Lipofectamine2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗步驟注意事項

1、Invitrogen 陽離子轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗步驟注意事項2010-07-10 16:16Invitrogen 的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑：Lipofectamine 2000Lipofectamine 2000 是最為人熟知的轉(zhuǎn)染產(chǎn)品之一。已知可為517種細(xì)胞（見下面連接地址）提供高轉(zhuǎn)染效率（表達(dá)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)）和活性（細(xì)胞抽提物中轉(zhuǎn)入基因的酶產(chǎn)物活性）。特點 兩個關(guān)鍵性特點使得Lipofectamine 2000 試劑的轉(zhuǎn)染步驟快速簡便：（1） DNA陽離子脂質(zhì)體試劑的復(fù)合體可以直接加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，有血清也 不怕（ 2）轉(zhuǎn)染后不需要除去Lipofecta

2、mine 2000 試劑，無需換培養(yǎng)基操作流程事實上 Lipofectamine 系列產(chǎn)品操作流程都是又快又簡單：稀釋DNA以及 Lipofectamine 2000，混合2 種稀釋液保溫20 分鐘，加入培養(yǎng)細(xì)胞中孵育24 96 小時檢測結(jié)果。下面是Invitrogen 提供的詳細(xì)流程和注意事項。轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化細(xì)胞并計數(shù)，細(xì)胞鋪板，使其在轉(zhuǎn)染日密度為90%。細(xì)胞鋪板在 0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生長的培養(yǎng)基中。對于每孔細(xì)胞，使用50膜無血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEM培養(yǎng)基）稀釋0.8 仙 g-1.0 / DNA 對于每孔細(xì)胞，使用 50履OPTI- MEM培養(yǎng)基稀釋1-3川LI

3、POFECTAMINE2000試劑。 Lipofectamine 2000稀釋后保溫5分鐘（在30分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合。保溫時間過長會降低活性。）注意：即使Lipofectamine 2000 使用OPTI-MEM稀釋，細(xì)胞也可以使用 D-MEM9養(yǎng)。如果 D-MEMK為Lipofectamine 2000的稀釋液，必須在5分鐘內(nèi)同稀釋的DNA昆合?；旌舷♂尩腄NA（第2步）和稀釋的Lipofectamine 2000 （第3步）。在室溫保 溫 20 分鐘。注意：溶液可能會混濁，但不會影響轉(zhuǎn)染。復(fù)合物可以在室溫保持6 小時穩(wěn)定。直接將復(fù)合物加入到每孔中，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻。注意：如果在無

4、血清條件下轉(zhuǎn)染，使用含血清的正常生長培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞鋪板。在加入復(fù)合物前移去生長培養(yǎng)基，替換為0.5ml 無血清培養(yǎng)基。在37C , 5%的CO2中保溫24-48小時，無須去掉復(fù)合物或更換培養(yǎng)基或者在 4-5 小時后更換生長培養(yǎng)基也不會降低轉(zhuǎn)染活性。在細(xì)胞中加入復(fù)合物24-72 小時后， 分析細(xì)胞抽提物或進(jìn)行原位細(xì)胞染色，檢測報告基因活性。這依賴于細(xì)胞類型和啟動子活性。對穩(wěn)定表達(dá)，在開始轉(zhuǎn)染一天后將細(xì)胞傳代至新鮮培養(yǎng)基中，兩天后加入篩選抗生素。進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)需要數(shù)天或數(shù)周。對于96孔板培養(yǎng)，不再需要提前一天進(jìn)行細(xì)胞鋪板，而可以直接在平板中制備 復(fù)合物，然后將細(xì)胞懸浮液加入到復(fù)合物就可以了， 這樣進(jìn)

5、一步減少了轉(zhuǎn)染時間。 這種改進(jìn)步驟已經(jīng)過293-H, 293-F, COS-7L和CHOffl胞的試驗，同傳統(tǒng)方法相 比活性稍低。快捷的步驟和蛋白表達(dá)細(xì)胞系的高效轉(zhuǎn)染使得Lipofectamine 2000非常適用于96孔板的高通量轉(zhuǎn)染，比如cDNAt庫的篩選和蛋白瞬時表達(dá)。適用細(xì)胞株范圍 不同的轉(zhuǎn)染試劑所適用的細(xì)胞株范圍各不相同。一個實驗室常 常會用到不止一種細(xì)胞株，甚至是比較特殊的細(xì)胞株。一個轉(zhuǎn)染試劑所適用的細(xì) 胞株越多，當(dāng)然越受用戶的歡迎。根據(jù)Invotrogen網(wǎng)站的資料，Lipofectamine 2000已經(jīng)證實可用于高達(dá)517種細(xì)胞株，覆蓋了相當(dāng)廣的范圍。要看看 Lipofect

6、amine 2000是否適用于你現(xiàn)有的細(xì)胞株，可以訪問以下Invitrogen 網(wǎng)( nes.dsp searchRange)適用的核酸類型和DN秋小 有的轉(zhuǎn)染試劑是為siRNA轉(zhuǎn)染而設(shè)計的，有的則是 為DNA專染設(shè)計。Lipofectamine 2000可以適用于包括 DNA siRNA, dsRNA,熒 光標(biāo)記的Oligo, RNA在內(nèi)的核酸車專染,這使得 Lipofectamine 2000適用范圍 非常廣泛，無論是基因表達(dá)分析的DNA專染，或者是RNAi, Lipofectamine 2000 都能勝任，這樣你就不需要為不同目的購買不同試劑了。值得注意的是，最常用的DNA專染中有一個D

7、N砍小的問題，太大的質(zhì)粒不那么好轉(zhuǎn)。我們暫時還沒有 找至U Lipofectamine 2000 相應(yīng)的資料。用量和價格 好東西往往不便宜。可是在實驗室中，價格往往是最具有殺傷力的。 Lipofectamine 2000 用的劑量大嗎？價格如何？根據(jù)說明書，24孔板轉(zhuǎn)染每次用2ul左右，1.5ml Lipofectamine 2000 大約可做750次24孔板轉(zhuǎn)染，或者大 約150次6孔板轉(zhuǎn)染，而1.5ml Lipofectamine 2000當(dāng)前市場價格4667元，0.75ml 價格是2798元(可以磨到多少折扣就要看你的侃價功力了)。平均下來，再算 上折扣，Lipofectamine 20

8、00 性價比還是挺高的。注意事項Lipofectamine 2000 要求細(xì)胞鋪板密度較高，以 90%-95%&佳，這有 助于減少陽離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性造成的影響。Lipofectamine 2000 可用于有血清培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)染，并且轉(zhuǎn)染前后不需要換培養(yǎng)基，使得操作方便了許多，但是要 注意制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物時要求用無血清培養(yǎng)基稀釋DNAffi轉(zhuǎn)染試劑，因為血清會影響復(fù)合物的形成。復(fù)合物形成后是可以加入血清。這里要特別注意檢測所用的無 血清培養(yǎng)基是否能和 Lipofectamine 2000匹配，比如已知CD293,SFMII, VP-SFM 就不行。此外還應(yīng)該留意，如果你研究的基因要求比較長的

9、表達(dá)時間，比如細(xì)胞周期相關(guān)基因，或者時細(xì)胞表面蛋白，最好選擇細(xì)胞鋪板密較低的轉(zhuǎn)染試劑，不適合用 Lipofectamine 2000 。對于大多數(shù)陽離子脂質(zhì)體試劑，應(yīng)優(yōu)化DN砥度和陽離子脂質(zhì)體試劑量以得到最 大的轉(zhuǎn)染效率。DNAF口轉(zhuǎn)染試劑的比傷通常推薦是1:2或者1:3,優(yōu)化可以從 0.5-5之間慢慢試。使用小劑量確定的優(yōu)化條件可以用于進(jìn)行大劑量的轉(zhuǎn)染，只 要根據(jù)培養(yǎng)板表面比例線性增加鋪板細(xì)胞的數(shù)目、陽離子脂質(zhì)體試劑和DNA1就可以了。還有轉(zhuǎn)染的時候培養(yǎng)基中不能添加抗生素?？股?， 比如青霉素和鏈霉素，一般對于真核細(xì)胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了

10、細(xì)胞的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素，甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時也要避免使用抗生素。這樣， 在轉(zhuǎn)染前就不必潤洗細(xì)胞。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，因為這些抗生素是GENETICIN4擇性抗生素的競爭性抑制劑。另外，為了保 證無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的健康生長，使用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量。陽離子脂質(zhì)體應(yīng)該在4 度保存， 要注意避免多次反復(fù)長時間開蓋，因為可能會導(dǎo)致脂質(zhì)體氧化而影響轉(zhuǎn)染效率。當(dāng)然還有要注意質(zhì)粒的質(zhì)量，質(zhì)粒的內(nèi)毒素是轉(zhuǎn)染的大敵，Invitrogen 自然是大力推薦自家的質(zhì)粒純化產(chǎn)品啦，這個嘛，看看生物通前面的質(zhì)粒純化專題有特別介紹

11、就好啦。Lipofectamine 2000 CD 和 Optifect作為一個新產(chǎn)品，Lipofectamine 2000 CD 當(dāng)然應(yīng)該有區(qū)別于原來的Lipofectamine 2000 。這個 1ml 就要賣到5000多塊的新產(chǎn)品好在哪里？主要是由于不采用動物來源的材料，可以滿足某些特殊要求，比如要求不含動物來源材料等。 其他優(yōu)缺點和Lipofectamine 2000 差不多。 以 24孔板計算，一次 2ul,1ml足夠 500 次轉(zhuǎn)染，但價格不便宜，要5000 多元。Optifect 主要是為在較低鋪板密度條件下轉(zhuǎn)染而設(shè)計的，比如細(xì)胞增埴相關(guān)基因和細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)和研究往往要求

12、較長的表達(dá)周期，細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)和研究、還有部分高通量篩選等等也要求在較低鋪板密度條件下轉(zhuǎn)染，由于Lipofectamine 2000 要求轉(zhuǎn)染時90 95匯片而不太適合，Optifect 就是一個選擇。 Optifect 最佳的鋪板密度是30 -70%，其他的操作和注意事項也和Lipofectamine 2000 相近。同樣可以直接加入細(xì)胞培養(yǎng)物中，轉(zhuǎn)染前后都不需要更換血清，同樣不要加抗生素，等等。1ml 價格是3616，用量相對高一些，24孔板一次需要3 4ul ， 6 孔板就要用到15 24ul/ 次，每次算下來就比前面的貴了。三、聞道有先后，術(shù)業(yè)有專攻，Invitrogen 的其他幾

13、個當(dāng)家花旦LIPOFECTAMINE PLU輿老版LIPOFECTAMIN的改良版。力口入 PLUSM齊后會導(dǎo)致在廣泛條件下的高活性，不需要進(jìn)行細(xì)節(jié)優(yōu)化就可以進(jìn)行高活性轉(zhuǎn)染了。實驗步驟同樣很簡單，細(xì)胞鋪板密度以轉(zhuǎn)染當(dāng)天匯合度至70%到 90%為宜。DMRIE-C轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞效率最高，如Jurkat細(xì)胞以及其他淋巴細(xì)胞來源的細(xì)胞 系。也可以用來轉(zhuǎn)染搖瓶中使用 CDCHOW養(yǎng)基培養(yǎng)的懸浮CHOffl胞，易于放大。 另外建議用DMRIE-C RNA專染入貼壁細(xì)月fi0它比使用 LIPOFECTIN轉(zhuǎn)染RNA1 BHK-21細(xì)胞的表達(dá)水平高。CELLFECTIN轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞的首選，特別是于昆蟲基因表達(dá)

14、中生產(chǎn)桿狀病毒的Sf9 和 Sf21 細(xì)胞以及果蠅細(xì)胞。LIPOFECTIN已經(jīng)成功用于人類和非人類內(nèi)皮細(xì)胞的瞬時轉(zhuǎn)染。除了質(zhì)粒DNA專染外，使用LIPOFECTIN&可以將RNA寡聚核甘酸，酵母人工染色體和蛋白轉(zhuǎn) 入多種細(xì)胞系。四、 陽離子轉(zhuǎn)染試劑的一些注意事項（Invitrogen 提供）有血清時的轉(zhuǎn)染：血清一度曾被認(rèn)為會降低轉(zhuǎn)染效率，但只要在DNA陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物形成時不含血清，在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的。陽離子脂質(zhì)體和DNA勺最佳量在使用血清時會有所不同，因此如果你想在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清需要對條件進(jìn)行優(yōu)化。大部分細(xì)胞可以在無血清培養(yǎng)基中幾個小時內(nèi)保持健康。對于對血清缺乏比

15、較敏感的細(xì)胞，可以使用 OPTI-MEM培養(yǎng)基，一種營養(yǎng)豐富的無血清培養(yǎng)基，或者在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中使用血清。對于對血清缺乏比較敏感的貼壁細(xì)胞，建議使用LIPOFECTAMINE 200。 0培養(yǎng)基中的抗生素：抗生素，比如青霉素和鏈霉素，一般對于真核細(xì)胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素，甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時也要避免使用抗生素。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，因為這些抗生素是GENETICIN擇性抗生素的競爭性抑制劑。 另外， 為了保證無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的健康生長，使

16、用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量。細(xì)胞維護(hù)和培養(yǎng)的演變：可以通過常規(guī)的次培養(yǎng)步驟保持轉(zhuǎn)染鋪板前的細(xì)胞健康。每周傳代一到兩次，不要使細(xì)胞保持融合超過24 小時。大多數(shù)已建立的細(xì)胞系都是非整倍體，原代培養(yǎng)包括了表達(dá)不同基因組合的細(xì)胞的混合物。細(xì)胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。 這會導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。如果隨時間發(fā)現(xiàn)這種變化，融化一管新鮮的細(xì)胞可能會恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性。比如，新鮮融化的NIH 3T3細(xì)胞比傳代 8 次的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率。融化細(xì)胞的進(jìn)一步傳代并沒有降低轉(zhuǎn)染效率。 因此， 如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞

17、以恢復(fù)最佳結(jié)果。細(xì)胞鋪板密度： 用于轉(zhuǎn)染的最佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。一般轉(zhuǎn)染時，貼壁細(xì)胞密度為 70%-90%懸浮細(xì)月fi密度為2X106-4X106細(xì)胞/ml時效果較好。確保轉(zhuǎn)染時細(xì)胞沒有長滿或處于靜止期。因為轉(zhuǎn)染效率對細(xì)胞密度很敏感， 所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。在三種不同密度進(jìn)行細(xì)胞鋪板的比較表明鋪板密度最高的，CAT舌性也最高，試劑的量也相應(yīng)增加。這些結(jié)果說明，對于轉(zhuǎn)染相 同量的DN廝需的最佳陽離子脂質(zhì)體試劑的量會因細(xì)胞密度而異。啟動子的選擇： 獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細(xì)胞系和要表達(dá)的蛋白

18、。CMVS動子在大多數(shù)細(xì)胞類型中可以獲得高表達(dá)活性。同其他啟動子，如SV40和RSVffi比，在BHK-21中其活性最高。這三種病毒啟動子在T細(xì)胞來源的細(xì)胞系，如Jurkat中組成表達(dá)水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA 可以激活Jurkat細(xì)胞中CMVS動子，而單PMAft足以激活KG1和K562 （人骨髓 瘤白細(xì)胞）中的CMVI動子。SV40啟動子的表達(dá)在含有大T抗原（存在于COS-1 和COS-7時會提高，因為大T抗原可以刺激染色體外的合成。DNA1:高質(zhì)量的DNA寸于進(jìn)行高效的轉(zhuǎn)染至關(guān)重要。瞬時和穩(wěn)定表達(dá)：DNA專染后，轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)可以在1 4天內(nèi)檢測到。僅有 一部分轉(zhuǎn)入

19、細(xì)胞的DNA®轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)彳T轉(zhuǎn)錄并最終輸出 mRNA細(xì)胞質(zhì)進(jìn) 行蛋白合成。幾天內(nèi)，大部分外源DN心被核酸酶降解或隨細(xì)胞分裂而稀釋； 一 周后就檢測不到其存在了。瞬時表達(dá)分析檢測非重組質(zhì)粒DNA1基因的表達(dá)。因 此， 表達(dá)水平與位置無關(guān)，不會受到周圍染色體元件的影響。瞬時表達(dá)分析所需的人力和時間比穩(wěn)定表達(dá)少，但因為DNA®入效率和表達(dá)水平在不同實驗中差異較大， 實驗必須很小心。為了進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，轉(zhuǎn)入的基因必須能和細(xì)胞同步復(fù)制。在轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒自發(fā)整合到宿主基因組上時就會如此。在一小部分轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，加入的DNAffi過重組整合到基因組上。包含整合DNA勺細(xì)胞很少，必須通過對

20、藥物的抗性篩選進(jìn)行擴(kuò)增或通過表型變化進(jìn)行鑒定。穩(wěn)定基因表達(dá)實驗需要數(shù)周，如果需要驗證蛋白產(chǎn)量，所需的時間更長。但得到的細(xì)胞系可以做為蛋白生產(chǎn)的穩(wěn)定來源或用于得到轉(zhuǎn)基因動物。瞬時轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染效率的監(jiān)測： 基因的瞬時表達(dá)在24-72 小時內(nèi)就結(jié)束了。這種快速的瞬時表達(dá)非常適用于驗證質(zhì)粒表達(dá)和監(jiān)測轉(zhuǎn)染步驟的效率。可以使用報告基因來確定優(yōu)化條件，其表達(dá)蛋白易檢測，在目的細(xì)胞中不含此蛋白或水平很低。常用的報告基因包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT ,綠色熒光蛋白（GFP ,熒光素 酶（Lux或Luc）以及b-半乳糖甘酶（b-gal ）?？梢允褂煤唵蔚姆峭凰胤椒?檢測b-gal的表達(dá)以測定轉(zhuǎn)染效率和活性。pCM

21、V-SPORT- bga質(zhì)粒包含CMVn 動子調(diào)控下的LacZ基因，轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞內(nèi)后可以直接表達(dá) bgal。結(jié)合簡單的 檢測步驟，可以做為監(jiān)測轉(zhuǎn)染條件的一種方便靈敏的方法。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的篩選： 連同帶有藥物抗性的篩選標(biāo)記基因一起轉(zhuǎn)染目的基因是建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系最常用的方法。氨基糖甘磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（APH£ neor）可 以合成APHB,通過磷酸化使藥物失活，從而提供對GENETCI選擇性抗生素（G418 Sulfate ）的抗性?？股乜剐曰蚩梢耘c目的基因在同一個質(zhì)粒上，也可以在不同的質(zhì)粒上。如果兩個不同的質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染，兩個質(zhì)粒都可能整合形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。 對于兩種不同質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)

22、染，帶有目的基因的質(zhì)粒和帶有篩選標(biāo)記的質(zhì)粒間的比例為3:1 或更高以保證抗性克隆帶有轉(zhuǎn)染的目的基因。瞬時轉(zhuǎn)染效率的改進(jìn)一般也會提高穩(wěn)定轉(zhuǎn)染效率。比如，使用LIPOFECTAMINELUS式齊I得到的NIH 3T3細(xì)胞GENETICING生素抗性克隆的數(shù)目比單獨使用 LIPOFECTAMINE力口了大 約 3 倍。要進(jìn)行穩(wěn)定的表達(dá)分析，在轉(zhuǎn)染后次培養(yǎng)細(xì)胞，低密度鋪板，給予生長空間，在幾天或數(shù)周內(nèi)保持篩選壓力。生長的細(xì)胞比不分裂的細(xì)胞更快的受到GENETICING生素的影響。轉(zhuǎn)染后，在開始篩選前等待 48-72小時，使細(xì)胞表達(dá)足夠量的抗性酶，保證在開始篩選時可以自我保護(hù)。轉(zhuǎn)染后 48-72 小時倒

23、掉培養(yǎng)基，加入含有GENETICIN%生素的培養(yǎng)基，抗生素的濃度根據(jù)劑量反應(yīng)曲線確定，足夠殺死未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。因為許多因子影響到篩選所需的 GENETICING生素的最佳 濃度，包括細(xì)胞類型，培養(yǎng)基和血清濃度等，所以有必要對每種細(xì)胞作一個劑量 反應(yīng)曲線，確定最佳濃度。篩選可能需要較長時間，因為在致死劑量的GENETICIN 抗生素存在條件下，細(xì)胞會分裂1-2次。在維持培養(yǎng)細(xì)胞時使用較低劑量的抗生 素，一般是篩選劑量的一半。篩選后的細(xì)胞一般是離散的克隆， 根據(jù)實驗?zāi)康牟?同，可以分別純化（克?。?，收集進(jìn)行大量培養(yǎng)或染色并進(jìn)行抗性克隆的計數(shù)。蛋白表達(dá)和培養(yǎng)基的選擇：哺乳動物細(xì)胞系合成可溶的，翻譯后修飾

24、的蛋白，比 細(xì)菌，真菌或昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的蛋白更有可能有生物活性。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以合成大量的重組蛋白，而瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以快速表達(dá)， 迅速地合成小量蛋白。常 用的細(xì)胞系包括 CHO293和COS-%Invitrogen 提供克隆的293-F , 293-H, COS-7 和CHO-SM胞，來源于經(jīng)篩選轉(zhuǎn)染效率更高的亞細(xì)胞系。這些細(xì)胞也可用于無血清和限定化學(xué)成分培養(yǎng)基。重組蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)一般在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的懸浮細(xì)胞中 進(jìn)行。這些細(xì)胞易于生長到高密度并合成更多蛋白。使用基質(zhì)珠做為固相支持可 以使貼壁細(xì)胞懸浮生長。用于蛋白生產(chǎn)的細(xì)胞的轉(zhuǎn)染可以在添加有血清或無血清 培養(yǎng)基中進(jìn)行。但更傾向于使用無血清培養(yǎng)基

25、表達(dá)蛋白，因為血清蛋白會干擾下游表達(dá)蛋白的純化。無血清培養(yǎng)基一般針對某一特定細(xì)胞類型優(yōu)化并有幾類無血 清培養(yǎng)基不需要添加血清，一般含有不均一的或大量的蛋白（但比添加血清的培 養(yǎng)基低得多）。無蛋白培養(yǎng)基不含蛋白但可能含有不明成分的抽提物。限定化學(xué)成分的培養(yǎng)基不含有蛋白或未知組成的成分。多種多樣的配方使您可以選擇最適 合您應(yīng)用的一種。在含血清時轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以適應(yīng)無血清培養(yǎng)基，無蛋白培養(yǎng)基或限定化學(xué)成分的培養(yǎng)基。在部分情況下（如293-F, 293-H, COS-井口 CHO-S , 對于已適應(yīng)無血清或無蛋白培養(yǎng)基的細(xì)胞，可以使用其培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染。其他一些無血清培養(yǎng)基包含抑制陰離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的成

26、分。在這些情況下，有必要在諸如 D-MEME OPTI-MEM 等培養(yǎng)基 中進(jìn)行培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染.轉(zhuǎn)染FAQs針對同種陽離子脂質(zhì)體的疑難解答Q1:轉(zhuǎn)染效率低A1:1）沒有使用優(yōu)化的陽離子脂質(zhì)體試劑。解決建議：選擇針對您的細(xì)胞類型轉(zhuǎn) 染效率可能最高的陽離子脂質(zhì)體試劑。 參見附錄A或網(wǎng)站（ ） 上“Transfection Collection ”中的參考文獻(xiàn)列表。2）沒有使用優(yōu)化條件。解決建議：優(yōu)化陽離子脂質(zhì)體試劑和 DNA勺量。參見第7 章優(yōu)化步驟。參見網(wǎng)站（ 在Tech-online 分子生物學(xué)部分） 上的細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)染步驟。3）DNA-陽離子脂質(zhì)體試劑復(fù)合物在存在血清條件下形成。解決建議：在復(fù)

27、合體形 成時不要使用血清。OPTI-MEMI培養(yǎng)基和DMEMI用于復(fù)合體形成的較好的培養(yǎng) 基。如果使用含有血清的培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染，保證在無血清條件形成復(fù)合物。注意： 不要將OPTI-MEM I培養(yǎng)基用于LIPOFECTAMINE PLUS劑或昆蟲細(xì)胞。對于 Sf9 和Sf21細(xì)胞，Sf- 900II SFM會得到最佳結(jié)果。4）存在抑制劑。解決建議：不要在用于制備DNA陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基 中使用抗生素，EDTA檸檬酸鹽，磷酸鹽，RPMI硫酸軟骨素，透明質(zhì)酸，硫酸 葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。5) 不恰當(dāng)?shù)募?xì)胞密度。解決建議: 細(xì)胞密度應(yīng)該在轉(zhuǎn)染時融合度為70%-90%。6)轉(zhuǎn)染DNA勺啟動子

28、-增強(qiáng)子沒有被宿主細(xì)胞識別。解決建議：確保轉(zhuǎn)染DNA勺啟動子 - 增強(qiáng)子同目的細(xì)胞類型兼容。7) 陽離子脂質(zhì)體試劑凍結(jié)。解決建議: 不要使用凍結(jié)的或儲存溫度低于4的陽離子脂質(zhì)體試劑。8) 轉(zhuǎn)染分析的問題。解決建議: 轉(zhuǎn)染分析中加入陽性對照。9) 質(zhì)粒純化的問題。解決建議: 請核對是否使用轉(zhuǎn)染級的質(zhì)粒純化試劑盒。通常轉(zhuǎn)染級的質(zhì)粒純化試劑盒使用 DEAEW脂而非硅樹脂，并且最好是用重力流動(過濾) 的方法而不是離心技術(shù)，因為樹脂帶來的污染會導(dǎo)致較高的內(nèi)毒素。另一種方法(可用于任何級別的純化試劑盒)，是在最后一步從樹脂柱上洗脫質(zhì)粒后，將溶液置于55的水浴上保溫5 分鐘。 最后小心地從上至下吸取2/3

29、 的溶液 (不要碰到底部)使用。這是減少樹脂的交叉污染的方法。Q2:細(xì)胞死亡率高。A2:1)DNA量太高。 解決建議：作一個劑量-反應(yīng)曲線以確定最佳的DNA1。在劑 量-反應(yīng)轉(zhuǎn)染中加入陽離子脂質(zhì)體試劑，因為單獨DN岫會對細(xì)胞生長有一個基礎(chǔ)的影響。參見第7 章微調(diào)優(yōu)化方法。2) 陽離子脂質(zhì)體試劑量太高。解決建議: 作一個劑量- 反應(yīng)曲線以確定最佳的陽離子脂質(zhì)體試劑的量。在劑量-反應(yīng)轉(zhuǎn)染中加入DNA因為單獨陽離子脂質(zhì)體試劑也只對細(xì)胞生長有一個基礎(chǔ)的影響。參見第7 章微調(diào)優(yōu)化方法。3) 在轉(zhuǎn)染過程中使用抗菌素。解決建議: 在轉(zhuǎn)染過程中不要使用氯霉素，青霉素或鏈霉素，因為陽離子脂質(zhì)體試劑使細(xì)胞更敏感。

30、4) 細(xì)胞太少。解決建議: 作一個劑量- 反應(yīng)曲線以確定每個轉(zhuǎn)染過程中最佳的細(xì)胞數(shù)量。根據(jù)您的應(yīng)用所要求的效率調(diào)整細(xì)胞數(shù)量。5)在無血清條件下細(xì)胞活性降低。解決建議：使用OPTI-MEM培養(yǎng)基。降低或省去在無血清培養(yǎng)基中清洗的次數(shù)。在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中使用5%到 10%的血清。確保在不存在血清的條件下形成復(fù)合物。6) 陽離子脂質(zhì)體試劑氧化了。解決建議 : 不要過分?jǐn)噭踊蛘袷庩栯x子脂質(zhì)體試劑；這可能會形成陽離子脂質(zhì)體試劑的過氧化物。7) 對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，篩選抗生素加入的太快。解決建議: 在加入篩選性抗生素前至少預(yù)留 48 小時使細(xì)胞表達(dá)抗性基因。Q3:陽離子脂質(zhì)體試劑-DNA復(fù)合物沉淀。注意：在顯微靜下可以在細(xì)胞上觀察到 小的顆粒狀顆粒沉淀。這是正常的。此