細(xì)胞因子檢測(cè)(1)

1、2 一類由細(xì)胞分泌，具有多種功能的高活性小分子一類由細(xì)胞分泌，具有多種功能的高活性小分子蛋白，參與免疫調(diào)節(jié)和多種生理病理過程等。蛋白，參與免疫調(diào)節(jié)和多種生理病理過程等。 v白細(xì)胞介素白細(xì)胞介素(interleukin, IL)v干擾素干擾素(interferon, IFN)v腫瘤壞死因子腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)v集落刺激因子集落刺激因子(colony stimulating factor, CSF)v生長(zhǎng)因子生長(zhǎng)因子(growth factor, GF)v趨化因子趨化因子(chemokine)3優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：敏感、可靠；敏感、可靠；缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：需長(zhǎng)期飼

2、養(yǎng)細(xì)需長(zhǎng)期飼養(yǎng)細(xì)胞、檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、步胞、檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、步驟繁雜。驟繁雜。1不同的不同的CK具有不同的具有不同的生物學(xué)活性，選擇生物學(xué)活性，選擇CK獨(dú)特的生物學(xué)活性，即獨(dú)特的生物學(xué)活性，即可檢測(cè)?？蓹z測(cè)。細(xì)胞增殖細(xì)胞增殖/抑制實(shí)驗(yàn)抑制實(shí)驗(yàn)細(xì)胞病變抑制實(shí)驗(yàn)細(xì)胞病變抑制實(shí)驗(yàn)細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)生物學(xué)檢測(cè)法生物學(xué)檢測(cè)法2利用抗體對(duì)抗原表位的利用抗體對(duì)抗原表位的識(shí)別，測(cè)定的是可溶性識(shí)別，測(cè)定的是可溶性細(xì)胞因子的抗原性。細(xì)胞因子的抗原性。ELISARIAFIAELISPOT。免疫學(xué)檢測(cè)法免疫學(xué)檢測(cè)法優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：方便、迅速方便、迅速缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：價(jià)格昂貴，結(jié)價(jià)格昂貴，結(jié)果僅代表果僅代表CK

3、的量而非的量而非活性，敏感性較低?；钚?，敏感性較低。3利用基因探針，檢測(cè)特利用基因探針，檢測(cè)特定細(xì)胞因子基因表達(dá)，定細(xì)胞因子基因表達(dá)，即即mRNA水平。水平。斑點(diǎn)雜交斑點(diǎn)雜交Northern印跡印跡細(xì)胞和組織原位雜交細(xì)胞和組織原位雜交RT-PCR。分子生物學(xué)檢測(cè)法分子生物學(xué)檢測(cè)法局限性：局限性：僅能檢測(cè)基因表僅能檢測(cè)基因表達(dá)情況，不能直接提供有達(dá)情況，不能直接提供有關(guān)細(xì)胞因子的濃度和活性，關(guān)細(xì)胞因子的濃度和活性，只用于機(jī)制探討。只用于機(jī)制探討。4待檢樣品待檢樣品( (細(xì)胞上清細(xì)胞上清) ) 指示細(xì)胞（指示細(xì)胞（CTLL-2CTLL-2）IL-2IL-2依賴細(xì)胞系依賴細(xì)胞系按不同稀按不同稀釋度加

4、入釋度加入3737C C，16-2016-20小時(shí)小時(shí)加入加入3 3HTdRHTdR（1-51-5 CiCi）3737C C，4-64-6小時(shí)小時(shí)收集細(xì)胞收集細(xì)胞測(cè)定測(cè)定5待檢樣品（細(xì)胞上清）待檢樣品（細(xì)胞上清） IFN-IFN- 指示細(xì)胞（指示細(xì)胞（wishwish）按不同稀按不同稀釋度加入釋度加入3737C C，4 4小時(shí)小時(shí)3737C C，24-4824-48小時(shí)小時(shí)棄取上清，加入棄取上清，加入VSVVSV( (水泡性口炎病毒水泡性口炎病毒) )觀察細(xì)胞病變（鏡檢或比色）觀察細(xì)胞病變（鏡檢或比色）6Using CFSE to track CML progenitor proliferat

5、ionSDMSDM + Glivec7Calculation of Proliferative Index (P.I.)CFSE -4 3 2 1 0The Proliferative Index is the sum of the cells in all generations divided by the calculated number of original parent cells.It is useful for comparing quantity of cell division between cultures of the same cells undergoing d

6、ifferent treatments.8Cell Proliferation ELISA Kit, BrdU (colorimetric)9Chromium-51 (51Cr) release assays 10計(jì)數(shù)受趨化細(xì)胞計(jì)數(shù)受趨化細(xì)胞趨化因子趨化因子細(xì)胞細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)示意圖趨化實(shí)驗(yàn)示意圖微孔微孔濾膜濾膜11 用示蹤物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原，使其與相應(yīng)的用示蹤物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原，使其與相應(yīng)的抗原或抗體反應(yīng)，使微量的、不可見的反應(yīng)成為抗原或抗體反應(yīng)，使微量的、不可見的反應(yīng)成為可見的或可測(cè)定的?？梢姷幕蚩蓽y(cè)定的。免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)12 高通量細(xì)胞因子檢測(cè)高通量細(xì)胞因子檢測(cè)vCBA (Cytom

7、etric Bead Array)是一種微珠多是一種微珠多用途檢測(cè)分析技術(shù)，它由一系列的微珠組合用途檢測(cè)分析技術(shù)，它由一系列的微珠組合來捕獲并結(jié)合流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)來捕獲并結(jié)合流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液、液、EDTAEDTA血漿、血清樣本中被檢測(cè)物質(zhì)的量。血漿、血清樣本中被檢測(cè)物質(zhì)的量。其采用夾心法分析策略，與傳統(tǒng)的其采用夾心法分析策略，與傳統(tǒng)的ELISAELISA分分析技術(shù)相比，此方法可以同時(shí)檢測(cè)多項(xiàng)指標(biāo)。析技術(shù)相比，此方法可以同時(shí)檢測(cè)多項(xiàng)指標(biāo)。用已知的標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以得出用已知的標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以得出被測(cè)樣本的濃度。此分析方法不受樣本量的被測(cè)樣本的濃度。此分析方

8、法不受樣本量的限制，而且可以得到一個(gè)樣本的多個(gè)數(shù)據(jù)。限制，而且可以得到一個(gè)樣本的多個(gè)數(shù)據(jù)。13Cytokine network141516CBA原理示意圖原理示意圖1718v Lab Invest 2003, 83:11311146 cytokine bead arrays(CBA)19ELISPOT(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)) )vELISPOTELISPOT技術(shù)利用結(jié)合在固相載體上的抗細(xì)胞因子技術(shù)利用結(jié)合在固相載體上的抗細(xì)胞因子的特異性抗體，在分泌細(xì)胞周圍直接撲獲待檢細(xì)胞的特異性抗體，在分泌細(xì)胞周圍直接撲獲待檢細(xì)胞因子。實(shí)驗(yàn)中每個(gè)斑點(diǎn)（因子。實(shí)驗(yàn)中每個(gè)斑點(diǎn)（spotspot）是激活

9、的淋巴細(xì)胞）是激活的淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子區(qū)域，代表一個(gè)活性淋巴細(xì)胞。它分泌的細(xì)胞因子區(qū)域，代表一個(gè)活性淋巴細(xì)胞。它可在單細(xì)胞水平檢測(cè)淋巴細(xì)胞對(duì)特異性抗原的反應(yīng)可在單細(xì)胞水平檢測(cè)淋巴細(xì)胞對(duì)特異性抗原的反應(yīng)能力。能力。v優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，是目前為止最靈敏的檢測(cè)技術(shù)。靈敏度高，是目前為止最靈敏的檢測(cè)技術(shù)?？蓹z測(cè)到百萬分之一陽(yáng)性細(xì)胞率可檢測(cè)到百萬分之一陽(yáng)性細(xì)胞率; ; 單細(xì)胞水平、活單細(xì)胞水平、活細(xì)胞功能檢測(cè)細(xì)胞功能檢測(cè); ; 操作簡(jiǎn)便，可進(jìn)行高通量篩選。操作簡(jiǎn)便，可進(jìn)行高通量篩選。1.特異性單抗包被在培養(yǎng)板孔底部；特異性單抗包被在培養(yǎng)板孔底部；2.封閉能結(jié)合單抗的其他部位；封閉能結(jié)合單抗的其他

10、部位；3.加入細(xì)胞及刺激物培養(yǎng)，陽(yáng)性細(xì)胞加入細(xì)胞及刺激物培養(yǎng)，陽(yáng)性細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子被單抗捕獲；分泌的細(xì)胞因子被單抗捕獲；4.移出細(xì)胞，洗滌；移出細(xì)胞，洗滌；5.加入生物素標(biāo)記的二抗；加入生物素標(biāo)記的二抗；6.加入酶標(biāo)鏈霉親和素；加入酶標(biāo)鏈霉親和素；7.加入顯色底物，在酶的催化分解下，加入顯色底物，在酶的催化分解下，產(chǎn)生不可溶的色素，就近沉淀在局產(chǎn)生不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑點(diǎn)；部的膜上形成斑點(diǎn)；8.斑點(diǎn)計(jì)數(shù)（可人工計(jì)數(shù)，也可用自斑點(diǎn)計(jì)數(shù)（可人工計(jì)數(shù)，也可用自動(dòng)讀板儀計(jì)數(shù)），數(shù)據(jù)處理，結(jié)果動(dòng)讀板儀計(jì)數(shù)），數(shù)據(jù)處理，結(jié)果分析。分析。ELISPOT2122應(yīng)應(yīng) 用用v 移植研究移植研

11、究-allograft rejection -allograft rejection v 疫苗開發(fā)疫苗開發(fā)- -亦可評(píng)估疫苗效力，或是疫苗注射路徑影響亦可評(píng)估疫苗效力，或是疫苗注射路徑影響 v Th0/Th1/Th2Th0/Th1/Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)換分析細(xì)胞轉(zhuǎn)換分析 v 自體免疫研究自體免疫研究- -免疫調(diào)節(jié)及免疫治療研究免疫調(diào)節(jié)及免疫治療研究 v 癌癥研究癌癥研究- -腫瘤反應(yīng)腫瘤反應(yīng)T T細(xì)胞作用細(xì)胞作用 v 過敏機(jī)制探討過敏機(jī)制探討-IL-4-IL-4誘導(dǎo)免疫球蛋白亞型轉(zhuǎn)換，其它參誘導(dǎo)免疫球蛋白亞型轉(zhuǎn)換，其它參與過敏機(jī)制之細(xì)胞因子的研究與過敏機(jī)制之細(xì)胞因子的研究 v 傳染疾病研究傳染疾病研究

12、-Lyme disease, Chlamydia infections, -Lyme disease, Chlamydia infections, Helicobacter pylori infections, HIV infections, multiple Helicobacter pylori infections, HIV infections, multiple sclerosis, sclerosis, 等等 MediumPHAPeptide 1Peptide 21Peptide 47GzBHIV- peptide recall patient BIFN- HIV-peptide

13、specific recall response shows dissociated production of IFN- and GzBKleen T. et al, AIDS 2003, 18: 383-39224ELISPOT 和和 ELISA的區(qū)別的區(qū)別ELISPOT ELISPOT 法源自法源自 ELISA ELISA ，又突破傳統(tǒng)，又突破傳統(tǒng) ELISA ELISA 法，是定量法，是定量 ELISA ELISA 技術(shù)的延伸和新的發(fā)展，它們最大的不同技術(shù)的延伸和新的發(fā)展，它們最大的不同: : 1.ELISA 1.ELISA通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可通過顯

14、色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量溶性蛋白總量( (整體水平整體水平);ELISPOT);ELISPOT也是通過顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可也是通過顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，可直接在顯微鏡下人工計(jì)數(shù)溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，可直接在顯微鏡下人工計(jì)數(shù)斑點(diǎn)或通過斑點(diǎn)或通過ELISPOTELISPOT分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，1 1個(gè)斑點(diǎn)代表個(gè)斑點(diǎn)代表1 1個(gè)細(xì)胞，從個(gè)細(xì)胞，從而計(jì)算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率（而計(jì)算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率（單細(xì)胞水平單細(xì)胞水平）；）；2.ELISPOT2.ELISP

15、OT比比ELISAELISA更敏感。更敏感。ELISPOTELISPOT技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域：自身免疫診斷和預(yù)后分析、器官技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域：自身免疫診斷和預(yù)后分析、器官移植后排斥反應(yīng)的預(yù)測(cè)、過敏性疾病脫敏治療的監(jiān)測(cè)、疫移植后排斥反應(yīng)的預(yù)測(cè)、過敏性疾病脫敏治療的監(jiān)測(cè)、疫苗和藥品的研發(fā)與檢測(cè)等。苗和藥品的研發(fā)與檢測(cè)等。25胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測(cè)LPS活化單核細(xì)胞內(nèi)活化單核細(xì)胞內(nèi)TNF-的測(cè)定的測(cè)定R1：淋巴細(xì)胞；：淋巴細(xì)胞；R2：?jiǎn)魏思?xì)胞：?jiǎn)魏思?xì)胞26TNF- 的誘生和檢測(cè)的誘生和檢測(cè)v主要由主要由單核單核/ /巨噬細(xì)胞巨噬細(xì)胞及其他多種細(xì)胞產(chǎn)生，能及其他多種細(xì)胞產(chǎn)生，能使殺傷腫瘤細(xì)胞使殺傷腫瘤細(xì)胞; ;vTHP-1THP-1( (人單核細(xì)胞系人單核細(xì)胞系) )在在LPSLPS( (脂多糖脂多糖) )刺激下可刺激下可分泌分泌TNF-TNF- ; ;vL929L929( (小鼠成纖維細(xì)胞小鼠成纖維細(xì)胞) )可被可被THP-1THP-1分泌的分泌的TNF-TNF- 殺傷，且細(xì)胞的死亡率與殺傷，且細(xì)胞的死亡率與TNF-TNF- 活性成正比活性成正比; ;v四甲基偶氮唑鹽四甲基偶氮唑鹽( (MTTMTT) )在活細(xì)胞線粒體的琥珀酸在活細(xì)