植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理及要點(diǎn)

1、植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理及要點(diǎn)李琳玲1.技術(shù)路線技術(shù)路線目的基因分離植物表達(dá)載體的構(gòu)建受體材料的準(zhǔn)備遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化組織組織脫分化轉(zhuǎn)化植株篩選煉苗 1.目的基因的分離目的基因的分離v（1）已知基因的獲得）已知基因的獲得v化學(xué)合成法vPCR擴(kuò)增v（2）未知基因的獲得）未知基因的獲得v構(gòu)建基因組文庫(kù)，篩選目的基因v構(gòu)建cDNA文庫(kù)，篩選目的基因vmRNA差異顯示技術(shù)篩選差異表達(dá)基因v差異蛋白質(zhì)譜表達(dá)技術(shù)篩選功能基因vpGEM-T反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄cDNAchs全長(zhǎng)全長(zhǎng)cDNA的克隆的克隆TA克隆及測(cè)序克隆及測(cè)序向向chs兩端引入酶切位點(diǎn)兩端引入酶切位點(diǎn)雙酶切雙酶切定向克隆定向克隆導(dǎo)入農(nóng)桿菌導(dǎo)入農(nóng)桿菌 2.植物表達(dá)

2、載體的構(gòu)建植物表達(dá)載體的構(gòu)建例 pBI121-chs構(gòu)建pBI121圖譜銀杏chs基因植物表達(dá)載體構(gòu)建示意圖chs -glucuronidose NOS ter CaMV35Pchs3.受體材料的準(zhǔn)備v細(xì)胞的全能性：分化細(xì)胞脫分化 再分化 4.遺傳轉(zhuǎn)化v（1）間接轉(zhuǎn)化法）間接轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法 v（2）直接轉(zhuǎn)化法v A、 基因槍轉(zhuǎn)化法v B、 電擊法v C、花粉管通道法v D、 PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化法v根癌農(nóng)桿菌根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciens),是一種革蘭氏陰性土壤桿菌,它含有Ti質(zhì)粒,能誘導(dǎo)被侵染的植物細(xì)胞形成腫瘤,即誘發(fā)冠癭瘤.Ti質(zhì)粒(

3、包括Ri質(zhì)粒)上有一段轉(zhuǎn)移DNA,在農(nóng)桿菌侵染宿主植物時(shí),這段DNA可以轉(zhuǎn)移進(jìn)植物細(xì)胞,并穩(wěn)定地保留在植物細(xì)胞染色體中,變?yōu)橹参锛?xì)胞新增加的一群基因,最終能通過(guò)有性世代遺傳給子代 。返 回v基因槍轉(zhuǎn)化法由美國(guó)Cornell大學(xué)的Sanfor (1987)提出,它的主要原理是將包含目的基因的載體包被在微小的金屬微粒(鎢?；蚪鹆?表面,通過(guò)高壓驅(qū)動(dòng)力加速微粒穿透植物細(xì)胞壁,導(dǎo)入受體組織細(xì)胞內(nèi),然后通過(guò)組織培養(yǎng)再生出完整的植株.微粒上的外源DNA進(jìn)入細(xì)胞后,整合到染色體上并得到表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)化.。返 回v電擊法的主要原理是將原生質(zhì)體在溶液中與DNA混合,然后利用高壓電脈沖作用,使原生質(zhì)體膜的

4、某些部位被擊穿而產(chǎn)生可回復(fù)的小孔,外源DNA可通過(guò)小孔進(jìn)入原生質(zhì)體內(nèi),而且不影響經(jīng)電擊處理的原生質(zhì)體再生植物的能力. 返 回 v花粉管通道法是利用開(kāi)花植物授粉后形成的花粉管通道,直接將外源目的基因?qū)肷胁痪邆湔＜?xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)目的基因轉(zhuǎn)化. 返 回vPEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化的主要原理是聚乙二醇(PEG)、多聚-L-鳥(niǎo)核苷酸(pLO)、磷酸鈣及高pH值條件下誘導(dǎo)原生質(zhì)體攝取外源DNA分子.PEG可促使細(xì)胞膜與DNA間接觸與粘連,并通過(guò)引起膜表面電荷的紊亂及干擾細(xì)胞間的識(shí)別,利于細(xì)胞膜間的融合以及外源DNA進(jìn)入原生質(zhì)體. 返 回表1 幾種植物轉(zhuǎn)基因方法比較轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)轉(zhuǎn)化的

5、缺點(diǎn)DNA間接轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移受體種類，可以在原生質(zhì)體、蛋細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)、組織器官或整株等多級(jí)水平上進(jìn)行，方法成熟可靠，簡(jiǎn)便易行，周期短，轉(zhuǎn)化率高；轉(zhuǎn)化雙子葉植物為主。大多數(shù)單子葉植物和裸子植物對(duì)農(nóng)桿菌的侵入不敏感，限制了該法在禾谷類作物中的應(yīng)用。轉(zhuǎn)化體常出現(xiàn)“嵌合”現(xiàn)象，需在嚴(yán)格條件下加以選擇以淘汰未轉(zhuǎn)化細(xì)胞DNA直接轉(zhuǎn)化法（1）基因槍轉(zhuǎn)化法（2） 電擊法（3） PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化法（4）花粉管通道法無(wú)宿主限制，適用于各種單、雙子葉植物，操作簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)化效率低，需要專門(mén)設(shè)備（電擊儀、顯微操作儀或基因槍），多數(shù)需要原生質(zhì)體與愈傷組織，周期太長(zhǎng)（電擊法） 5.轉(zhuǎn)化組織 農(nóng)桿菌介導(dǎo)之葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法帶

6、有轉(zhuǎn)化基因的農(nóng)桿菌活化帶有轉(zhuǎn)化基因的農(nóng)桿菌活化受體植物受體植物葉盤(pán)葉盤(pán)侵染侵染共培養(yǎng)共培養(yǎng)篩選培養(yǎng)篩選培養(yǎng)誘導(dǎo)成苗誘導(dǎo)成苗預(yù)培養(yǎng)葉預(yù)培養(yǎng)葉盤(pán)，或愈盤(pán)，或愈傷組織傷組織遺傳轉(zhuǎn)化主要的影響因素：遺傳轉(zhuǎn)化主要的影響因素：1.預(yù)培養(yǎng)時(shí)間：一般03天，過(guò)長(zhǎng)不利于侵染2.農(nóng)桿菌濃度：用MS（pH=7.0）鹽溶液調(diào)OD值（一般在 0.21.0）3.侵染時(shí)間：時(shí)間應(yīng)適中，太短轉(zhuǎn)化率低；太高則后期農(nóng)桿菌難以除凈，毒害材料。4.共培養(yǎng)時(shí)間5.乙酰丁香酮（AS）處理：處理方式及濃度 (A) 僅共培養(yǎng)基中加AS (B) 僅菌液中加AS (C) 菌液和共培養(yǎng)基中均加AS AS使用濃度：50M200M實(shí)驗(yàn)結(jié)論：實(shí)驗(yàn)結(jié)論：

7、A A與與C C效果最好且差異不明顯效果最好且差異不明顯6.煉苗7.轉(zhuǎn)基因苗的篩選與鑒定培養(yǎng)過(guò)程中利用標(biāo)記基因篩選標(biāo)記基因標(biāo)記基因選擇標(biāo)記基因選擇標(biāo)記基因(Slective gene)報(bào)告基因報(bào)告基因(Report gene)抗生素類選擇基因抗除草劑類選擇基因生物安全性標(biāo)記類選擇基因-D-葡萄糖酸苷酶基因(Gus)熒光素酶基因(Luc)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(Cat)綠色熒光蛋白基因(Gfp)例 Gus檢測(cè)原理：葡萄糖酸苷酶基因（Gus），催化葡萄糖苷酯類物質(zhì)水解。其中很多水解產(chǎn)物具有發(fā)色團(tuán)或形成熒光物質(zhì)。例：組織化學(xué)法測(cè)定Gus活性 作用底物為X-gluc,產(chǎn)物是一種不可溶的5,5-二溴，4,4-二氯靛藍(lán)；轉(zhuǎn)基因植物的PCR檢測(cè)外源基因整合的PCR-Southern雜交檢測(cè)外源基因拷貝的IPCR檢測(cè)外源基因表達(dá)的