貝數(shù)便持續(xù)上升。在這種高溫環(huán)境下，細(xì)胞的生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)的合成可按正常的速率持續(xù)胞的生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)的合成可按正常的速率持續(xù)2323小時(shí)。最后得到超量的基因編碼產(chǎn)物，細(xì)小時(shí)。最后得到超量的基因編碼產(chǎn)物，細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制失去存活能力，積累的質(zhì)粒胞生長(zhǎng)受抑制失去存活能力，積累的質(zhì)粒DNADNA占細(xì)胞總占細(xì)胞總DNADNA的的50%

22、50%。 (2)(2)插入失活型質(zhì)粒載體插入失活型質(zhì)粒載體 將外源將外源DNA片斷插入在質(zhì)粒上會(huì)導(dǎo)片斷插入在質(zhì)粒上會(huì)導(dǎo)致選擇記號(hào)基因失活的位點(diǎn)，就有可能致選擇記號(hào)基因失活的位點(diǎn)，就有可能通過抗菌素抗性的篩選，大幅度的提高通過抗菌素抗性的篩選，大幅度的提高獲得陽(yáng)性克隆的機(jī)會(huì)。獲得陽(yáng)性克隆的機(jī)會(huì)。ExampleExample： 在在pBR329質(zhì)粒載體的質(zhì)粒載體的EcoR1位點(diǎn)插入外位點(diǎn)插入外源片斷，會(huì)使氯霉素抗性基因失活，在源片斷，會(huì)使氯霉素抗性基因失活，在篩選的氯霉素敏感的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞群體中，篩選的氯霉素敏感的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞群體中，含有插入片斷的重組體質(zhì)粒的幾率會(huì)顯含有插入片斷的重組體質(zhì)粒的幾率會(huì)顯

23、著上升。著上升。 (3)(3)正選擇的質(zhì)粒載體正選擇的質(zhì)粒載體正向選擇：應(yīng)用只有突變體或重組體才能正向選擇：應(yīng)用只有突變體或重組體才能 正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件進(jìn)行選擇。正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件進(jìn)行選擇。 這種質(zhì)粒載體具有直接選擇記號(hào)這種質(zhì)粒載體具有直接選擇記號(hào) 并可并可 賦予寄主細(xì)胞相應(yīng)的表型。賦予寄主細(xì)胞相應(yīng)的表型。ExampleExample： 質(zhì)粒質(zhì)粒pKN80pKN80有來自有來自MuMu噬菌體噬菌體DNADNA的的EcoR1-CEcoR1-C的片斷，編碼一種致的片斷，編碼一種致死功能的死功能的kilkil基因?；?。該質(zhì)粒在該質(zhì)粒在MuMu噬菌體的溶噬菌體的溶源菌株中正常復(fù)制；源菌株中正常復(fù)制

24、；在非溶源菌株中是致在非溶源菌株中是致死的。死的。在在HindHind 或或Hpa Hpa 位點(diǎn)位點(diǎn)插入外源插入外源DNADNA片斷后，片斷后，會(huì)產(chǎn)生具會(huì)產(chǎn)生具AmpAmpr表型的表型的MuMu噬菌體的非溶源的噬菌體的非溶源的轉(zhuǎn)化子菌株。轉(zhuǎn)化子菌株。正向選擇質(zhì)粒載體的條件限制：正向選擇質(zhì)粒載體的條件限制： 1、需要特殊的寄主菌株或選擇培養(yǎng)基、需要特殊的寄主菌株或選擇培養(yǎng)基 2、可使用的克隆位點(diǎn)少、可使用的克隆位點(diǎn)少 3、 假陽(yáng)性水平高假陽(yáng)性水平高 4、 不能夠調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)活性不能夠調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)活性 (4)表達(dá)型的質(zhì)粒載體表達(dá)型的質(zhì)粒載體表達(dá)載體：表達(dá)載體： 按特殊設(shè)計(jì)構(gòu)建的，按特殊設(shè)計(jì)

25、構(gòu)建的，能使克隆在其中特定位點(diǎn)的外源能使克隆在其中特定位點(diǎn)的外源真核基因的編碼序列，在大腸桿真核基因的編碼序列，在大腸桿菌細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯成相應(yīng)菌細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯成相應(yīng)蛋白質(zhì)的克隆載體。蛋白質(zhì)的克隆載體。 主要包括：大腸桿菌的啟動(dòng)子、及操主要包括：大腸桿菌的啟動(dòng)子、及操縱位點(diǎn)序列、多克隆位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)縱位點(diǎn)序列、多克隆位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)譯信號(hào)、質(zhì)粒載體的復(fù)制起點(diǎn)及抗菌譯信號(hào)、質(zhì)粒載體的復(fù)制起點(diǎn)及抗菌素抗性基因。素抗性基因。 待表達(dá)的真核基因編碼序列被克隆待表達(dá)的真核基因編碼序列被克隆在緊挨于啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)上，在緊挨于啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)上，而且必須是其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸末而且必須

26、是其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸末端這一頭靠近啟動(dòng)子方向插入，才能端這一頭靠近啟動(dòng)子方向插入，才能在啟動(dòng)子控制下進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄。在啟動(dòng)子控制下進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄。 四、重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體四、重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體 1 1、pSC101pSC101質(zhì)粒載體；質(zhì)粒載體； 2 2、ColE ColE 質(zhì)粒載體；質(zhì)粒載體； 3 3、pBR322pBR322質(zhì)粒載體；質(zhì)粒載體； 4 4、pUCpUC質(zhì)粒載體；質(zhì)粒載體； 5. 5. 其它的重要的質(zhì)粒載體其它的重要的質(zhì)粒載體1. 1.pSC101pSC101質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 一種嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制控制的地拷貝數(shù)的大腸一種嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制控制的地拷貝數(shù)的大腸桿菌質(zhì)粒載體。平均每個(gè)寄

27、主細(xì)胞僅有桿菌質(zhì)粒載體。平均每個(gè)寄主細(xì)胞僅有1212個(gè)拷貝；分子量個(gè)拷貝；分子量9.09kb9.09kb，編碼有一個(gè)，編碼有一個(gè)四環(huán)素抗性基因（四環(huán)素抗性基因（tettetr r ）。有）。有HindHind 、EcoREcoR、BamH BamH 、Sal Sal 、Xho Xho 、PvuPvu、 Sma Sma 7 7種核酸內(nèi)切限制酶。其種核酸內(nèi)切限制酶。其中在中在HindHind 、 BamH BamH 、 Sma Sma 3 3個(gè)位點(diǎn)個(gè)位點(diǎn)克隆外源克隆外源DNADNA，都會(huì)導(dǎo)致，都會(huì)導(dǎo)致tettetr r 基因失活?；蚴Щ?。 是第一個(gè)真核生物的克隆載體。是第一個(gè)真核生物的克隆載體。

28、（1）應(yīng)用pSC101質(zhì)粒作基因克隆載體 葡萄球菌質(zhì)粒基因在大腸桿菌中的表達(dá) 金黃色葡萄球菌的質(zhì)粒p1258,編碼若干種能 在大腸桿菌檢測(cè)的結(jié)構(gòu)基因；能被核酸限制酶 EcoR 切割成4段。（2）應(yīng)用pSC101質(zhì)粒作基因克隆載體 在大腸桿菌中克隆非洲爪蟾DNA 用核酸內(nèi)切酶EcoR 消化非洲爪蟾的核糖體DNA（ rDNA ），與EcoR 消化的pSC101質(zhì)粒進(jìn)行重組。 在挑取的55個(gè)轉(zhuǎn)化子中，經(jīng) EcoR 酶切，電泳后13個(gè)轉(zhuǎn)化子含有外源片斷。轉(zhuǎn)化率23.62. 2.ColE ColE 1 1質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 松弛型復(fù)制控制的多拷貝的質(zhì)粒，能產(chǎn)生細(xì)菌素。細(xì)菌素對(duì)大腸桿菌的正常生命活動(dòng)有抑制作

29、用（復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯能量代謝等）。但含有對(duì)細(xì)菌素的免疫基因。 用 ColE 1質(zhì)粒特征為基礎(chǔ)建立的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，存在一定的缺陷性： 1、應(yīng)用大腸桿菌素免疫作為標(biāo)記操作上不方便； 2、在細(xì)菌群體中，能夠以相當(dāng)高的頻率自發(fā)的產(chǎn)生出抗菌素的突變體細(xì)胞。3.pBR322質(zhì)粒載體 “P”表示是一種質(zhì)粒； “BR”表示兩位主要構(gòu)建者姓氏的頭一個(gè)字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”;“322”表示實(shí)驗(yàn)編號(hào)。 四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素 抗性基因O r i Pst Sal Pvu Ava Bam HHind Eco RpBR322(amp(ampr r) )(ter(terr r) )pBR32

30、2pBR322的構(gòu)建：的構(gòu)建： 為改進(jìn)轉(zhuǎn)化子篩選技術(shù)，并具有相對(duì)為改進(jìn)轉(zhuǎn)化子篩選技術(shù)，并具有相對(duì)小的分子量、高拷貝數(shù)、外源基因插入小的分子量、高拷貝數(shù)、外源基因插入不影響質(zhì)粒的復(fù)制功能、多克隆位點(diǎn)不影響質(zhì)粒的復(fù)制功能、多克隆位點(diǎn)（多種限制酶的單一切割位點(diǎn)）、質(zhì)粒（多種限制酶的單一切割位點(diǎn)）、質(zhì)粒的穩(wěn)定性（克服質(zhì)粒的結(jié)合轉(zhuǎn)移能力）的穩(wěn)定性（克服質(zhì)粒的結(jié)合轉(zhuǎn)移能力） pBR322pBR322的結(jié)構(gòu)來源的結(jié)構(gòu)來源pBR322pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)：質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)： 1 1、具有較小的分子量；、具有較小的分子量； 它的分子量為它的分子量為4363bp4363bp?？寺≥d體的分子量大小。克隆載體的分

31、子量大小不要超過不要超過10kb10kb。 2 2、具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)。選擇記號(hào)。 pBR322 DNApBR322 DNA分子中總共有分子中總共有2424種核酸內(nèi)切酶只具有種核酸內(nèi)切酶只具有單一的酶切識(shí)別位點(diǎn)。其中單一的酶切識(shí)別位點(diǎn)。其中7 7種內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)種內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，2 2種識(shí)別位點(diǎn)在于這個(gè)基種識(shí)別位點(diǎn)在于這個(gè)基因的啟動(dòng)區(qū)內(nèi)，所以因的啟動(dòng)區(qū)內(nèi)，所以9 9個(gè)限制酶切位點(diǎn)插入外源片個(gè)限制酶切位點(diǎn)插入外源片斷可以導(dǎo)致斷可以導(dǎo)致tettetr r 基因的失活；另外有基因的失活；另外有

32、3 3種限制酶在種限制酶在氨芐青霉素抗性基因有單一的識(shí)別位點(diǎn)，氨芐青霉素抗性基因有單一的識(shí)別位點(diǎn)，Example:a. 在pBR322質(zhì)粒的BamH或Sal位點(diǎn)插入外源DNA片斷，切斷了tettetr r基因編碼序列的連續(xù)性，使之失去活性，產(chǎn)生出Ampr rTets s表型的重組pBR322質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入Amps sTets s的大腸桿菌細(xì)胞。先涂布在含氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上，篩選出具Ampr r菌落，再將它們涂布于含四環(huán)素的選擇性培養(yǎng)基上。插入外源片斷的重組質(zhì)粒不能在這種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。B X BBBXAmproriAmpsTetroriAmprTetroripBR322BABBTetsX b

33、.在Pst或Sca識(shí)別位點(diǎn)插入外源片斷會(huì)導(dǎo)致Ampr r基因的失活，產(chǎn)生Amps sTetr r表型的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化大腸桿菌之后，獲得的重組子可以比較快的檢測(cè)出來。其依據(jù)是Ampr r表型的細(xì)胞可以合成 內(nèi)酰胺酶，它能使青霉素轉(zhuǎn)變成青霉酮酸，而這種青霉酮酸能與碘結(jié)合。在含有可溶性淀粉和四環(huán)素的富裕培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子，經(jīng)37度培養(yǎng)過夜后，在此平板上加入少量的碘指示劑溶液產(chǎn)生青霉素 內(nèi)酰胺酶Ampr r的菌落，其周圍的碘指示劑溶液變得明亮，而Amps s菌落無此反應(yīng)。 3、具有較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素?cái)U(kuò)增之后每個(gè)細(xì)胞中可積累10003000個(gè)拷貝。 pBR322pBR322質(zhì)粒載體的改良質(zhì)粒載體的

34、改良 為了更加實(shí)用，人們對(duì)為了更加實(shí)用，人們對(duì)pBR322pBR322質(zhì)粒進(jìn)質(zhì)粒進(jìn)行了改良，得到許多行了改良，得到許多pBR322pBR322質(zhì)粒衍生質(zhì)質(zhì)粒衍生質(zhì)粒，它們各自具有不同的特點(diǎn)。粒，它們各自具有不同的特點(diǎn)。應(yīng)用應(yīng)用pBR322pBR322質(zhì)粒作為基因克隆載體質(zhì)粒作為基因克隆載體 水稻葉綠體光誘導(dǎo)基因水稻葉綠體光誘導(dǎo)基因psbApsbA的結(jié)構(gòu)分析的結(jié)構(gòu)分析 基因基因psbApsbA編碼的蛋白質(zhì)，與光合作用系編碼的蛋白質(zhì)，與光合作用系統(tǒng)統(tǒng)相關(guān)，并且它能與除草劑阿特拉津結(jié)合，相關(guān)，并且它能與除草劑阿特拉津結(jié)合，它的第它的第264264位氨基酸發(fā)生取代反應(yīng)，由絲氨酸位氨基酸發(fā)生取代反應(yīng)，由

35、絲氨酸變?yōu)楦拾彼?，可?dǎo)致其失去與變?yōu)楦拾彼?，可?dǎo)致其失去與除草劑阿特拉津除草劑阿特拉津結(jié)合的能力結(jié)合的能力，推測(cè)是三維結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，推測(cè)是三維結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變 ；在；在原生生物衣藻、藍(lán)色細(xì)菌中，此蛋白質(zhì)在同一原生生物衣藻、藍(lán)色細(xì)菌中，此蛋白質(zhì)在同一位置由絲氨酸變?yōu)楸彼岬娜〈磻?yīng)，會(huì)使他位置由絲氨酸變?yōu)楸彼岬娜〈磻?yīng)，會(huì)使他們獲得對(duì)除草劑的抗性功能。們獲得對(duì)除草劑的抗性功能。 而且，非競(jìng)爭(zhēng)條件下，對(duì)除草劑阿特拉而且，非競(jìng)爭(zhēng)條件下，對(duì)除草劑阿特拉津抗性的千里光屬和莧屬，干物質(zhì)產(chǎn)量比敏感津抗性的千里光屬和莧屬，干物質(zhì)產(chǎn)量比敏感植物下降了植物下降了25%25%和和40%40%。 通過對(duì)基因通過對(duì)基

36、因psbApsbA的體外操作，有可能創(chuàng)造的體外操作，有可能創(chuàng)造出抗除草劑的或高光效的轉(zhuǎn)基因植株。用出抗除草劑的或高光效的轉(zhuǎn)基因植株。用pBR322pBR322質(zhì)粒作為載體，成功的克隆了水稻的質(zhì)粒作為載體，成功的克隆了水稻的psbApsbA基因?；?。 首先將水稻葉綠體首先將水稻葉綠體DNADNA，用，用EcoREcoR內(nèi)切酶消內(nèi)切酶消化，經(jīng)含有溴化乙錠的熔點(diǎn)瓊脂糖電泳，回收化，經(jīng)含有溴化乙錠的熔點(diǎn)瓊脂糖電泳，回收分子大小為分子大小為1.81.82.5kb2.5kb之間的之間的DNADNA片斷。片斷。 再與經(jīng)過再與經(jīng)過EcoREcoR內(nèi)切酶切割并用堿性磷酸酶內(nèi)切酶切割并用堿性磷酸酶作了脫磷酸處理

37、的作了脫磷酸處理的pBR322pBR322質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA連接。連接。 然后轉(zhuǎn)化給大腸桿菌，在氨芐青霉素的選擇然后轉(zhuǎn)化給大腸桿菌，在氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上，形成培養(yǎng)基上，形成AmpAmpr r轉(zhuǎn)化子菌落群體。轉(zhuǎn)化子菌落群體。 用經(jīng)用經(jīng)32p32p標(biāo)記的玉米標(biāo)記的玉米psdADNApsdADNA探針作菌落雜探針作菌落雜交，從交，從10001000多個(gè)菌落中篩選出多個(gè)菌落中篩選出8 8個(gè)陽(yáng)性克隆。個(gè)陽(yáng)性克隆。 對(duì)這8個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行進(jìn)一步的Southern分析，表明6個(gè)片斷帶有長(zhǎng)度為2.2kb的編碼水稻葉綠體psdA基因。實(shí)際上其中1.2kb的片斷編碼著水稻psdA基因的全部序列。通過dna序

38、列分析表明與高等植物的同原性在92%，與藍(lán)色細(xì)菌同源性75%4. 4. pUCpUC質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 人們應(yīng)用多克隆位點(diǎn)技術(shù)，人們應(yīng)用多克隆位點(diǎn)技術(shù)，在在pBR322pBR322的基礎(chǔ)上，組入了一的基礎(chǔ)上，組入了一個(gè)在其個(gè)在其5-5-端帶有一段多克隆位端帶有一段多克隆位點(diǎn)的點(diǎn)的lacZlacZ基因，而發(fā)展的具有基因，而發(fā)展的具有雙功能檢測(cè)特性的新型質(zhì)粒載體雙功能檢測(cè)特性的新型質(zhì)粒載體系列。系列。 一種典型的一種典型的pUCpUC系列的質(zhì)粒載體，包括以下系列的質(zhì)粒載體，包括以下四個(gè)部分：四個(gè)部分： 1 1、來自、來自pBR322pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（oriori）；）； 2

39、 2、氨芐青霉素抗性基因（、氨芐青霉素抗性基因（ampampr r ）, ,但它的但它的DNADNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不在含有原核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不在含有原來的核酸內(nèi)切限制酶的但識(shí)別位點(diǎn)。來的核酸內(nèi)切限制酶的但識(shí)別位點(diǎn)。 3 3、大腸桿菌、大腸桿菌-半乳糖基因（半乳糖基因（lacZlacZ）的啟動(dòng)子）的啟動(dòng)子及編碼及編碼-肽鏈的肽鏈的DNADNA序列，此結(jié)構(gòu)稱之為序列，此結(jié)構(gòu)稱之為lacZlacZ基因；基因； 4 4、位于、位于lacZlacZ基因中的靠近基因中的靠近5-5-端的一段多端的一段多克隆位點(diǎn)（克隆位點(diǎn)（MCSMCS）區(qū)段。但它并不破壞該基因）區(qū)段。但它并不破壞該基因

40、的功能。的功能。AmproripUC18(3 kb)MCS (Multiple cloning sites,多科隆位點(diǎn)）Lac promoterlacZpUCpUC質(zhì)粒載體的形體圖質(zhì)粒載體的形體圖pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)第一， 具有較小的分子量和更高的拷貝數(shù); 僅保留了pBR322的氨芐青霉素抗性基因和復(fù)制起點(diǎn)；在操作過程中復(fù)制起點(diǎn)內(nèi)部發(fā)生了自發(fā)突變?cè)斐闪嘶騬op的缺失，它是控制質(zhì)粒的特殊因子，從而使拷貝數(shù)增加，平均每個(gè)細(xì)胞500700個(gè)拷貝。第二，適用于組織化學(xué)檢測(cè)重組體； 具有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ基因，所編碼的-肽鏈可參與- 互補(bǔ)作用，用Xgal顯色對(duì)重組子進(jìn)行鑒定，而pBR3

41、22質(zhì)粒的重組子要進(jìn)行兩步的選擇。 第三，具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)段 方便具有不同粘性末端的外源片斷的插入。5. 5.其它的重要的質(zhì)粒載體其它的重要的質(zhì)粒載體喪失遷移功能的質(zhì)粒載體能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體穿梭質(zhì)粒載體（1 1）喪失遷移功能的質(zhì)粒載體）喪失遷移功能的質(zhì)粒載體第一：擁有較高水平的拷貝數(shù)第一：擁有較高水平的拷貝數(shù), ,平平均每個(gè)大腸桿菌寄主細(xì)胞可達(dá)均每個(gè)大腸桿菌寄主細(xì)胞可達(dá)30453045份份; ; 第二第二: :失去了失去了bombom位點(diǎn)，即便在共位點(diǎn)，即便在共存的存的F F質(zhì)粒提供轉(zhuǎn)移裝置的條件下，質(zhì)粒提供轉(zhuǎn)移裝置的條件下，也不可能發(fā)生遷移作用。也不可能發(fā)生遷移作用。（2）

42、能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體 pGEM-3Z是一種與pUC系列十分類似的小分子的質(zhì)粒載體，總長(zhǎng)度2743bp，編碼有一個(gè)氨芐青霉素抗性基因和一個(gè)lacZ基因。 pGEM-3Z與pUC質(zhì)粒之間的主要區(qū)別是，它具有兩個(gè)來自噬菌體的啟動(dòng)子，即T7啟動(dòng)子和SP6啟動(dòng)子，它們?yōu)镽NA聚合酶的附著作用提供了特異的識(shí)別位點(diǎn)。pGEM-11 現(xiàn)在以發(fā)展出了一大批在多克隆位現(xiàn)在以發(fā)展出了一大批在多克隆位點(diǎn)區(qū)附近參入噬菌體點(diǎn)區(qū)附近參入噬菌體RNARNA聚合酶啟動(dòng)子聚合酶啟動(dòng)子的簡(jiǎn)單的質(zhì)粒載體，它們都是由的簡(jiǎn)單的質(zhì)粒載體，它們都是由pUCpUC系系列載體派生而來的。列載體派生而來的。 噬菌體的噬菌體的RNARNA

43、聚合酶，所合成的聚合酶，所合成的RNARNA轉(zhuǎn)錄本除了可作為雜交探針之外，轉(zhuǎn)錄本除了可作為雜交探針之外，在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)譯體系或在麥在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)譯體系或在麥胚無細(xì)胞轉(zhuǎn)移體系中進(jìn)行體外蛋白質(zhì)的胚無細(xì)胞轉(zhuǎn)移體系中進(jìn)行體外蛋白質(zhì)的合成。在反應(yīng)混合物中加入合成。在反應(yīng)混合物中加入m7GpppGm7GpppG，能形成能形成55的帽子結(jié)構(gòu)，進(jìn)行有效的蛋白的帽子結(jié)構(gòu)，進(jìn)行有效的蛋白質(zhì)合成。質(zhì)合成。 （3）穿梭質(zhì)粒載體（ shuttle plasmid vector ） 是指一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇記號(hào)，因而可在兩種不同的寄主細(xì)胞存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。早期發(fā)現(xiàn)的大腸桿菌早期發(fā)

44、現(xiàn)的大腸桿菌- -枯草桿菌穿梭枯草桿菌穿梭質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體大腸桿菌大腸桿菌- -釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體大腸桿菌大腸桿菌- -牛乳頭瘤病毒牛乳頭瘤病毒迄今還沒有發(fā)展出適用的大腸桿菌迄今還沒有發(fā)展出適用的大腸桿菌- -植物細(xì)胞穿梭載體。植物細(xì)胞穿梭載體。五、質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性問題1、質(zhì)粒載體不穩(wěn)定性的類型 結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性：主要指由轉(zhuǎn)位和重組作用所引起的質(zhì)粒DNA的重排與缺失。 分離的不穩(wěn)定性：在細(xì)胞分裂過程中，有一個(gè)子細(xì)胞沒有獲得質(zhì)粒DNA拷貝，并最終增值成為無質(zhì)粒的優(yōu)勢(shì)群體。結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性 DNADNA的缺失、插入和重排是造成質(zhì)的缺失、插入和重排是造成質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)不

45、穩(wěn)定性的原因。粒載體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性的原因。 1 1、質(zhì)粒的自發(fā)缺失：同向重復(fù)短序列之、質(zhì)粒的自發(fā)缺失：同向重復(fù)短序列之間的同源重組。間的同源重組。 2 2、寄主染色體及質(zhì)粒載體上的、寄主染色體及質(zhì)粒載體上的IS IS因子或因子或轉(zhuǎn)位因子也會(huì)引起結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性。轉(zhuǎn)位因子也會(huì)引起結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性。分離的不穩(wěn)定性分離的不穩(wěn)定性 細(xì)胞分裂過程中發(fā)生的質(zhì)粒細(xì)胞分裂過程中發(fā)生的質(zhì)粒不平均不平均的分配的分配，也是導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定性的重要，也是導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定性的重要原因，將這種起因于質(zhì)粒的缺陷性分配原因，將這種起因于質(zhì)粒的缺陷性分配所造成的質(zhì)粒的丟失現(xiàn)象，叫作質(zhì)粒分所造成的質(zhì)粒的丟失現(xiàn)象，叫作質(zhì)粒分離的不穩(wěn)定性。離

46、的不穩(wěn)定性。 要使質(zhì)粒能夠穩(wěn)定的遺傳，必須保證要使質(zhì)粒能夠穩(wěn)定的遺傳，必須保證平均每個(gè)世代質(zhì)粒最少?gòu)?fù)制一次；并且，平均每個(gè)世代質(zhì)粒最少?gòu)?fù)制一次；并且，細(xì)胞分裂過程中，質(zhì)粒復(fù)制的拷貝必須分細(xì)胞分裂過程中，質(zhì)粒復(fù)制的拷貝必須分配配 到兩個(gè)子細(xì)胞中去。到兩個(gè)子細(xì)胞中去。主動(dòng)分配：主動(dòng)分配：a. a.平均分配機(jī)理：使每個(gè)子細(xì)胞剛好獲得一平均分配機(jī)理：使每個(gè)子細(xì)胞剛好獲得一半數(shù)目的質(zhì)?？截惏霐?shù)目的質(zhì)?？截恇.b.配對(duì)位點(diǎn)分配機(jī)理：只有一半數(shù)目的質(zhì)粒配對(duì)位點(diǎn)分配機(jī)理：只有一半數(shù)目的質(zhì)粒呈主動(dòng)分配，其余是隨機(jī)分配的。呈主動(dòng)分配，其余是隨機(jī)分配的。隨機(jī)分配：細(xì)胞分裂過程中質(zhì)?？截悢?shù)在兩隨機(jī)分配：細(xì)胞分裂過程中

47、質(zhì)?？截悢?shù)在兩個(gè)子細(xì)胞之間是隨機(jī)分配的。個(gè)子細(xì)胞之間是隨機(jī)分配的。影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素：影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素： 1 1、新陳代謝負(fù)荷對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng)。、新陳代謝負(fù)荷對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng)。 質(zhì)粒載體會(huì)加重寄主細(xì)胞的代謝負(fù)荷；質(zhì)粒載體會(huì)加重寄主細(xì)胞的代謝負(fù)荷； 外源克隆基因的產(chǎn)物對(duì)寄主細(xì)胞的毒害作用。外源克隆基因的產(chǎn)物對(duì)寄主細(xì)胞的毒害作用。 2 2、拷貝數(shù)差度對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的影響。、拷貝數(shù)差度對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的影響。 差度：不同細(xì)胞個(gè)體之間的質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)的差差度：不同細(xì)胞個(gè)體之間的質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)的差 異程度，可影響質(zhì)粒載體丟失的速率。異程度，可影響質(zhì)粒載體丟失的速率

48、。 差度越大穩(wěn)定性越差；差度越小穩(wěn)定性越高。差度越大穩(wěn)定性越差；差度越小穩(wěn)定性越高。3 3、寄主重組體系對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng)、寄主重組體系對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng) 在野生型的大腸桿菌細(xì)胞中，質(zhì)粒重組的在野生型的大腸桿菌細(xì)胞中，質(zhì)粒重組的重要結(jié)果是形成質(zhì)粒寡聚體，它也是造成質(zhì)粒重要結(jié)果是形成質(zhì)粒寡聚體，它也是造成質(zhì)粒載體不穩(wěn)定的原因之一。載體不穩(wěn)定的原因之一。 質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA分子之間的重組頻率；分子之間的重組頻率； 含質(zhì)粒寡聚體細(xì)胞的生長(zhǎng)速率。含質(zhì)粒寡聚體細(xì)胞的生長(zhǎng)速率。 影響質(zhì)粒重組的突變也會(huì)影響質(zhì)粒的穩(wěn)定性。影響質(zhì)粒重組的突變也會(huì)影響質(zhì)粒的穩(wěn)定性。第二節(jié)第二節(jié) 噬菌體載體噬菌體載體（B

49、acteriophageBacteriophage，簡(jiǎn)稱，簡(jiǎn)稱phagephage） 一、 噬菌體的一般生物特性 可脫離寄主細(xì)胞生存，但不能進(jìn)行復(fù)制。 除了對(duì)寄主的依賴性，還具備其它的功能： 1、保護(hù)自己的核苷酸分子（DNA、RNA）免遭環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的破壞； 2、將其核苷酸分子注入到被感染的細(xì)菌細(xì)胞； 3、將被感染的細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)變成制造噬菌體的體系，從而長(zhǎng)生出大量的子代噬菌體顆粒； 4、使感染的細(xì)菌細(xì)胞釋放出子代的噬菌體顆粒1. 1. 噬菌體的結(jié)構(gòu)和其核酸類型噬菌體的結(jié)構(gòu)和其核酸類型： 結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：無尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、無尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、 具尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、具尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、

50、 線狀體型線狀體型 核酸類型：最常見的是雙鏈線性核酸類型：最常見的是雙鏈線性DNADNA、 雙鏈環(huán)形雙鏈環(huán)形DNADNA、 單鏈環(huán)形單鏈環(huán)形DNADNA、 單鏈線形單鏈線形DNADNA、 單鏈單鏈RNARNA。 不同的噬菌體之間的核酸分子量的差異也是比較大的。大分子量的噬菌體生命周期比較復(fù)雜；對(duì)寄主的依賴性較低。 有些噬菌體的DNA堿基不是由標(biāo)準(zhǔn)的A/T/C/G組成的。 Example： T4噬菌體DNA沒有C堿基，取代的是5-羥甲基胞嘧啶（HMC）;SP01噬菌體DNA中沒有T堿基，取代的是5-羥甲基尿嘧啶（HMU）。 2. 2.噬菌體的溶菌生命周期噬菌體的生命周期分為溶菌周期和溶源周期只具

51、有溶菌生長(zhǎng)周期的噬菌體顆粒叫烈性噬菌體。烈性噬菌體溶菌生長(zhǎng)的基本過程：1、吸附 吸附到位于感染細(xì)胞表面的特殊接受器上2、注入 噬菌體DNA穿過細(xì)胞壁注入寄主細(xì)胞3、轉(zhuǎn)變 被感染的細(xì)胞成為制造噬菌體顆粒的場(chǎng)所4、合成 大量合成噬菌體特有的核酸和蛋白質(zhì)5、組裝 包裝了DNA頭部和尾部組裝成噬菌體的顆粒6、釋放 合成的子代噬菌體顆粒從寄主細(xì)胞內(nèi)釋放出來 3.噬菌體的溶源生命周期溶源生長(zhǎng)周期： 是指在感染過程中沒有產(chǎn)生出子代 噬菌體顆粒，噬菌體的DNA是整 合到寄主細(xì)胞染色體DNA上，成 為它的一個(gè)組成部分。 現(xiàn)知道只有雙鏈DNA的噬菌體才具有溶源周期溫和噬菌體：既能進(jìn)入溶菌生命周期又能進(jìn)入溶 源生命

52、周期。溶源性細(xì)菌：具有一種完整的噬菌體基因組的細(xì)菌溶源化： 用溫和噬菌體感染細(xì)菌培養(yǎng)物使之形成溶 源性細(xì)菌的過程整合： 噬菌體的DNA是被包容在寄主細(xì)胞染色體 DNA中原噬菌體：在溶源細(xì)菌內(nèi)存在的整合的或非整合的 噬菌體超感染免疫性：溶源性細(xì)菌不能夠被頭一次感染并 使之溶源化的同種噬菌體再感染。溶源周期的主要特征： 噬菌體和P1噬菌體噬菌體的特征： 1、噬菌體的DNA分子注入細(xì)菌細(xì)胞 2、經(jīng)過短暫的轉(zhuǎn)錄之后，需要合成一種整合酶，于是轉(zhuǎn)錄活性便被一種阻遏物所關(guān)閉 3、噬菌體的DNA分子插入到細(xì)菌染色體基因組DNA上，變成原噬菌體 4、細(xì)菌繼續(xù)生長(zhǎng)、增值，噬菌體的基因作為細(xì)菌染色體的一部分進(jìn)行復(fù)制

53、。 噬菌體P1基本特征： 不存在噬菌體DNA分子的整合作用體系，而是變成了一種進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制的環(huán)形的質(zhì)粒DNA分子。溶源噬菌體的誘發(fā)： 依賴于阻遏基因與操縱基因的相互作用。阻遏物被一種蛋白酶切割，失活，使噬菌體轉(zhuǎn)錄。 需要?jiǎng)h除酶將噬菌體的DNA從大腸桿菌染色體上刪除下來，使之形成環(huán)形的DNA分子，恢復(fù)溶源周期開始時(shí)的狀態(tài)。二、二、噬菌體載體噬菌體載體 phage48.5 kb in lengthLinear or circular genome (cos ends) 溶菌階段溶菌階段 ( (復(fù)制和釋放復(fù)制和釋放) ) 溶源階段溶源階段 ( (整合到寄主染色體上整合到寄主染色體上) )A W B

54、C D E F Z U V G H M L K I J b2 cI cro cII O P Q S R att int xis gam red cIII NCOS COS 頭部基因頭部基因 尾部基因尾部基因 功能不明區(qū)功能不明區(qū) 溶源化溶源化 重組重組 早期控制早期控制 阻遏阻遏 DNADNA合成合成 溶菌溶菌生長(zhǎng)非必須區(qū)段生長(zhǎng)非必須區(qū)段cI cI基因：溶源過程控制基因。基因：溶源過程控制基因。噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)DNAProtein coatcoscosNonessential regionLong (left)armshort (right)armExogenous DNA

55、(20-23 kb) phage12bp5-CGGGGCGGCGACCTCG-33-GCCCCGCCGCTGGAGC-5 Cleavage Ligation(during packaging) (after infection) GGGCGGGCGACCTCG-35-CG + GC-53-GCCCCGCCGCTGGAThe phage cos endsCircular form Linear form Viruses that can infect bacteria. 48.5 kb in lengthLinear or circular genome (cos ends) phageLyti

56、c phase (Replicate and release)Lysogenic phase (integrate into host genome)噬菌體載體的主要類型噬菌體載體的主要類型 1. 插入式載體插入式載體 一種只具有一個(gè)可供外源一種只具有一個(gè)可供外源DNADNA插入的克隆位點(diǎn)的插入的克隆位點(diǎn)的 派生載體。派生載體。 2. 2. 替換型載體（取代型載體）替換型載體（取代型載體） 具有成對(duì)的克隆位點(diǎn)，在這具有成對(duì)的克隆位點(diǎn)，在這 兩個(gè)位點(diǎn)之間的兩個(gè)位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段可以被外源插入的區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。片段所取代。 3. 3. 凱倫噬菌體載體凱倫噬菌體載體插入式載體

57、：插入式載體： 噬菌體載體相對(duì)于質(zhì)粒載體來說，克隆片段較大，所以噬菌體載體相對(duì)于質(zhì)粒載體來說，克隆片段較大，所以一般用于一般用于cDNAcDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)的構(gòu)建。文庫(kù)或基因組文庫(kù)的構(gòu)建。cI cI基因插入失活：如基因插入失活：如 gt10 gt10、NM1149NM1149等載體，在等載體，在cI cI基基因上有因上有EcoR IEcoR I及及Hind IIIHind III的酶切位點(diǎn)。外源基因插入后將的酶切位點(diǎn)。外源基因插入后將導(dǎo)致導(dǎo)致cI cI基因的失活?；虻氖Щ?。cI cI基因失活后將導(dǎo)致噬菌體不能溶原基因失活后將導(dǎo)致噬菌體不能溶原化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。相反，產(chǎn)生混濁的噬菌斑。

58、化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。相反，產(chǎn)生混濁的噬菌斑。 Lac ZLac Z基因插入失活：如基因插入失活：如charon16Acharon16A載體，在非必須區(qū)段載體，在非必須區(qū)段引入引入lac Zlac Z基因，在基因，在lac Zlac Z基因上有基因上有EcoR IEcoR I位點(diǎn)，插入失活后位點(diǎn)，插入失活后利用利用X-galX-gal法篩選（蘭白篩選）。法篩選（蘭白篩選）。 cIEcoR I LA 32.7RA10.6 gt 10 lac ZLA 19.9RA21.9EcoR I Charon 16A 替換型載體（取代型載體） 外源外源DNADNA取代噬菌體染色體中對(duì)于噬菌體取代噬菌體染色體中

59、對(duì)于噬菌體的感染和復(fù)制非必要的片段的感染和復(fù)制非必要的片段 ( 20 kb)( 20 kb) 高感染效率高感染效率 (10(109 9 轉(zhuǎn)化株轉(zhuǎn)化株/ug /ug 載體載體 DNA, DNA, 比質(zhì)比質(zhì)粒高粒高100-100-倍倍) )e.g. EMBL3, DASH替換式載體替換式載體 野生型噬菌體染色體的中段對(duì)于噬菌體的感染和復(fù)制是非必要的，外源DNA可以取代這一片段，例如Charon 4A、 EMBL 3/ 4、Charon40等載體，這些載體是用Lac 5（乳糖操縱子的大部分系列，包括完整的Lac Z）替換入噬菌體的中間區(qū)段，同時(shí)將Lac 5作為選擇標(biāo)記，使用時(shí)用EcoRI水解，去掉中

60、間的片段，再與欲克隆片段在體外進(jìn)行重組、包裝。而后，感染E.coli使之在E.coli內(nèi)繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。換型噬菌體是使用最廣泛的載體。 Lac 5 EcoR I EcoR IEcoR I BanH I Sal I Sal I BamH I EcoR I MCS MCS Charon 4AEMBL3/4Charon 40替換型載體克隆外源替換型載體克隆外源DNADNA的步驟的步驟1. 應(yīng)用適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶消化載體， 除去可取代的DNA片段； 2. 將上述所得的 DNA載體臂同外源 DNA片段的連接； 3. 對(duì)重組體的DNA分子進(jìn)行包裝和增 殖，以得到有感染性的重組噬菌體 取代