植物總DNA的提取

1、農(nóng)業(yè)生物學實驗教學中心制作人：劉紅梅植物基因組 DNA的提取瓊脂糖凝膠電泳檢測n脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸(DNA)(DNA)、核糖核酸、核糖核酸(RNA)(RNA) n與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起以核蛋白（與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起以核蛋白（DNPDNP）的形式存在。）的形式存在。在制備核酸時通常破壞細胞壁及細胞膜來使核蛋在制備核酸時通常破壞細胞壁及細胞膜來使核蛋白釋放出來。白釋放出來。n植物總植物總DNADNA包括細胞核包括細胞核DNADNA和細胞核外和細胞核外DNA,DNA,前者存前者存在于細胞核內(nèi)，后者存在于細胞質(zhì)中有半自主性在于細胞核內(nèi)，后者存在于細胞質(zhì)中有半自主性復制活性的細胞器內(nèi)，例如線粒體復制活性

2、的細胞器內(nèi)，例如線粒體DNA(mtDNA)DNA(mtDNA)和和葉綠體葉綠體DNA(ctDNA)DNA(ctDNA)。背景知識背景知識核酸的存在形式核酸的存在形式nDNADNA為白色類似石棉樣的為白色類似石棉樣的纖維狀物纖維狀物， RNARNA的純品的純品呈呈白色粉末或結(jié)晶白色粉末或結(jié)晶。核酸和核苷酸大都呈酸味。核酸和核苷酸大都呈酸味。 nDNADNA、RNARNA和核苷酸都是和核苷酸都是極性化合物極性化合物，一般都溶于，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑，它們的鈉鹽比水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水。游離酸易溶于水。n在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱堿性溶

3、液在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。中較穩(wěn)定。 核酸的理化性質(zhì)核酸的理化性質(zhì)細胞破碎細胞破碎 抽提去蛋白質(zhì)抽提去蛋白質(zhì) 沉淀核酸沉淀核酸基本過程基本過程 機械方法：機械方法： 超聲波處理法、研磨法、勻漿法；超聲波處理法、研磨法、勻漿法； 化學試劑法：化學試劑法：用用SDSSDS處理細胞；處理細胞； 酶解法：酶解法： 加入溶菌酶或蝸牛酶，破壞細胞壁。加入溶菌酶或蝸牛酶，破壞細胞壁。 細胞破碎細胞破碎 uSDSSDS法法 SDSSDS是有效的陰離子去垢劑是有效的陰離子去垢劑, , 細胞中細胞中DNADNA與蛋與蛋白質(zhì)之間白質(zhì)之間 常借靜電引力或配位鍵結(jié)合常借靜電引力或配位鍵結(jié)合,

4、 , SDSSDS能夠能夠破壞這種價鍵。破壞這種價鍵。uCTABCTAB法法 CTABCTAB是一種陽離子去垢劑，它可以溶解膜是一種陽離子去垢劑，它可以溶解膜與脂膜，使細胞中的與脂膜，使細胞中的DNA-DNA-蛋白質(zhì)復合物釋放出來，蛋白質(zhì)復合物釋放出來，并使蛋白質(zhì)變性，使并使蛋白質(zhì)變性，使DNADNA與蛋白質(zhì)分離。與蛋白質(zhì)分離。DNADNA提取提取u 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 常用苯酚：氯仿：異戊醇（常用苯酚：氯仿：異戊醇（2525：2424：1 1）或氯仿：異戊醇（或氯仿：異戊醇（2424：1 1）抽提。）抽提。u RNA RNA 常選用常選用RNaseRNase消化消化 ，或是用，或是用LiClLiC

5、l來消除大來消除大分子的分子的RNARNA。u 酚類物質(zhì)酚類物質(zhì) 提取液中加少量巰基乙醇，選取幼嫩提取液中加少量巰基乙醇，選取幼嫩的材料。的材料。u 多糖多糖 提取液中加提取液中加1 1PVPPVP。DNADNA純化（去雜質(zhì)）純化（去雜質(zhì)）實驗材料實驗材料 新鮮蔬菜葉片新鮮蔬菜葉片( (去葉脈去葉脈) )試劑試劑 2 2CTABCTAB抽提液抽提液 TE TE 緩沖液緩沖液(pH=8.0) (pH=8.0) 氯仿：異戊醇氯仿：異戊醇(24:1)(24:1) 材料與試劑材料與試劑離心機離心機 水浴鍋水浴鍋研缽研缽 微量移液器微量移液器儀器用具儀器用具移液器量程的選擇移液器量程的選擇1取取 2g

6、清洗涼干的新鮮葉片于研缽中，加清洗涼干的新鮮葉片于研缽中，加 1/3 藥匙石英砂藥匙石英砂和和 4mL 2 倍的倍的 CTAB 提取液，迅速研磨。提取液，迅速研磨。2將將 1mL 研磨液轉(zhuǎn)入研磨液轉(zhuǎn)入 1.5mL 離心管中，置于離心管中，置于65水浴中保水浴中保溫溫 20min，其間顛倒混勻，其間顛倒混勻23次。次。破碎細胞破碎細胞3. 12000r/min 離心離心 5min，取上清液，取上清液700L轉(zhuǎn)到另一離心管轉(zhuǎn)到另一離心管中。加入等體積氯仿：異戊醇（中。加入等體積氯仿：異戊醇（24:1）混合液，充分顛倒）混合液，充分顛倒混勻。混勻。12000r/min，離心，離心 5min。抽提去蛋

7、白抽提去蛋白4將上清液移入新的將上清液移入新的1.5mL離心管內(nèi)，加離心管內(nèi)，加 600L異丙醇。顛異丙醇。顛倒混勻，可見倒混勻，可見 DNA 絮狀沉淀。絮狀沉淀。沉淀核酸沉淀核酸512000r/min，離心，離心 1min，倒掉上清液，將離心管倒置干，倒掉上清液，將離心管倒置干燥。燥。 將沉淀回溶于將沉淀回溶于20L TE 緩沖液待測。緩沖液待測。操作步驟操作步驟1)選取新鮮材料，研磨迅速徹底，研磨好的材料應與選取新鮮材料，研磨迅速徹底，研磨好的材料應與 CTAB 抽提抽提液充分混勻；液充分混勻；2)若提取產(chǎn)物有顏色，可能是材料中含有較多的多酚類物質(zhì)，添若提取產(chǎn)物有顏色，可能是材料中含有較多

8、的多酚類物質(zhì)，添加巰基乙醇（加巰基乙醇（25），盡可能選取幼嫩的材料；），盡可能選取幼嫩的材料；3）收集）收集 CTAB 與核酸形成的復合物時不要離心過度，否則沉淀與核酸形成的復合物時不要離心過度，否則沉淀再溶解難；再溶解難；4）為了獲得具有生物活性的天然核酸，在分離制備過程中必須采）為了獲得具有生物活性的天然核酸，在分離制備過程中必須采用溫和的條件，避免過酸過堿、劇烈地攪拌，防止熱變性，同用溫和的條件，避免過酸過堿、劇烈地攪拌，防止熱變性，同時還要避免核酸降解酶類的降解。時還要避免核酸降解酶類的降解。注意事項注意事項DNADNA分子在高于等電分子在高于等電點的點的PHPH溶液中帶負溶液中帶負

9、電荷，在電場中向電荷，在電場中向正極移動。在一定正極移動。在一定電場強度下，電場強度下，DNADNA分分子的遷移速度與相子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)對分子質(zhì)量的對數(shù)成反比。成反比。電泳原理電泳原理瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。儀器和試劑儀器和試劑 儀器儀器 電泳儀電泳儀 電泳槽電泳槽 灌膠模具等灌膠模具等Tris-硼酸（硼酸（TBE） Tris-乙酸（乙酸（TAE） Tris-磷酸（磷酸（TPE）常用電泳緩沖液常用電泳緩沖液 電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一電泳指示劑溴酚蘭在堿性液

10、體中呈紫蘭色，一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400400組成上樣緩沖液。組成上樣緩沖液。 作用：作用：增加樣品比重，以確保增加樣品比重，以確保DNADNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。均勻沉入加樣孔內(nèi)。形成肉眼可見的指示帶，預測核酸電泳的速度和位置。形成肉眼可見的指示帶，預測核酸電泳的速度和位置。使樣品呈色，使加樣操作更方便。使樣品呈色，使加樣操作更方便。上樣緩沖液上樣緩沖液溴化乙錠（溴化乙錠（EBEB）是一種熒光染料，是一種熒光染料，EBEB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。其熒光強度與在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。其熒光強度與

11、DNADNA的含的含量成正比。據(jù)此可粗略估計樣品量成正比。據(jù)此可粗略估計樣品DNADNA濃度。濃度。 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠EBEB染色，肉眼可見核酸電泳帶，其染色，肉眼可見核酸電泳帶，其DNADNA量一般量一般5ng5ng。核酸染色劑核酸染色劑注意事項：注意事項：EBEB是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。DNADNA分子量標準分子量標準不同種類不同種類DNA Marker1.1.凝膠制備凝膠制備 制備制備0.8%0.8%瓊脂糖凝膠。稱取適量瓊脂糖加瓊脂糖凝膠。稱取適量瓊脂糖加入入 20mL 0.520mL 0.5TBETBE，加熱至瓊脂糖全部熔

12、化，冷卻至，加熱至瓊脂糖全部熔化，冷卻至50-60 50-60 時，加入時，加入 EB EB 至終濃度至終濃度 0.50.5g/mLg/mL。緩慢倒入。緩慢倒入膠板，待膠凝固后拔出梳子。膠板，待膠凝固后拔出梳子。2.2.加樣加樣 取取1010l DNAl DNA樣液與樣液與 2 2l l 上樣上樣 buffeer buffeer 混勻，混勻，用微量移液器小心加入樣品槽。用微量移液器小心加入樣品槽。3.3.電泳電泳 接通電源，切記靠近加樣孔的一端為負，電壓接通電源，切記靠近加樣孔的一端為負，電壓為為15V/cm15V/cm（長度以兩個電極之間的距離計算）（長度以兩個電極之間的距離計算）, ,待溴酚待溴酚蘭移動到一定位置，停止電泳。蘭移動到一定位置，停止電泳。4.4.觀察拍照觀察拍照四、操作步驟四、操作步驟p