植物蛋白質(zhì)的提取和含量測定

1、植物蛋白質(zhì)的提取和含量測定植物蛋白質(zhì)的提取和含量測定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握大豆蛋白的提取及制備大豆蛋白掌握大豆蛋白的提取及制備大豆蛋白丙酮干粉的方法。丙酮干粉的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理大豆蛋白主要是酸性蛋白，大豆蛋白主要是酸性蛋白，pI 4.5-5.0pI 4.5-5.0，能溶于堿溶液，能溶于堿溶液 本實(shí)驗(yàn)先利用稀堿提取大豆蛋白，再利用丙酮結(jié)合等電點(diǎn)溶解度最低原理沉淀蛋白。2. Folin-2. Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量酚法測定蛋白質(zhì)含量 酚試劑由兩部分組成，試劑A為雙縮脲試劑，可與肽鏈發(fā)生顯色反應(yīng)，試劑B中的磷鉬酸和磷鎢酸在OH-條件下不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原顯藍(lán)色，因

2、蛋白質(zhì)中含Tyr被還原成藍(lán)色，顏色深淺與濃度成正比，可用比色法測定。三、實(shí)驗(yàn)器材三、實(shí)驗(yàn)器材 分光光度計(jì)（500nm），比色皿 計(jì)算紙（9 cm9 cm） 離心機(jī) （離心管100ml 、50ml） 組織搗碎機(jī) 精密pH試紙pH 0.5-5.0; pH 4.5-7.0四、實(shí)驗(yàn)試劑四、實(shí)驗(yàn)試劑1.大豆干粉 2. 0.2%NaOH 3. 丙酮 （預(yù)冷）4. 6M HCl，1M HCl5 標(biāo)準(zhǔn) BSA（0.5 mg/ml）6. Folin酚試劑甲（用前組分一: 組分二 = 50:1）（1） 1克 Na2CO3和0.2克 NaOH溶解于50毫升蒸餾水中。（2） 0.5克硫酸銅（CuSO45H2O）溶解1

3、00毫升 1%酒石酸鉀鈉 （KNaC4H4O64H2O）中。 每次使用前，將50ml（1）與1ml（2）混合，即為試劑甲。四、實(shí)驗(yàn)試劑四、實(shí)驗(yàn)試劑7. Folin酚酚試劑乙試劑乙 （用前稀釋一倍）（用前稀釋一倍）在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉（Na2WO42H2O）,25克鉬酸鈉（Na2MoO42H2O）及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時(shí)，回流結(jié)束時(shí)，加入150克 硫 酸 鋰（Li2SO4），50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。稀

4、釋至1升，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當(dāng)稀釋，約加水1倍，使最終的酸濃度為1N左右。五、實(shí)驗(yàn)步驟五、實(shí)驗(yàn)步驟（一）蛋白提?。ㄒ唬┑鞍滋崛?.1.稱取稱取3 3克大豆干粉，克大豆干粉，加入加入0.2%NaOH0.2%NaOH 30 30毫升。（先加入調(diào)成糊狀，再用毫升。（先加入調(diào)成糊狀，再用少量多次地慢慢地加入（邊加邊攪拌），室溫下攪拌抽提少量多次地慢慢地加入（邊加邊攪拌），室溫下攪拌抽提10min10min，于，于4000r/min4000r/min離心離心7min ,7min ,小心留取上清液，棄脂層和沉淀，如上清液有漂浮物，小心留取上清液，

5、棄脂層和沉淀，如上清液有漂浮物，再經(jīng)過濾；再經(jīng)過濾；2. 2. 留出上清液留出上清液2 2毫升稀釋毫升稀釋5050倍做含量測定（第二步）倍做含量測定（第二步）3.3.制干粉：制干粉： 量剩余上清液的體積，加入等體積預(yù)冷丙酮，先用量剩余上清液的體積，加入等體積預(yù)冷丙酮，先用6mol/L6mol/L的的HClHCl調(diào)調(diào)pHpH至至6.06.0，再用，再用1mol/L1mol/L的的HClHCl小心調(diào)小心調(diào)pHpH至至4.5-5.04.5-5.0，于，于4000r/min4000r/min離心離心15min15min，( (留取沉淀物留取沉淀物) )，并用少量丙酮反復(fù)，并用少量丙酮反復(fù)( (至少兩次

6、至少兩次) )攪拌洗滌（在離心管中進(jìn)行），攪拌洗滌（在離心管中進(jìn)行），加入丙酮后一定將沉淀攪拌充分，使沉淀脫水。得到白色粉末狀的大豆蛋白粉，加入丙酮后一定將沉淀攪拌充分，使沉淀脫水。得到白色粉末狀的大豆蛋白粉，用干凈的濾紙吸干、平鋪在表面皿上，放入用干凈的濾紙吸干、平鋪在表面皿上，放入4040度烘箱干燥，待整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束度烘箱干燥，待整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，再稱重并計(jì)算產(chǎn)率后，再稱重并計(jì)算產(chǎn)率（即（即3 3克大豆干粉中蛋白含量）克大豆干粉中蛋白含量）。五、實(shí)驗(yàn)步驟五、實(shí)驗(yàn)步驟（二）蛋白含量測定（二）蛋白含量測定1. 1. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線制作標(biāo)準(zhǔn)曲線按照下表操作，以按照下表操作，以A500nmA500nm為縱坐標(biāo)，以蛋白含量為橫坐標(biāo)建立標(biāo)曲。為縱坐標(biāo)，以蛋白含量為橫坐標(biāo)建立標(biāo)曲。2. 2. 測