實(shí)驗(yàn)一 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備簡介

1、實(shí)驗(yàn)一 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備簡介一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?熟悉分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用儀器并熟練使用二、實(shí)驗(yàn)原理 1、恒溫氣浴搖床：用于對溫度和振蕩頻率有較高要求的細(xì)菌培養(yǎng)，發(fā)酵，雜交，生化反應(yīng)及酶和組織研究等。 2、超凈工作臺：用于分子生物學(xué)無菌操作。 3、低溫臺式高速離心機(jī)：用于分離純化DNA和蛋白質(zhì)等，如基因片段的分離，蛋白酶的沉淀和回收等。 4、微量移液管：是連續(xù)可調(diào)的，計(jì)量和轉(zhuǎn)移液體的專用儀器，其裝有直接讀數(shù)容量計(jì)。有多種規(guī)格：0.5-10L10-100L20-200L100-1000L。 5、電泳儀：用于確定大分子物質(zhì)的分子量以及鑒定物種親緣關(guān)系的儀器。 6、PCR儀：用于目的基因的擴(kuò)增，

2、是一對寡糖核苷酸引物結(jié)合到正負(fù)DNA鏈上的靶序列兩側(cè)，從而酶促合成拷貝數(shù)為百萬倍的靶序列DNA片段。主要用于基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究等領(lǐng)域。 7、滅菌鍋：用于細(xì)菌和細(xì)胞培養(yǎng)及核酸等有關(guān)實(shí)驗(yàn)使用的試劑，器皿及實(shí)驗(yàn)用具的嚴(yán)格滅菌。三、實(shí)驗(yàn)儀器恒溫氣浴搖床、超凈工作臺、低溫臺式高速離心機(jī)、微量移液管、滅菌鍋、PCR儀、電泳儀。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）、恒溫氣浴要穿的使用：1、樣品瓶牢固放入彈簧夾中2、接通電源開關(guān)，儀器進(jìn)入準(zhǔn)備狀態(tài) 3、參數(shù)設(shè)定，（設(shè)定溫度、時(shí)間、轉(zhuǎn)速等參數(shù) ）4、按啟動(dòng)鍵儀器開始工作，按暫停鍵可暫停托盤的旋轉(zhuǎn)； 5、按電源鍵，顯示屏顯示消失，關(guān)閉電源總開關(guān)（二）、超凈工作臺的使用1、使用工作臺

3、時(shí)，先經(jīng)過清潔液浸泡的紗布擦拭臺面，然后用消毒劑擦拭消毒。 2、接通電源，提前30分鐘打開紫外燈照射消毒，處理凈化工作區(qū)內(nèi)工作臺表面積累的微生物，15分鐘后，關(guān)閉紫外燈，開啟送風(fēng)機(jī)。 3、工作臺面上，不要存放不必要的物品，以保持工作區(qū)內(nèi)的潔凈氣流不受干擾。 4、操作結(jié)束后，清理工作臺面，收集各廢棄物，關(guān)閉風(fēng)機(jī)及照明開關(guān)，用清潔劑及消毒劑擦拭消毒。 5、最后開啟工作臺紫外燈，照射消毒30分鐘后，關(guān)閉紫外燈，切斷電源。 （三）、低溫臺式高速離心機(jī)的使用1、把離心機(jī)放置于平面桌或平面臺上，目測使之平衡，用手輕搖一下離心機(jī)，檢查離心機(jī)是否放置平衡。2、打開門蓋，將離心管放入轉(zhuǎn)子內(nèi)，離心管必須成偶數(shù)對稱

4、放入，且要事先平衡，完畢用手輕輕旋轉(zhuǎn)一下轉(zhuǎn)子體，使離心管架運(yùn)轉(zhuǎn)靈活。3、關(guān)上門蓋，注意一定要使門蓋鎖緊，完畢用手檢查門蓋是否關(guān)緊。4、插上電源插座，按下電源開關(guān)（電源開關(guān)在離心機(jī)背面，電源座上方）。5、設(shè)置轉(zhuǎn)子號、轉(zhuǎn)速、時(shí)間：在停止?fàn)顟B(tài)下時(shí)，用戶可以設(shè)置轉(zhuǎn)子號、轉(zhuǎn)速、時(shí)間，此時(shí)離心機(jī)處于設(shè)置狀態(tài)，停止燈亮、運(yùn)行燈閃爍；按下啟動(dòng)離心開始 （常用，最高轉(zhuǎn)速為13000r/min，時(shí)間最長為20分鐘）；注意：對應(yīng)的轉(zhuǎn)子一定要設(shè)置在相應(yīng)的轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)，不可超速使用，否則對試管或轉(zhuǎn)子有損壞。6、離心機(jī)時(shí)間倒計(jì)時(shí)到“0”時(shí)，離心機(jī)將自動(dòng)停止，當(dāng)轉(zhuǎn)子停轉(zhuǎn)后，打開門蓋取出離心管，關(guān)斷電源開關(guān)。（四）、微量移液管

5、的使用1 將微量移液器裝上吸頭（不同規(guī)格的移液器用不同的吸頭）2 將微量移液器按鈕輕輕壓至第一停點(diǎn)；3 垂直握持微量移液器，使吸嘴浸入液樣面下幾毫米，千萬不要將吸嘴直接插到液體底部；4 緩慢、平穩(wěn)地松開控制按鈕，吸上樣液。否則液體進(jìn)入吸嘴太快，導(dǎo)致液體倒吸入移液器內(nèi)部，或吸入體積減少；5 等一秒鐘后將吸嘴提離液面6 平穩(wěn)地把按鈕壓到第一停點(diǎn)，再把按鈕壓至第二停點(diǎn)以排出剩余液體；7 提起微量移液器，然后按吸嘴彈射器除去吸嘴。 （五）、PCR的使用 1、開機(jī)：打開開關(guān)，視窗上顯示“SELF TEST”。2、放入樣品管，關(guān)緊蓋子。 3、如果要運(yùn)行已經(jīng)編好的程序，則直接按Proceed， 用

6、箭頭鍵選擇已儲存的程序，按Proceed，則開始執(zhí)行程序。 4、如果要輸入新的程序，則在RUN-ENTER菜單上用箭頭鍵選擇ENTER PROGRAM,按Proceed， 1）命名新的程序，最多8個(gè)字母，輸入后按Proceed確認(rèn)(如何輸入字母、數(shù)字)。 2）輸入程序步驟：名字輸入后，確認(rèn)，然后輸入相關(guān)程序5、輸入完成的程序后，到RUN-ENTER菜單，選擇新程序，開始運(yùn)行。 6、其它：用pause可以暫停一個(gè)運(yùn)行的程序，再按一次繼續(xù)程序。用stop或Cancel可停止運(yùn)行的程序。 （六）、 電泳儀的使用1 首先用導(dǎo)線將電泳槽的兩個(gè)電極與電泳儀的直流輸出端聯(lián)接，注意極性不要接反。2按

7、電源開關(guān)，顯示屏出現(xiàn)“歡迎使用DYY-12型電腦三恒多用電泳儀”等字樣后，同時(shí)系統(tǒng)初始化，蜂鳴4聲，設(shè)置常設(shè)置。屏幕轉(zhuǎn)成參數(shù)設(shè)置狀態(tài)，根據(jù)工作需要選擇穩(wěn)壓穩(wěn)流方式及電壓電流范圍。3確認(rèn)各參數(shù)無誤后，按“啟動(dòng)”鍵，啟動(dòng)電泳儀輸出程序。在顯示屏狀態(tài)欄中顯示Start! 并蜂鳴4聲，提醒操作者電泳儀將輸出高電壓，注意安全。之后逐漸將輸出電壓加至設(shè)置值。同時(shí)在狀態(tài)欄中顯示“Run”，并有兩個(gè)不斷閃爍的高壓符號，表示端口已有電壓輸出。在狀態(tài)欄最下方，顯示實(shí)際的工作時(shí)間（精確到秒） 4電泳結(jié)束，儀器顯示：“END”，并連續(xù)蜂鳴提醒。此時(shí)按任一鍵可止鳴（七）、高壓滅菌鍋1、開蓋：轉(zhuǎn)動(dòng)手輪，使鍋蓋離開密封圈，

8、添加蒸餾水剛沒至板上2、通電：將控制面板上電源開關(guān)按至ON處，若水位低（LOW）紅燈亮 3、堆放物品：需包扎的滅菌物品，體積不超過200mm×100mm×100mm為宜，各包裝之間留有間隙，堆放在金屬框內(nèi)，這樣有利 于蒸汽的穿透，提高滅菌效果 ，滅菌時(shí)間： 121， 20min，；如為液體，液體必須裝在可耐高溫的玻璃器皿中，且不可裝滿，2/3即可， 121， 18-20min4、密封高壓鍋：推橫梁入立柱內(nèi)，旋轉(zhuǎn)手輪，使鍋蓋下壓，充分壓緊 5、設(shè)定時(shí)間和溫度，開始滅菌6、滅菌結(jié)束，所有東西放入干燥箱干燥，排盡水氣五、思考題1、列出分子生物學(xué)常用儀器的名稱，用途及操作時(shí)的注意事

9、項(xiàng)。 答：恒溫氣浴搖床：常用于液體搖勻以培養(yǎng)微生物、細(xì)菌和細(xì)胞等。注意要依據(jù)不同的用途設(shè)置不同的參數(shù)。超凈工作臺：常用于為微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)提供無菌操作環(huán)境。注意操作時(shí)關(guān)掉紫外燈，避免給人類帶來傷害。低溫臺式高速離心機(jī)：常用于分離純化蛋白、病毒、細(xì)胞等。使用時(shí)不能隨便移動(dòng)離心機(jī)或打開蓋子；離心機(jī)運(yùn)行時(shí)要處于鎖定狀態(tài)；離心管的放置要處于平衡狀態(tài)。微量移液管：用于計(jì)量和轉(zhuǎn)移微量液體的專用儀器。操作時(shí)注意避免槍頭的污染；調(diào)節(jié)刻度時(shí)不宜超過最大量程；使用完后將刻度調(diào)到最大收藏。電泳儀：可對不同物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析，或?qū)⒁欢ɑ旌衔镞M(jìn)行組分分析或單個(gè)組分的提取制備。操作時(shí)不可把導(dǎo)線極性接反；當(dāng)電泳儀進(jìn)入工作狀

10、態(tài)后，避免人體與其各部分的接觸，不同介質(zhì)支持物的電泳不要同時(shí)在同一電泳儀上進(jìn)行；若使用時(shí)出現(xiàn)異常，要立刻切斷電源。PCR儀：用于擴(kuò)增DNA片斷。操作時(shí)應(yīng)注意蓋子要蓋緊，按正確步驟進(jìn)行。高壓高溫滅菌鍋：用于殺菌消毒。使用時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)程操作，避免發(fā)生安全事故。實(shí)驗(yàn)二 瓊脂糖凝膠電泳的制備及核酸檢測一. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理;2、學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳的操作。二. 實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，沸水中溶解，45開始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動(dòng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩

11、效應(yīng)。不同DNA，其分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系。溴化乙錠（EB）未扁平狀分子，在紫外照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物，其發(fā)射的熒光強(qiáng)度較游離狀態(tài)EB發(fā)射的熒光強(qiáng)度大10倍以上，且熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比。三、儀器和試劑儀器： 微量移液器，電泳儀，電泳槽，微波爐 試劑： 瓊脂糖：1.0%；電泳緩沖液（50 × TAE 電泳緩沖液取Tris24.2g ，冰醋酸5.7ml ， 0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml ，加蒸餾水至1

12、00ml ） EB：5 µl / 100 ml TBE 電泳材料：標(biāo)準(zhǔn)分子量核酸（DL2000）四. 操作步驟（1）制膠（以20 mL為例） a. 稱取0.2 g 瓊脂糖，加入20 ml 的1XTAE緩沖液（pH 8.0），搖勻； b. 微波爐加熱，至瓊脂糖完全溶解（要防止過熱溢出三角瓶）； c.將制膠板放入制膠槽中，插入適當(dāng)?shù)氖嶙?，將溶解的瓊脂糖（約50）加入2ul EB后，混均勻，倒入其中，直至厚度為46 mm（如有氣泡要把氣泡趕出），在室溫下冷卻凝固(約30 45 min)； d.小心垂直向上拔出梳子,以保證點(diǎn)樣孔完好,將膠板置于電泳槽中。（2）點(diǎn)樣 用微量移液器將5 µl含藍(lán)色染液的 DL2000 加入點(diǎn)樣孔下部。（3）電泳 打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至35 V/cm(約100 V)，可見到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動(dòng)，約30-40分鐘后即可觀察結(jié)果。（4）觀察將電泳好的膠置于紫外透射檢測儀上，打開紫外燈，可見到橙紅色核酸條帶，根據(jù)條帶粗細(xì)，可粗略估計(jì)該樣品DNA的濃度。如同時(shí)有已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA進(jìn)行電泳，則可通過線性DNA條帶的相對位置初步估計(jì)樣品的分子量。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果點(diǎn)樣時(shí)效果較好的照片點(diǎn)出的白色熒光線比較