基因克隆的載體

1、 基因克隆的載體基因克隆的載體 載體（載體（vectorvector）是由在細胞中能）是由在細胞中能夠自主復制的分子構成的一種夠自主復制的分子構成的一種遺傳成分，通過實驗手段可使其它的遺傳成分，通過實驗手段可使其它的片段連接在它的上面，而進行片段連接在它的上面，而進行復制，作為基因工程的載體，必須具復制，作為基因工程的載體，必須具備以下幾個性能：備以下幾個性能： 1 1、分子較小，可攜帶比較大的片段。、分子較小，可攜帶比較大的片段。 2 2、能獨立于染色體而進行自主復制并且是高效的復制。、能獨立于染色體而進行自主復制并且是高效的復制。 3 3、要有盡可能多種限制酶的切割位點，但每一種限制、要有

2、盡可能多種限制酶的切割位點，但每一種限制酶又要最少的切割位點（多克隆位點酶又要最少的切割位點（多克隆位點 multiple cloning sites ，MCSMCS） 。 4 4、有適合的標記，易于選擇。、有適合的標記，易于選擇。 5 5、有時還要求載體要能啟動外源基因進行轉錄及表達，、有時還要求載體要能啟動外源基因進行轉錄及表達，并且盡可能是高效的表達。并且盡可能是高效的表達。 6 6、從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉移，僅限于、從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉移，僅限于在某些實驗室內特殊菌種內才可復制等等。在某些實驗室內特殊菌種內才可復制等等。 載體載體功能功能克隆載體克隆載體: :

3、 克隆一個基因或克隆一個基因或DNADNA片斷片斷表達載體表達載體: : 用于一個基因的蛋白表達用于一個基因的蛋白表達整合載體整合載體: : 把一個基因插入到染色體組中把一個基因插入到染色體組中載載 體體來源：來源： 質粒載體質粒載體 噬菌體載體噬菌體載體 柯斯質粒載體柯斯質粒載體 真核細胞克隆載體真核細胞克隆載體質粒*受體細胞結構插入片斷舉例 E.coli環(huán)狀 8*pUC18/19 , T-載體pGEM- 3z等 噬菌體E.coli線狀9 - 24kbEMBL系列， gt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀 10 kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35- 45kbpJB8,c2RB

4、, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV BAC (Bacterial Artificial Chromosome)E.coli環(huán)狀300 kbPel oBAC系列PAC (P1-derived Artificial chromosome)E.coli環(huán)狀100 - 2000 kbPCYPAC1YAC (Yeast Artificial chromosome )酵母細胞線性染色體100 - 2000 kbMAC (Mammalian Artificial Chromosome)哺乳類細胞線性染色體 1000 kb病毒載體動物細胞環(huán)狀SV40 載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動物細胞和

5、細菌環(huán)狀pSVK3質粒，PBV,Ti質粒載體的種類和特征載體的種類和特征第一節(jié)第一節(jié) 質粒（質粒（plasmidplasmid）載體）載體 質粒是一種獨立于染色體外的小分子環(huán)狀質粒是一種獨立于染色體外的小分子環(huán)狀DNADNA，一般大小約，一般大小約10106 610108 8D D，可自身復制和表，可自身復制和表達，有的質粒還帶有可做為選擇性標記的抗藥達，有的質粒還帶有可做為選擇性標記的抗藥性基因，所以質粒經(jīng)過適當改選后便可成為良性基因，所以質粒經(jīng)過適當改選后便可成為良好的載體。好的載體。 作為載體的質粒大多是由天然質粒經(jīng)人工適作為載體的質粒大多是由天然質粒經(jīng)人工適當改造而成的，目前已有多種經(jīng)

6、改造的良好的當改造而成的，目前已有多種經(jīng)改造的良好的質粒載體。質粒載體。質粒（質粒（plasmidplasmid） 是存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈是存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNADNA 分子。大小約為分子。大小約為 數(shù)千堿基對。常數(shù)千堿基對。常 有有1 31 3個抗藥個抗藥 性基因，以利于性基因，以利于 篩選。篩選。質粒載體質粒載體 克隆的質粒載體克隆的質粒載體 允許外源的允許外源的DNADNA插入，儲存。主插入，儲存。主要是要是DNADNA水平上的操作。水平上的操作。 基因表達的質粒載體基因表達的質粒載體 允許外源允許外源DNADNA的插入、儲存和表的插入、儲存和表達。達。一、一

7、、質粒的生物學特性： 1、質粒DNA的構型： SC型 共價閉合環(huán)形DNA（cccDNA） OC型 開環(huán)DNA（ocDNA） L 型 線性DNA（cDNA） 2、不同質粒的分子量大小差異相當顯著： 106108D 3、作為載體的質粒都含有三種共同的組分： 復制基因（replicator）、選擇性記號、克隆位點 LOCSC4、質粒DNA編碼著一些重要的非染色體控制的遺傳性狀。 抗性特征、代謝特征、修飾寄主生活方式的因子都等抗性特征、代謝特征、修飾寄主生活方式的因子都等5、質粒DNA的類型： 接合型和非接合型；含大腸桿菌素Col質粒和含抗菌 素抗性基因的R質粒；F因子和F因子等。按接合轉移功能分類主

8、要基因按抗性記號分類非接合型質粒自主復制基因，長生大腸桿菌素基因Col質粒自主復制基因，抗菌素抗性基因R質粒(R因子) 接合型質粒自主復制基因，轉移基因，細菌染色體區(qū)段F質粒（ F因子）自主復制基因，轉移基因，大腸桿菌素基因Col質粒自主復制基因，轉移基因，抗菌素抗性基因R質粒(R因子)自主復制基因，轉移基因，大腸桿菌素基因Ent質粒6 6、質粒、質粒DNADNA的復制類型：的復制類型： 低拷貝的質粒（低拷貝的質粒（1 13 3）：嚴緊型復制控制的質粒）：嚴緊型復制控制的質粒 （接合型）（接合型） 高拷貝的質粒（高拷貝的質粒（10601060）：松弛型復制控制的質粒）：松弛型復制控制的質粒（非

9、接合型）（非接合型） 7 7、質粒的不親合性、質粒的不親合性 在同一個大腸桿菌細胞，一般不能同時含有兩種不在同一個大腸桿菌細胞，一般不能同時含有兩種不同的。也稱為質粒的不相容性。同的。也稱為質粒的不相容性。 是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親源關系密切是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親源關系密切的不同質粒，不能夠在同一個寄主細胞系中穩(wěn)定地共的不同質粒，不能夠在同一個寄主細胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。存的現(xiàn)象。 質粒的不親合性分子基礎，主要是由于它們在復制質粒的不親合性分子基礎，主要是由于它們在復制功能之間的相互干擾造成的。功能之間的相互干擾造成的。（二二 ） 、質粒質粒DNADNA的分離與純化的分

10、離與純化 1 1、氯化銫密度梯度離心法；、氯化銫密度梯度離心法； 2 2、堿變性法；、堿變性法； 3 3、微量堿變性法。、微量堿變性法。 1.氯化銫密度梯度離心法 1、質粒DNA占總DNA的1%2%； 2、在細胞裂解及DNA分離過程中，大分子量的細菌染色體易斷裂成線性片斷，而質粒DNA分子量小，結構緊密仍保持完整的狀態(tài)； 3、染色劑溴化乙錠（EB）能摻入到DNA鏈的堿基中，導致鏈的解旋；而且形成的EB- DNA復合物中，EB含量越高，密度會越低。流程：流程： 首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸鈉首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸鈉（SDSSDS）來促進大腸桿菌的細胞裂解。）來促進大腸桿菌的細胞裂解。 將溴

11、化乙錠的氯化銫溶液加到清亮的將溴化乙錠的氯化銫溶液加到清亮的大腸桿菌裂解液中，大腸桿菌裂解液中，EBEB會嵌入到會嵌入到DNADNA鏈鏈的堿基中去。的堿基中去。 在在EBEB達到飽和時，進行氯化銫密度達到飽和時，進行氯化銫密度梯度離心。梯度離心。 2. 2.堿變性法：堿變性法： 根據(jù)共價閉合環(huán)狀質粒根據(jù)共價閉合環(huán)狀質粒DNADNA與線性染色體與線性染色體DNADNA片斷之間，在拓撲學上的差異而發(fā)展出來片斷之間，在拓撲學上的差異而發(fā)展出來的。的。 在在PHPH值值12.012.012.512.5范圍內時，線性的范圍內時，線性的DNADNA會被變性而共價閉合環(huán)狀質粒會被變性而共價閉合環(huán)狀質粒DNA

12、DNA卻卻不會被變不會被變性。性。 通過冷卻或恢復中性通過冷卻或恢復中性PHPH值使之復性，線性值使之復性，線性染色體形成網(wǎng)狀結構，而染色體形成網(wǎng)狀結構，而cccDNAcccDNA可以準確迅可以準確迅速復性，通過離心去除線性染色體，獲得含有速復性，通過離心去除線性染色體，獲得含有cccDNAcccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質粒粒DNADNA3.3.堿變性法：堿變性法：1 1、取、取1.51.5毫升含質粒的大腸桿菌過夜培養(yǎng)物，加在毫升含質粒的大腸桿菌過夜培養(yǎng)物，加在微量離心管中，離心收集細胞沉淀；微量離心管中，離心收集細胞沉淀；2 2、加入、加入1001

13、00微升冰冷的微升冰冷的液，（液，（50mM50mM葡萄糖，葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA，45mg45mg溶菌酶）靜置溶菌酶）靜置5 5分鐘；分鐘；3 3、加入、加入200200微升微冷的微升微冷的液（液（0.2NaOH0.2NaOH，1.0%SDS1.0%SDS）緩緩緩緩混勻置室溫混勻置室溫5 5分鐘。分鐘。 6565度水浴一段時間會加強染色體度水浴一段時間會加強染色體DNADNA的變性作用。的變性作用。4 4、加入、加入150150毫升冰冷的毫升冰冷的PH=4.8PH=4.8的的3M3

14、M醋酸鈉，振蕩醋酸鈉，振蕩后，冰浴后，冰浴5 5分鐘。分鐘。5 5、離心的上清液用苯酚抽提數(shù)次，用乙醇沉淀收、離心的上清液用苯酚抽提數(shù)次，用乙醇沉淀收集質粒集質粒DNADNA。4.影響質粒DNA產(chǎn)量的因素： 1 1、寄主菌株的遺傳背景、寄主菌株的遺傳背景 使用使用endAendA基因發(fā)生突變的菌株，編碼核酸內基因發(fā)生突變的菌株，編碼核酸內切酶切酶從野生型的菌株中提取質粒須采取的措施： 選擇最適的培養(yǎng)條件，以限制在細胞選擇最適的培養(yǎng)條件，以限制在細胞生長期間，體內核酸內切酶生長期間，體內核酸內切酶 的表達；的表達； 在純化質粒在純化質粒DNADNA的過程中，用加熱法的過程中，用加熱法核酸內切酶核

15、酸內切酶使失活；使失活； 采用最佳的實驗流程，減少采用最佳的實驗流程，減少核酸內切核酸內切酶酶的污染并在純化了質粒的污染并在純化了質粒DNADNA之后，迅速除之后，迅速除去污染的核酸酶。去污染的核酸酶。 2 2、質粒的、質粒的拷貝數(shù)拷貝數(shù)及分子的大小及分子的大小 插入分子量大的外源插入分子量大的外源DNADNA會引起質?？綍鹳|粒拷貝數(shù)的下降。貝數(shù)的下降。（三）、質粒載體的構建與類型（三）、質粒載體的構建與類型 1. 1. 天然質粒：天然質粒：沒有經(jīng)過以基因克隆為目標沒有經(jīng)過以基因克隆為目標 的體外修飾改造的質粒。的體外修飾改造的質粒。 在大腸桿菌中，常見的可用于基因克隆的在大腸桿菌中，常見

16、的可用于基因克隆的天然質粒有天然質粒有EolE1、RSF2124和和pSC101等，等，但存在一定的局限性。但存在一定的局限性。 第一個用于基因克隆的天然質粒第一個用于基因克隆的天然質粒pSC101，它含有一個，它含有一個EcoR酶切位點，酶切位點，一個四環(huán)素抗性選擇記號（一個四環(huán)素抗性選擇記號（Tetr ），插），插入外源片斷后不影響其復制功能，入外源片斷后不影響其復制功能，但該但該質粒分子量較大，拷貝數(shù)低只具有抗菌質粒分子量較大，拷貝數(shù)低只具有抗菌素抗性基因，無法使用插入失活技術選素抗性基因，無法使用插入失活技術選擇重組分子。擇重組分子。 ColE1 ColE1質粒在其唯一的單切割位點質粒

17、在其唯一的單切割位點EcoRlEcoRl中克隆外源中克隆外源DNADNA片斷后，可根據(jù)對片斷后，可根據(jù)對大腸桿菌素大腸桿菌素E1E1的免疫性選擇轉化子，不的免疫性選擇轉化子，不能合成大腸桿菌素能合成大腸桿菌素E1E1的菌落是具有重組的菌落是具有重組質粒的轉化子。質粒的轉化子。但對大腸桿菌素但對大腸桿菌素E1E1的免的免疫篩選，在化學上是相當麻煩的。疫篩選，在化學上是相當麻煩的。2. 2.質粒載體必須具備的基本條件質粒載體必須具備的基本條件 (1) 、具有復制起點；、具有復制起點； 自我增值的基本條件，一般具自我增值的基本條件，一般具一個一個復制子。復制子。 (2) 、具有抗菌素抗性；、具有抗菌

18、素抗性； 理想的質粒載體具有理想的質粒載體具有兩種兩種抗菌素抗性基因?？咕乜剐曰?。 (3) 、具有若干限制酶切、具有若干限制酶切單一單一位點（位點（CMS）；）； (4) 、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。 低分子量的質粒易于操作，克隆外源片斷低分子量的質粒易于操作，克隆外源片斷 后仍能有效的轉化給受體細胞同時低分子量后仍能有效的轉化給受體細胞同時低分子量的質粒對限制酶具有多重識別位點的幾率也較低；的質粒對限制酶具有多重識別位點的幾率也較低；較高的拷貝數(shù)可獲得大量的克隆基因較高的拷貝數(shù)可獲得大量的克隆基因以Ampr和Tetr為選擇性標記，克隆位點在這兩個選

19、擇性標記的單酶切位點上。選擇AmprTets或AmpsTetr的重組子。（4363bp） 3.質粒載體的選擇記號質粒載體的選擇記號 新陳代謝特性；新陳代謝特性； 對大腸桿菌素對大腸桿菌素E1的免疫性；的免疫性； 抗菌素抗性；抗菌素抗性； 四環(huán)素抗性、氨芐青霉素抗性、四環(huán)素抗性、氨芐青霉素抗性、 鏈霉素抗性、卡那霉素抗性鏈霉素抗性、卡那霉素抗性 大多數(shù)質粒本身帶有抗菌素基因；大多數(shù)質粒本身帶有抗菌素基因； 抗菌素抗性記號便于操作、易于選擇?？咕乜剐杂浱柋阌诓僮鳌⒁子谶x擇。4. 4.不同類型的質粒載體不同類型的質粒載體高拷貝的質粒載體高拷貝的質粒載體克隆的目的是為分離大量的高純度的克隆基因克隆的

20、目的是為分離大量的高純度的克隆基因低拷貝的質粒載體低拷貝的質粒載體 有些克隆的編碼基因，其產(chǎn)物含量過高會有些克隆的編碼基因，其產(chǎn)物含量過高會嚴重的干擾寄主細胞的正常新陳代謝活動。嚴重的干擾寄主細胞的正常新陳代謝活動。 編碼表面結構蛋白質的一些基因、調節(jié)細胞基編碼表面結構蛋白質的一些基因、調節(jié)細胞基礎代謝活動的蛋白質編碼基因以及囊纖維化跨礎代謝活動的蛋白質編碼基因以及囊纖維化跨膜傳導調節(jié)蛋白質編碼基因等。膜傳導調節(jié)蛋白質編碼基因等。 (1)(1)失控的質粒載體失控的質粒載體 復制控制是溫度敏感型的低拷貝的質粒。復制控制是溫度敏感型的低拷貝的質粒。ExampleExample： pBEU1pBEU

21、1和和pBEU2pBEU2質粒，在質粒，在3030度下，每個寄度下，每個寄主細胞只含有適量的拷貝數(shù)，當培養(yǎng)溫度超過主細胞只含有適量的拷貝數(shù)，當培養(yǎng)溫度超過3535度時，質粒的復制將失去控制，每個細胞中度時，質粒的復制將失去控制，每個細胞中的拷貝數(shù)便持續(xù)上升。在這種高溫環(huán)境下，細的拷貝數(shù)便持續(xù)上升。在這種高溫環(huán)境下，細胞的生長和蛋白質的合成可按正常的速率持續(xù)胞的生長和蛋白質的合成可按正常的速率持續(xù)2323小時。最后得到超量的基因編碼產(chǎn)物，細小時。最后得到超量的基因編碼產(chǎn)物，細胞生長受抑制失去存活能力，積累的質粒胞生長受抑制失去存活能力，積累的質粒DNADNA占細胞總占細胞總DNADNA的的50%

22、50%。 (2)(2)插入失活型質粒載體插入失活型質粒載體 將外源將外源DNA片斷插入在質粒上會導片斷插入在質粒上會導致選擇記號基因失活的位點，就有可能致選擇記號基因失活的位點，就有可能通過抗菌素抗性的篩選，大幅度的提高通過抗菌素抗性的篩選，大幅度的提高獲得陽性克隆的機會。獲得陽性克隆的機會。ExampleExample： 在在pBR329質粒載體的質粒載體的EcoR1位點插入外位點插入外源片斷，會使氯霉素抗性基因失活，在源片斷，會使氯霉素抗性基因失活，在篩選的氯霉素敏感的轉化子細胞群體中，篩選的氯霉素敏感的轉化子細胞群體中，含有插入片斷的重組體質粒的幾率會顯含有插入片斷的重組體質粒的幾率會顯

23、著上升。著上升。 (3)(3)正選擇的質粒載體正選擇的質粒載體正向選擇：應用只有突變體或重組體才能正向選擇：應用只有突變體或重組體才能 正常生長的培養(yǎng)條件進行選擇。正常生長的培養(yǎng)條件進行選擇。 這種質粒載體具有直接選擇記號這種質粒載體具有直接選擇記號 并可并可 賦予寄主細胞相應的表型。賦予寄主細胞相應的表型。ExampleExample： 質粒質粒pKN80pKN80有來自有來自MuMu噬菌體噬菌體DNADNA的的EcoR1-CEcoR1-C的片斷，編碼一種致的片斷，編碼一種致死功能的死功能的kilkil基因?；?。該質粒在該質粒在MuMu噬菌體的溶噬菌體的溶源菌株中正常復制；源菌株中正常復制

24、；在非溶源菌株中是致在非溶源菌株中是致死的。死的。在在HindHind 或或Hpa Hpa 位點位點插入外源插入外源DNADNA片斷后，片斷后，會產(chǎn)生具會產(chǎn)生具AmpAmpr表型的表型的MuMu噬菌體的非溶源的噬菌體的非溶源的轉化子菌株。轉化子菌株。正向選擇質粒載體的條件限制：正向選擇質粒載體的條件限制： 1、需要特殊的寄主菌株或選擇培養(yǎng)基、需要特殊的寄主菌株或選擇培養(yǎng)基 2、可使用的克隆位點少、可使用的克隆位點少 3、 假陽性水平高假陽性水平高 4、 不能夠調節(jié)插入序列表達活性不能夠調節(jié)插入序列表達活性 (4)表達型的質粒載體表達型的質粒載體表達載體：表達載體： 按特殊設計構建的，按特殊設計

25、構建的，能使克隆在其中特定位點的外源能使克隆在其中特定位點的外源真核基因的編碼序列，在大腸桿真核基因的編碼序列，在大腸桿菌細胞中正常轉錄并轉譯成相應菌細胞中正常轉錄并轉譯成相應蛋白質的克隆載體。蛋白質的克隆載體。 主要包括：大腸桿菌的啟動子、及操主要包括：大腸桿菌的啟動子、及操縱位點序列、多克隆位點、轉錄及轉縱位點序列、多克隆位點、轉錄及轉譯信號、質粒載體的復制起點及抗菌譯信號、質粒載體的復制起點及抗菌素抗性基因。素抗性基因。 待表達的真核基因編碼序列被克隆待表達的真核基因編碼序列被克隆在緊挨于啟動子下游的多克隆位點上，在緊挨于啟動子下游的多克隆位點上，而且必須是其編碼的蛋白質氨基酸末而且必須

26、是其編碼的蛋白質氨基酸末端這一頭靠近啟動子方向插入，才能端這一頭靠近啟動子方向插入，才能在啟動子控制下進行有效的轉錄。在啟動子控制下進行有效的轉錄。 四、重要的大腸桿菌質粒載體四、重要的大腸桿菌質粒載體 1 1、pSC101pSC101質粒載體；質粒載體； 2 2、ColE ColE 質粒載體；質粒載體； 3 3、pBR322pBR322質粒載體；質粒載體； 4 4、pUCpUC質粒載體；質粒載體； 5. 5. 其它的重要的質粒載體其它的重要的質粒載體1. 1.pSC101pSC101質粒載體質粒載體 一種嚴謹型復制控制的地拷貝數(shù)的大腸一種嚴謹型復制控制的地拷貝數(shù)的大腸桿菌質粒載體。平均每個寄

27、主細胞僅有桿菌質粒載體。平均每個寄主細胞僅有1212個拷貝；分子量個拷貝；分子量9.09kb9.09kb，編碼有一個，編碼有一個四環(huán)素抗性基因（四環(huán)素抗性基因（tettetr r ）。有）。有HindHind 、EcoREcoR、BamH BamH 、Sal Sal 、Xho Xho 、PvuPvu、 Sma Sma 7 7種核酸內切限制酶。其種核酸內切限制酶。其中在中在HindHind 、 BamH BamH 、 Sma Sma 3 3個位點個位點克隆外源克隆外源DNADNA，都會導致，都會導致tettetr r 基因失活?；蚴Щ?。 是第一個真核生物的克隆載體。是第一個真核生物的克隆載體。

28、（1）應用pSC101質粒作基因克隆載體 葡萄球菌質?；蛟诖竽c桿菌中的表達 金黃色葡萄球菌的質粒p1258,編碼若干種能 在大腸桿菌檢測的結構基因；能被核酸限制酶 EcoR 切割成4段。（2）應用pSC101質粒作基因克隆載體 在大腸桿菌中克隆非洲爪蟾DNA 用核酸內切酶EcoR 消化非洲爪蟾的核糖體DNA（ rDNA ），與EcoR 消化的pSC101質粒進行重組。 在挑取的55個轉化子中，經(jīng) EcoR 酶切，電泳后13個轉化子含有外源片斷。轉化率23.62. 2.ColE ColE 1 1質粒載體質粒載體 松弛型復制控制的多拷貝的質粒，能產(chǎn)生細菌素。細菌素對大腸桿菌的正常生命活動有抑制作

29、用（復制、轉錄、轉譯能量代謝等）。但含有對細菌素的免疫基因。 用 ColE 1質粒特征為基礎建立的轉化細胞系，存在一定的缺陷性： 1、應用大腸桿菌素免疫作為標記操作上不方便； 2、在細菌群體中，能夠以相當高的頻率自發(fā)的產(chǎn)生出抗菌素的突變體細胞。3.pBR322質粒載體 “P”表示是一種質粒； “BR”表示兩位主要構建者姓氏的頭一個字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”;“322”表示實驗編號。 四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素 抗性基因O r i Pst Sal Pvu Ava Bam HHind Eco RpBR322(amp(ampr r) )(ter(terr r) )pBR32

30、2pBR322的構建：的構建： 為改進轉化子篩選技術，并具有相對為改進轉化子篩選技術，并具有相對小的分子量、高拷貝數(shù)、外源基因插入小的分子量、高拷貝數(shù)、外源基因插入不影響質粒的復制功能、多克隆位點不影響質粒的復制功能、多克隆位點（多種限制酶的單一切割位點）、質粒（多種限制酶的單一切割位點）、質粒的穩(wěn)定性（克服質粒的結合轉移能力）的穩(wěn)定性（克服質粒的結合轉移能力） pBR322pBR322的結構來源的結構來源pBR322pBR322質粒載體的優(yōu)點：質粒載體的優(yōu)點： 1 1、具有較小的分子量；、具有較小的分子量； 它的分子量為它的分子量為4363bp4363bp。克隆載體的分子量大小。克隆載體的分

31、子量大小不要超過不要超過10kb10kb。 2 2、具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉化子的具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉化子的選擇記號。選擇記號。 pBR322 DNApBR322 DNA分子中總共有分子中總共有2424種核酸內切酶只具有種核酸內切酶只具有單一的酶切識別位點。其中單一的酶切識別位點。其中7 7種內切酶的識別位點種內切酶的識別位點在四環(huán)素抗性基因內部，在四環(huán)素抗性基因內部，2 2種識別位點在于這個基種識別位點在于這個基因的啟動區(qū)內，所以因的啟動區(qū)內，所以9 9個限制酶切位點插入外源片個限制酶切位點插入外源片斷可以導致斷可以導致tettetr r 基因的失活；另外有基因的失活；另外有

32、3 3種限制酶在種限制酶在氨芐青霉素抗性基因有單一的識別位點，氨芐青霉素抗性基因有單一的識別位點，Example:a. 在pBR322質粒的BamH或Sal位點插入外源DNA片斷，切斷了tettetr r基因編碼序列的連續(xù)性，使之失去活性，產(chǎn)生出Ampr rTets s表型的重組pBR322質粒，轉化入Amps sTets s的大腸桿菌細胞。先涂布在含氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上，篩選出具Ampr r菌落，再將它們涂布于含四環(huán)素的選擇性培養(yǎng)基上。插入外源片斷的重組質粒不能在這種培養(yǎng)基上生長。B X BBBXAmproriAmpsTetroriAmprTetroripBR322BABBTetsX b

33、.在Pst或Sca識別位點插入外源片斷會導致Ampr r基因的失活，產(chǎn)生Amps sTetr r表型的質粒。轉化大腸桿菌之后，獲得的重組子可以比較快的檢測出來。其依據(jù)是Ampr r表型的細胞可以合成 內酰胺酶，它能使青霉素轉變成青霉酮酸，而這種青霉酮酸能與碘結合。在含有可溶性淀粉和四環(huán)素的富裕培養(yǎng)基上選擇轉化子，經(jīng)37度培養(yǎng)過夜后，在此平板上加入少量的碘指示劑溶液產(chǎn)生青霉素 內酰胺酶Ampr r的菌落，其周圍的碘指示劑溶液變得明亮，而Amps s菌落無此反應。 3、具有較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素擴增之后每個細胞中可積累10003000個拷貝。 pBR322pBR322質粒載體的改良質粒載體的

34、改良 為了更加實用，人們對為了更加實用，人們對pBR322pBR322質粒進質粒進行了改良，得到許多行了改良，得到許多pBR322pBR322質粒衍生質質粒衍生質粒，它們各自具有不同的特點。粒，它們各自具有不同的特點。應用應用pBR322pBR322質粒作為基因克隆載體質粒作為基因克隆載體 水稻葉綠體光誘導基因水稻葉綠體光誘導基因psbApsbA的結構分析的結構分析 基因基因psbApsbA編碼的蛋白質，與光合作用系編碼的蛋白質，與光合作用系統(tǒng)統(tǒng)相關，并且它能與除草劑阿特拉津結合，相關，并且它能與除草劑阿特拉津結合，它的第它的第264264位氨基酸發(fā)生取代反應，由絲氨酸位氨基酸發(fā)生取代反應，由

35、絲氨酸變?yōu)楦拾彼幔蓪е缕涫ヅc變?yōu)楦拾彼?，可導致其失去與除草劑阿特拉津除草劑阿特拉津結合的能力結合的能力，推測是三維結構發(fā)生了改變，推測是三維結構發(fā)生了改變 ；在；在原生生物衣藻、藍色細菌中，此蛋白質在同一原生生物衣藻、藍色細菌中，此蛋白質在同一位置由絲氨酸變?yōu)楸彼岬娜〈磻?，會使他位置由絲氨酸變?yōu)楸彼岬娜〈磻?，會使他們獲得對除草劑的抗性功能。們獲得對除草劑的抗性功能。 而且，非競爭條件下，對除草劑阿特拉而且，非競爭條件下，對除草劑阿特拉津抗性的千里光屬和莧屬，干物質產(chǎn)量比敏感津抗性的千里光屬和莧屬，干物質產(chǎn)量比敏感植物下降了植物下降了25%25%和和40%40%。 通過對基因通過對基

36、因psbApsbA的體外操作，有可能創(chuàng)造的體外操作，有可能創(chuàng)造出抗除草劑的或高光效的轉基因植株。用出抗除草劑的或高光效的轉基因植株。用pBR322pBR322質粒作為載體，成功的克隆了水稻的質粒作為載體，成功的克隆了水稻的psbApsbA基因?；?。 首先將水稻葉綠體首先將水稻葉綠體DNADNA，用，用EcoREcoR內切酶消內切酶消化，經(jīng)含有溴化乙錠的熔點瓊脂糖電泳，回收化，經(jīng)含有溴化乙錠的熔點瓊脂糖電泳，回收分子大小為分子大小為1.81.82.5kb2.5kb之間的之間的DNADNA片斷。片斷。 再與經(jīng)過再與經(jīng)過EcoREcoR內切酶切割并用堿性磷酸酶內切酶切割并用堿性磷酸酶作了脫磷酸處理

37、的作了脫磷酸處理的pBR322pBR322質粒質粒DNADNA連接。連接。 然后轉化給大腸桿菌，在氨芐青霉素的選擇然后轉化給大腸桿菌，在氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上，形成培養(yǎng)基上，形成AmpAmpr r轉化子菌落群體。轉化子菌落群體。 用經(jīng)用經(jīng)32p32p標記的玉米標記的玉米psdADNApsdADNA探針作菌落雜探針作菌落雜交，從交，從10001000多個菌落中篩選出多個菌落中篩選出8 8個陽性克隆。個陽性克隆。 對這8個陽性克隆進行進一步的Southern分析，表明6個片斷帶有長度為2.2kb的編碼水稻葉綠體psdA基因。實際上其中1.2kb的片斷編碼著水稻psdA基因的全部序列。通過dna序

38、列分析表明與高等植物的同原性在92%，與藍色細菌同源性75%4. 4. pUCpUC質粒載體質粒載體 人們應用多克隆位點技術，人們應用多克隆位點技術，在在pBR322pBR322的基礎上，組入了一的基礎上，組入了一個在其個在其5-5-端帶有一段多克隆位端帶有一段多克隆位點的點的lacZlacZ基因，而發(fā)展的具有基因，而發(fā)展的具有雙功能檢測特性的新型質粒載體雙功能檢測特性的新型質粒載體系列。系列。 一種典型的一種典型的pUCpUC系列的質粒載體，包括以下系列的質粒載體，包括以下四個部分：四個部分： 1 1、來自、來自pBR322pBR322質粒的復制起點（質粒的復制起點（oriori）；）； 2

39、 2、氨芐青霉素抗性基因（、氨芐青霉素抗性基因（ampampr r ）, ,但它的但它的DNADNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不在含有原核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不在含有原來的核酸內切限制酶的但識別位點。來的核酸內切限制酶的但識別位點。 3 3、大腸桿菌、大腸桿菌-半乳糖基因（半乳糖基因（lacZlacZ）的啟動子）的啟動子及編碼及編碼-肽鏈的肽鏈的DNADNA序列，此結構稱之為序列，此結構稱之為lacZlacZ基因；基因； 4 4、位于、位于lacZlacZ基因中的靠近基因中的靠近5-5-端的一段多端的一段多克隆位點（克隆位點（MCSMCS）區(qū)段。但它并不破壞該基因）區(qū)段。但它并不破壞該基因

40、的功能。的功能。AmproripUC18(3 kb)MCS (Multiple cloning sites,多科隆位點）Lac promoterlacZpUCpUC質粒載體的形體圖質粒載體的形體圖pUC質粒載體的優(yōu)點第一， 具有較小的分子量和更高的拷貝數(shù); 僅保留了pBR322的氨芐青霉素抗性基因和復制起點；在操作過程中復制起點內部發(fā)生了自發(fā)突變造成了基因rop的缺失，它是控制質粒的特殊因子，從而使拷貝數(shù)增加，平均每個細胞500700個拷貝。第二，適用于組織化學檢測重組體； 具有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ基因，所編碼的-肽鏈可參與- 互補作用，用Xgal顯色對重組子進行鑒定，而pBR3

41、22質粒的重組子要進行兩步的選擇。 第三，具有多克隆位點MCS區(qū)段 方便具有不同粘性末端的外源片斷的插入。5. 5.其它的重要的質粒載體其它的重要的質粒載體喪失遷移功能的質粒載體能在體外轉錄克隆基因的質粒載體穿梭質粒載體（1 1）喪失遷移功能的質粒載體）喪失遷移功能的質粒載體第一：擁有較高水平的拷貝數(shù)第一：擁有較高水平的拷貝數(shù), ,平平均每個大腸桿菌寄主細胞可達均每個大腸桿菌寄主細胞可達30453045份份; ; 第二第二: :失去了失去了bombom位點，即便在共位點，即便在共存的存的F F質粒提供轉移裝置的條件下，質粒提供轉移裝置的條件下，也不可能發(fā)生遷移作用。也不可能發(fā)生遷移作用。（2）

42、能在體外轉錄克隆基因的質粒載體 pGEM-3Z是一種與pUC系列十分類似的小分子的質粒載體，總長度2743bp，編碼有一個氨芐青霉素抗性基因和一個lacZ基因。 pGEM-3Z與pUC質粒之間的主要區(qū)別是，它具有兩個來自噬菌體的啟動子，即T7啟動子和SP6啟動子，它們?yōu)镽NA聚合酶的附著作用提供了特異的識別位點。pGEM-11 現(xiàn)在以發(fā)展出了一大批在多克隆位現(xiàn)在以發(fā)展出了一大批在多克隆位點區(qū)附近參入噬菌體點區(qū)附近參入噬菌體RNARNA聚合酶啟動子聚合酶啟動子的簡單的質粒載體，它們都是由的簡單的質粒載體，它們都是由pUCpUC系系列載體派生而來的。列載體派生而來的。 噬菌體的噬菌體的RNARNA

43、聚合酶，所合成的聚合酶，所合成的RNARNA轉錄本除了可作為雜交探針之外，轉錄本除了可作為雜交探針之外，在兔網(wǎng)織紅細胞裂解物轉譯體系或在麥在兔網(wǎng)織紅細胞裂解物轉譯體系或在麥胚無細胞轉移體系中進行體外蛋白質的胚無細胞轉移體系中進行體外蛋白質的合成。在反應混合物中加入合成。在反應混合物中加入m7GpppGm7GpppG，能形成能形成55的帽子結構，進行有效的蛋白的帽子結構，進行有效的蛋白質合成。質合成。 （3）穿梭質粒載體（ shuttle plasmid vector ） 是指一類由人工構建的具有兩種不同復制起點和選擇記號，因而可在兩種不同的寄主細胞存活和復制的質粒載體。早期發(fā)現(xiàn)的大腸桿菌早期發(fā)

44、現(xiàn)的大腸桿菌- -枯草桿菌穿梭枯草桿菌穿梭質粒載體質粒載體大腸桿菌大腸桿菌- -釀酒酵母穿梭質粒載體釀酒酵母穿梭質粒載體大腸桿菌大腸桿菌- -牛乳頭瘤病毒牛乳頭瘤病毒迄今還沒有發(fā)展出適用的大腸桿菌迄今還沒有發(fā)展出適用的大腸桿菌- -植物細胞穿梭載體。植物細胞穿梭載體。五、質粒載體的穩(wěn)定性問題1、質粒載體不穩(wěn)定性的類型 結構的不穩(wěn)定性：主要指由轉位和重組作用所引起的質粒DNA的重排與缺失。 分離的不穩(wěn)定性：在細胞分裂過程中，有一個子細胞沒有獲得質粒DNA拷貝，并最終增值成為無質粒的優(yōu)勢群體。結構的不穩(wěn)定性結構的不穩(wěn)定性 DNADNA的缺失、插入和重排是造成質的缺失、插入和重排是造成質粒載體結構不

45、穩(wěn)定性的原因。粒載體結構不穩(wěn)定性的原因。 1 1、質粒的自發(fā)缺失：同向重復短序列之、質粒的自發(fā)缺失：同向重復短序列之間的同源重組。間的同源重組。 2 2、寄主染色體及質粒載體上的、寄主染色體及質粒載體上的IS IS因子或因子或轉位因子也會引起結構的不穩(wěn)定性。轉位因子也會引起結構的不穩(wěn)定性。分離的不穩(wěn)定性分離的不穩(wěn)定性 細胞分裂過程中發(fā)生的質粒細胞分裂過程中發(fā)生的質粒不平均不平均的分配的分配，也是導致質粒不穩(wěn)定性的重要，也是導致質粒不穩(wěn)定性的重要原因，將這種起因于質粒的缺陷性分配原因，將這種起因于質粒的缺陷性分配所造成的質粒的丟失現(xiàn)象，叫作質粒分所造成的質粒的丟失現(xiàn)象，叫作質粒分離的不穩(wěn)定性。離

46、的不穩(wěn)定性。 要使質粒能夠穩(wěn)定的遺傳，必須保證要使質粒能夠穩(wěn)定的遺傳，必須保證平均每個世代質粒最少復制一次；并且，平均每個世代質粒最少復制一次；并且，細胞分裂過程中，質粒復制的拷貝必須分細胞分裂過程中，質粒復制的拷貝必須分配配 到兩個子細胞中去。到兩個子細胞中去。主動分配：主動分配：a. a.平均分配機理：使每個子細胞剛好獲得一平均分配機理：使每個子細胞剛好獲得一半數(shù)目的質粒拷貝半數(shù)目的質?？截恇.b.配對位點分配機理：只有一半數(shù)目的質粒配對位點分配機理：只有一半數(shù)目的質粒呈主動分配，其余是隨機分配的。呈主動分配，其余是隨機分配的。隨機分配：細胞分裂過程中質?？截悢?shù)在兩隨機分配：細胞分裂過程中

47、質?？截悢?shù)在兩個子細胞之間是隨機分配的。個子細胞之間是隨機分配的。影響質粒載體穩(wěn)定性的主要因素：影響質粒載體穩(wěn)定性的主要因素： 1 1、新陳代謝負荷對質粒載體穩(wěn)定性的效應。、新陳代謝負荷對質粒載體穩(wěn)定性的效應。 質粒載體會加重寄主細胞的代謝負荷；質粒載體會加重寄主細胞的代謝負荷； 外源克隆基因的產(chǎn)物對寄主細胞的毒害作用。外源克隆基因的產(chǎn)物對寄主細胞的毒害作用。 2 2、拷貝數(shù)差度對質粒載體穩(wěn)定性的影響。、拷貝數(shù)差度對質粒載體穩(wěn)定性的影響。 差度：不同細胞個體之間的質粒載體的拷貝數(shù)的差差度：不同細胞個體之間的質粒載體的拷貝數(shù)的差 異程度，可影響質粒載體丟失的速率。異程度，可影響質粒載體丟失的速率

48、。 差度越大穩(wěn)定性越差；差度越小穩(wěn)定性越高。差度越大穩(wěn)定性越差；差度越小穩(wěn)定性越高。3 3、寄主重組體系對質粒載體穩(wěn)定性的效應、寄主重組體系對質粒載體穩(wěn)定性的效應 在野生型的大腸桿菌細胞中，質粒重組的在野生型的大腸桿菌細胞中，質粒重組的重要結果是形成質粒寡聚體，它也是造成質粒重要結果是形成質粒寡聚體，它也是造成質粒載體不穩(wěn)定的原因之一。載體不穩(wěn)定的原因之一。 質粒質粒DNADNA分子之間的重組頻率；分子之間的重組頻率； 含質粒寡聚體細胞的生長速率。含質粒寡聚體細胞的生長速率。 影響質粒重組的突變也會影響質粒的穩(wěn)定性。影響質粒重組的突變也會影響質粒的穩(wěn)定性。第二節(jié)第二節(jié) 噬菌體載體噬菌體載體（B

49、acteriophageBacteriophage，簡稱，簡稱phagephage） 一、 噬菌體的一般生物特性 可脫離寄主細胞生存，但不能進行復制。 除了對寄主的依賴性，還具備其它的功能： 1、保護自己的核苷酸分子（DNA、RNA）免遭環(huán)境化學物質的破壞； 2、將其核苷酸分子注入到被感染的細菌細胞； 3、將被感染的細菌細胞轉變成制造噬菌體的體系，從而長生出大量的子代噬菌體顆粒； 4、使感染的細菌細胞釋放出子代的噬菌體顆粒1. 1. 噬菌體的結構和其核酸類型噬菌體的結構和其核酸類型： 結構：結構：無尾部結構的二十面體型、無尾部結構的二十面體型、 具尾部結構的二十面體型、具尾部結構的二十面體型、

50、 線狀體型線狀體型 核酸類型：最常見的是雙鏈線性核酸類型：最常見的是雙鏈線性DNADNA、 雙鏈環(huán)形雙鏈環(huán)形DNADNA、 單鏈環(huán)形單鏈環(huán)形DNADNA、 單鏈線形單鏈線形DNADNA、 單鏈單鏈RNARNA。 不同的噬菌體之間的核酸分子量的差異也是比較大的。大分子量的噬菌體生命周期比較復雜；對寄主的依賴性較低。 有些噬菌體的DNA堿基不是由標準的A/T/C/G組成的。 Example： T4噬菌體DNA沒有C堿基，取代的是5-羥甲基胞嘧啶（HMC）;SP01噬菌體DNA中沒有T堿基，取代的是5-羥甲基尿嘧啶（HMU）。 2. 2.噬菌體的溶菌生命周期噬菌體的生命周期分為溶菌周期和溶源周期只具

51、有溶菌生長周期的噬菌體顆粒叫烈性噬菌體。烈性噬菌體溶菌生長的基本過程：1、吸附 吸附到位于感染細胞表面的特殊接受器上2、注入 噬菌體DNA穿過細胞壁注入寄主細胞3、轉變 被感染的細胞成為制造噬菌體顆粒的場所4、合成 大量合成噬菌體特有的核酸和蛋白質5、組裝 包裝了DNA頭部和尾部組裝成噬菌體的顆粒6、釋放 合成的子代噬菌體顆粒從寄主細胞內釋放出來 3.噬菌體的溶源生命周期溶源生長周期： 是指在感染過程中沒有產(chǎn)生出子代 噬菌體顆粒，噬菌體的DNA是整 合到寄主細胞染色體DNA上，成 為它的一個組成部分。 現(xiàn)知道只有雙鏈DNA的噬菌體才具有溶源周期溫和噬菌體：既能進入溶菌生命周期又能進入溶 源生命

52、周期。溶源性細菌：具有一種完整的噬菌體基因組的細菌溶源化： 用溫和噬菌體感染細菌培養(yǎng)物使之形成溶 源性細菌的過程整合： 噬菌體的DNA是被包容在寄主細胞染色體 DNA中原噬菌體：在溶源細菌內存在的整合的或非整合的 噬菌體超感染免疫性：溶源性細菌不能夠被頭一次感染并 使之溶源化的同種噬菌體再感染。溶源周期的主要特征： 噬菌體和P1噬菌體噬菌體的特征： 1、噬菌體的DNA分子注入細菌細胞 2、經(jīng)過短暫的轉錄之后，需要合成一種整合酶，于是轉錄活性便被一種阻遏物所關閉 3、噬菌體的DNA分子插入到細菌染色體基因組DNA上，變成原噬菌體 4、細菌繼續(xù)生長、增值，噬菌體的基因作為細菌染色體的一部分進行復制

53、。 噬菌體P1基本特征： 不存在噬菌體DNA分子的整合作用體系，而是變成了一種進行獨立復制的環(huán)形的質粒DNA分子。溶源噬菌體的誘發(fā)： 依賴于阻遏基因與操縱基因的相互作用。阻遏物被一種蛋白酶切割，失活，使噬菌體轉錄。 需要刪除酶將噬菌體的DNA從大腸桿菌染色體上刪除下來，使之形成環(huán)形的DNA分子，恢復溶源周期開始時的狀態(tài)。二、二、噬菌體載體噬菌體載體 phage48.5 kb in lengthLinear or circular genome (cos ends) 溶菌階段溶菌階段 ( (復制和釋放復制和釋放) ) 溶源階段溶源階段 ( (整合到寄主染色體上整合到寄主染色體上) )A W B

54、C D E F Z U V G H M L K I J b2 cI cro cII O P Q S R att int xis gam red cIII NCOS COS 頭部基因頭部基因 尾部基因尾部基因 功能不明區(qū)功能不明區(qū) 溶源化溶源化 重組重組 早期控制早期控制 阻遏阻遏 DNADNA合成合成 溶菌溶菌生長非必須區(qū)段生長非必須區(qū)段cI cI基因：溶源過程控制基因?；颍喝茉催^程控制基因。噬菌體的基因組結構噬菌體的基因組結構DNAProtein coatcoscosNonessential regionLong (left)armshort (right)armExogenous DNA

55、(20-23 kb) phage12bp5-CGGGGCGGCGACCTCG-33-GCCCCGCCGCTGGAGC-5 Cleavage Ligation(during packaging) (after infection) GGGCGGGCGACCTCG-35-CG + GC-53-GCCCCGCCGCTGGAThe phage cos endsCircular form Linear form Viruses that can infect bacteria. 48.5 kb in lengthLinear or circular genome (cos ends) phageLyti

56、c phase (Replicate and release)Lysogenic phase (integrate into host genome)噬菌體載體的主要類型噬菌體載體的主要類型 1. 插入式載體插入式載體 一種只具有一個可供外源一種只具有一個可供外源DNADNA插入的克隆位點的插入的克隆位點的 派生載體。派生載體。 2. 2. 替換型載體（取代型載體）替換型載體（取代型載體） 具有成對的克隆位點，在這具有成對的克隆位點，在這 兩個位點之間的兩個位點之間的DNA區(qū)段可以被外源插入的區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。片段所取代。 3. 3. 凱倫噬菌體載體凱倫噬菌體載體插入式載體

57、：插入式載體： 噬菌體載體相對于質粒載體來說，克隆片段較大，所以噬菌體載體相對于質粒載體來說，克隆片段較大，所以一般用于一般用于cDNAcDNA文庫或基因組文庫的構建。文庫或基因組文庫的構建。cI cI基因插入失活：如基因插入失活：如 gt10 gt10、NM1149NM1149等載體，在等載體，在cI cI基基因上有因上有EcoR IEcoR I及及Hind IIIHind III的酶切位點。外源基因插入后將的酶切位點。外源基因插入后將導致導致cI cI基因的失活?；虻氖Щ?。cI cI基因失活后將導致噬菌體不能溶原基因失活后將導致噬菌體不能溶原化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。相反，產(chǎn)生混濁的噬菌斑。

58、化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。相反，產(chǎn)生混濁的噬菌斑。 Lac ZLac Z基因插入失活：如基因插入失活：如charon16Acharon16A載體，在非必須區(qū)段載體，在非必須區(qū)段引入引入lac Zlac Z基因，在基因，在lac Zlac Z基因上有基因上有EcoR IEcoR I位點，插入失活后位點，插入失活后利用利用X-galX-gal法篩選（蘭白篩選）。法篩選（蘭白篩選）。 cIEcoR I LA 32.7RA10.6 gt 10 lac ZLA 19.9RA21.9EcoR I Charon 16A 替換型載體（取代型載體） 外源外源DNADNA取代噬菌體染色體中對于噬菌體取代噬菌體染色體中

59、對于噬菌體的感染和復制非必要的片段的感染和復制非必要的片段 ( 20 kb)( 20 kb) 高感染效率高感染效率 (10(109 9 轉化株轉化株/ug /ug 載體載體 DNA, DNA, 比質比質粒高粒高100-100-倍倍) )e.g. EMBL3, DASH替換式載體替換式載體 野生型噬菌體染色體的中段對于噬菌體的感染和復制是非必要的，外源DNA可以取代這一片段，例如Charon 4A、 EMBL 3/ 4、Charon40等載體，這些載體是用Lac 5（乳糖操縱子的大部分系列，包括完整的Lac Z）替換入噬菌體的中間區(qū)段，同時將Lac 5作為選擇標記，使用時用EcoRI水解，去掉中

60、間的片段，再與欲克隆片段在體外進行重組、包裝。而后，感染E.coli使之在E.coli內繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。換型噬菌體是使用最廣泛的載體。 Lac 5 EcoR I EcoR IEcoR I BanH I Sal I Sal I BamH I EcoR I MCS MCS Charon 4AEMBL3/4Charon 40替換型載體克隆外源替換型載體克隆外源DNADNA的步驟的步驟1. 應用適當?shù)暮怂醿惹忻赶d體， 除去可取代的DNA片段； 2. 將上述所得的 DNA載體臂同外源 DNA片段的連接； 3. 對重組體的DNA分子進行包裝和增 殖，以得到有感染性的重組噬菌體 取代