第4講 細(xì)胞核移植

1、6.4細(xì)胞核移植細(xì)胞核移植（一）定義（一）定義細(xì)胞核移植（Cell nuclear transfer）是一種利用顯微操作技術(shù)將一種動(dòng)物的細(xì)胞核移入同種或異種動(dòng)物的去核成熟卵細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)。細(xì)胞核移植動(dòng)物培育是用特定發(fā)育階段的核供體及相應(yīng)的核受體（去核的卵子）體外構(gòu)建重組胚，通過(guò)胚胎移植達(dá)到擴(kuò)繁種群的目的。細(xì)胞核移植所得到的動(dòng)物為核質(zhì)雜種。克隆動(dòng)物克隆動(dòng)物生物的主要遺傳物質(zhì)存在于細(xì)胞核中，因此克隆動(dòng)物可以通過(guò)細(xì)胞核移植實(shí)現(xiàn)。與其他克隆的區(qū)別與其他克隆的區(qū)別克隆 (Clone)本意是指遺傳上完全相同的分子、細(xì)胞或來(lái)自同一生物個(gè)體的無(wú)性繁殖群體。廣義上的克隆包含有基因水平、細(xì)胞水平、胚胎水平、個(gè)體水平

2、上的復(fù)制。細(xì)胞工程的克隆克隆是指通過(guò)無(wú)性繁殖手段獲得遺傳背景相同的細(xì)胞群或個(gè)體的技術(shù)。通過(guò)植物組織培養(yǎng)再生植物屬于植物個(gè)體的克隆?？寺?dòng)物一般指采用核移植、胚胎移植技術(shù)得到的動(dòng)物。核移植主要包括胚胎細(xì)胞核移植和體細(xì)胞核移植。利用胚胎分割得到的動(dòng)物屬于廣義上的克隆動(dòng)物。（三）克隆動(dòng)物的發(fā)展歷史（三）克隆動(dòng)物的發(fā)展歷史1早在1892年，Driesch和Wilson就分別對(duì)海膽和文昌魚(yú)分離卵裂球的進(jìn)行了動(dòng)物克隆的嘗試。21938年，德國(guó)胚胎學(xué)家斯佩爾曼（Spemann）經(jīng)提出“分化細(xì)胞的核移入卵子中能否指導(dǎo)胚胎發(fā)育”這樣的設(shè)想，并在兩棲類(lèi)脊椎動(dòng)物進(jìn)行了克隆動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，由于當(dāng)時(shí)技術(shù)等方面的原因使他沒(méi)能找

3、到將細(xì)胞核導(dǎo)入卵細(xì)胞的方法。31952年Briggs和King成功地在豹蛙上獲得了胚胎細(xì)胞核移植后代。41980年中國(guó)將鯽魚(yú)胚胎細(xì)胞移入鯉魚(yú)去核的未受精卵中實(shí)現(xiàn)了不同種間的核質(zhì)雜交，成功地?zé)o性繁殖了“鯉鯽核魚(yú)”新品種。5-1984年，丹麥科學(xué)家斯丁維拉德森成功利用胚胎細(xì)胞克隆出一只綿羊，這是首次證實(shí)的通過(guò)核移植技術(shù)克隆哺乳動(dòng)物。證明胚胎細(xì)胞具有全能性。里程碑式的突破里程碑式的突破61997年，英格蘭愛(ài)丁堡羅斯林研究所和PPL制藥公司利用高度分化的綿羊乳腺上皮細(xì)胞，通過(guò)核移植克隆了一只雌性小綿羊多莉。這是第一個(gè)體細(xì)胞克隆動(dòng)物。 證明：成熟的體細(xì)胞也具有全能性。 （二）技術(shù)流程（二）技術(shù)流程細(xì)胞核

4、移植克隆動(dòng)物技術(shù)環(huán)節(jié)主要包括：核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備受體細(xì)胞的去核細(xì)胞核移植、激活重組胚的培養(yǎng)與移植核移植后代的鑒定。1核供體細(xì)胞獲得與取核供核細(xì)胞可以是動(dòng)物原代細(xì)胞或傳代細(xì)胞。分離制備單個(gè)動(dòng)物細(xì)胞，體外培養(yǎng)得到正常二倍體體細(xì)胞系，然后進(jìn)行15 天的缺血饑餓培養(yǎng)，誘使細(xì)胞處于“靜止”狀態(tài)（一般進(jìn)入G0 期）。采用細(xì)胞松弛素B（Cytochalasin B）誘發(fā)細(xì)胞排核或者顯微操作取核等方法得到細(xì)胞核。2受體細(xì)胞去核可以用微細(xì)玻璃管吸除第一極體及處于分裂中期的染色體和周?chē)牟糠旨?xì)胞質(zhì)。也用熒光染料Hoechst33342對(duì)卵細(xì)胞DNA進(jìn)行染色，在紫外觀察下去核可提高去核成功率。也可以使用Hoechst

5、33342與卵細(xì)胞DNA結(jié)合后，用紫外線定點(diǎn)照射使核功能喪失。3 細(xì)胞核移植細(xì)胞核移植可以采用胞質(zhì)內(nèi)注射和透明帶下注射方法。前者是用微吸管吸取供體核后，直接注射進(jìn)卵子細(xì)胞質(zhì)；后者是把細(xì)胞核注射進(jìn)透明帶和卵細(xì)胞間的卵周隙中。在細(xì)胞核移植時(shí)，供體和受體細(xì)胞周期的影響非常重要。處于G0/G1 的細(xì)胞為二倍體，會(huì)凝集成單個(gè)染色單體，處于G2 期的4倍體核會(huì)凝集成雙倍染色單體。處于活躍復(fù)制的核（S期）會(huì)形成典型的“粉末狀”形態(tài)，會(huì)引起DNA損傷。研究發(fā)現(xiàn)將G1期雙倍體核移入激活的MII期卵中獲得了較高的重構(gòu)胚發(fā)育幾率。4激活正常受精卵的發(fā)育啟動(dòng)和早期卵裂主要由卵母細(xì)胞胞質(zhì)中母源信息所控制，成熟的卵母細(xì)胞

6、質(zhì)能使移入的細(xì)胞核在形態(tài)上和功能上發(fā)生變化，從而導(dǎo)致供核回復(fù)到初始狀態(tài)，基因從頭開(kāi)始順序表達(dá)。重組胚的發(fā)育需要進(jìn)一步激活，可以采用電激活和化學(xué)激活方法。電激活是可把重組胚放在電融合槽兩極之間，用幾次瞬時(shí)直流脈沖刺激使其激活?；瘜W(xué)激活常用的激活劑包括乙醇、SrCl2、放線菌酮、離子霉素等。5重組胚培養(yǎng)和移植激活后的重組胚可以采用體內(nèi)和體外兩種培養(yǎng)方式。體內(nèi)培養(yǎng)是將重組胚植入同種或異種動(dòng)物的輸卵管中發(fā)育至囊胚或桑葚胚，然后進(jìn)行胚胎移植。體外培養(yǎng)是將重組胚在特定培養(yǎng)液中培養(yǎng)至囊胚，選擇優(yōu)質(zhì)胚胎移入同種的同期發(fā)情的受體中繼續(xù)發(fā)育。6體細(xì)胞核移植后代的鑒定對(duì)于體細(xì)胞核移植培育的動(dòng)物，可以從形態(tài)性別上鑒定

7、，還可以采用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定。（三）胚胎細(xì)胞克隆動(dòng)物（三）胚胎細(xì)胞克隆動(dòng)物（四）（四）體細(xì)胞克隆動(dòng)物體細(xì)胞克隆動(dòng)物（1）定義）定義體細(xì)胞克隆體細(xì)胞克隆技術(shù)是將動(dòng)物體細(xì)胞經(jīng)過(guò)抑制培養(yǎng)使其處于休眠狀態(tài)，利用細(xì)胞核移植技術(shù)將其導(dǎo)入去核卵母細(xì)胞，培育成早期胚胎，將胚胎移植至受體，妊娠產(chǎn)仔培育出與核供體一樣的成體動(dòng)物的一種細(xì)胞工程技術(shù)。 （2）意義問(wèn)題思考：?jiǎn)栴}思考：A-理論價(jià)值理論價(jià)值：高度分化的高度分化的體細(xì)胞具有全能性B-實(shí)踐意義實(shí)踐意義：由于體細(xì)胞數(shù)量豐富并且易于獲得，因此體細(xì)胞克隆動(dòng)物技術(shù)在加快珍稀動(dòng)物繁殖，搶救瀕危動(dòng)物（如大熊貓）方面意義重大?？梢杂没颊弑救思?xì)胞培育出新組織。（3）基本過(guò)程

8、）基本過(guò)程核供體動(dòng)物的選擇與細(xì)胞核的獲得。核受體動(dòng)物的選擇與細(xì)胞核的移出。供體核的移入及原核的取出。胚泡的體外試管培養(yǎng)。代母的選擇與胚泡移入子宮。克隆動(dòng)物的體內(nèi)發(fā)育與出生。應(yīng)用舉例應(yīng)用舉例多莉羊多莉羊技術(shù)路線：技術(shù)路線：具體步驟具體步驟1-供核細(xì)胞獲得與取核供核細(xì)胞獲得與取核取一只6歲已妊娠到后期的白色的芬蘭多特西母羊的乳腺組織，酶消化分解成單個(gè)細(xì)胞，將這些細(xì)胞平鋪在新鮮的細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)層（滋養(yǎng)層）上培養(yǎng)7天，將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)移到卻乏營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)傳代，其培養(yǎng)基的胎牛血清濃度從10%下降至0.5%，這樣使細(xì)胞停在休止期（G0） 。（傳到7-9代時(shí)，供體細(xì)胞可停在休止期，此時(shí)細(xì)胞染色體為54個(gè)，是二倍

9、體）。在倒置顯微鏡下，用顯微吸管將核吸出。2-卵母細(xì)胞收集與去核卵母細(xì)胞收集與去核受體卵細(xì)胞來(lái)自于蘇格蘭黑綿養(yǎng)，在注射促性腺釋放素(GnRH)28-33h時(shí)，收集卵細(xì)胞。在倒置顯微鏡的視野下用顯微吸管刺入，吸取中期染色體和少量細(xì)胞質(zhì)。去核后卵細(xì)胞放在無(wú)鈣鎂，但含有1%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液中復(fù)原，然后轉(zhuǎn)移到37度無(wú)鈣、但含有10%的胎牛血清的M2培養(yǎng)液中保存?zhèn)溆谩?-3-細(xì)胞核融入卵細(xì)胞細(xì)胞核融入卵細(xì)胞將核和已去核卵細(xì)胞放入同一培養(yǎng)皿中，在交變脈沖電壓為3伏的電場(chǎng)中融合5分鐘，再用1.25千伏/厘米，80微秒，直流電脈沖3次，將乳腺細(xì)胞核融入卵中形成一個(gè)含有新遺傳物質(zhì)的卵細(xì)胞，稱之為重構(gòu)胚。4

10、-重構(gòu)胚的培養(yǎng)將重構(gòu)胚種植在綿羊結(jié)扎的輸卵管中培養(yǎng)，大約培養(yǎng)6天后，大多數(shù)胚胎發(fā)育到桑椹期或囊胚期（816個(gè)細(xì)胞）。再選擇發(fā)育優(yōu)良的重構(gòu)胚移植到蘇格蘭黑綿羊的子宮中，每只受體母羊移植1-3個(gè)重構(gòu)胚。5-妊娠監(jiān)護(hù)妊娠60天時(shí)用超聲波診斷妊娠。每?jī)芍苓M(jìn)行一次全方位監(jiān)護(hù)胎兒發(fā)育。分娩時(shí)由獸醫(yī)外科醫(yī)生助產(chǎn)。產(chǎn)下多莉即為6歲母羊的復(fù)制品，也為白色。人類(lèi)胚胎克隆與克隆人人類(lèi)胚胎克隆與克隆人2001年研究人員將一枚卵細(xì)胞中的DNA全部剔除，然后用一枚成年人皮膚細(xì)胞中的細(xì)胞核替代上述DNA，得到3個(gè)早期胚胎，其中兩個(gè)發(fā)育到4細(xì)胞階段，另一個(gè)至少發(fā)育到6細(xì)胞階段。證明人體單個(gè)細(xì)胞的遺傳物質(zhì)能被誘導(dǎo)發(fā)育成為幼胚胎

11、，因此這項(xiàng)研究被認(rèn)為是向著克隆人的方向邁出了關(guān)鍵一步。克隆人？克隆人？布瓦瑟利耶安蒂諾里克隆引起的倫理學(xué)問(wèn)題討論討論題：討論題：1-動(dòng)物可以無(wú)休止地被克隆嗎？動(dòng)物可以無(wú)休止地被克隆嗎？2-你是否同意生殖性克?。繜o(wú)性生殖是否是你是否同意生殖性克??？無(wú)性生殖是否是人類(lèi)的倒退？人類(lèi)的倒退？3-英雄、偉人可以通過(guò)克隆再生嗎？英雄、偉人可以通過(guò)克隆再生嗎？問(wèn)題1：克隆羊多莉剛出生時(shí)，它的染色體顯示已經(jīng)有好幾歲了。2003年它已經(jīng)永遠(yuǎn)離開(kāi)了我們。6歲。供體6歲。蘇格蘭羅斯林研究院的科學(xué)家們對(duì)多莉的染色體做了仔細(xì)的研究，發(fā)現(xiàn)其染色體末端端粒比同齡的普通綿羊短。端粒是決定細(xì)胞老化的主要因素，端粒越短的細(xì)胞越接

12、近死亡。變短的端粒或許表明遺傳的藍(lán)本會(huì)隨著時(shí)間流逝而老化，無(wú)休止地克隆一個(gè)動(dòng)物是不可能的。關(guān)于端粒關(guān)于端粒每一條染色體的末端都有特殊的結(jié)構(gòu)叫端粒(telomere)。每一個(gè)端粒都含有一系列的短的正向重復(fù)順序。在細(xì)胞中，端?？偸呛鸵恍┓墙M蛋白相結(jié)合，形成復(fù)合體。它可以保持染色體的穩(wěn)定性，丟失了端粒的染色體很容易和別的染色體相接形成雙著絲粒染色體或自身首尾相聯(lián)形成環(huán)狀染色體，前者在減數(shù)分裂后期會(huì)產(chǎn)生染色體橋(chromosome bridge)，最終引起染色體的重復(fù)與缺失。生殖細(xì)胞可以重建與延長(zhǎng)端粒的DNA；而體細(xì)胞則隨著復(fù)制次數(shù)的增加端粒DNA會(huì)逐漸縮短。Harley等（1989年）用人的端粒重

13、復(fù)片段為探針對(duì)胎兒、新生兒、青年和老年人的細(xì)胞株的端粒長(zhǎng)度進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增加，人成纖維細(xì)胞端粒的長(zhǎng)度不斷下降。因此端粒DNA可能決定了細(xì)胞的壽命，并與細(xì)胞的自然凋亡與癌變密切相關(guān)。1990年Harely等則認(rèn)為端粒的長(zhǎng)度可反映細(xì)胞有絲分裂的次數(shù)。端粒象是細(xì)胞分裂的“計(jì)數(shù)器”。問(wèn)題2：許多國(guó)家出臺(tái)法律禁止生殖性克隆。有性生殖是歷史進(jìn)化的結(jié)果，利于種族繁衍和生存，以及優(yōu)良性狀的形成。選擇無(wú)性生殖克隆的方式不利于遺傳多樣性的保護(hù)。從有性繁殖到無(wú)性繁殖，就進(jìn)化而言是一種退化?？寺?dòng)物存在的問(wèn)題克隆動(dòng)物存在的問(wèn)題1） 技術(shù)尚不成熟技術(shù)尚不成熟得到的克隆動(dòng)物具有極大的偶然性和隨機(jī)性。迄今為止，

14、克隆試驗(yàn)的成功率始終很低。例如，在培育多莉的過(guò)程中，科學(xué)家共克隆出個(gè)綿羊胚胎，最終成功使母羊受孕并生產(chǎn)的只有多莉一個(gè)。目前，多莉羊的制備還不能重復(fù)，更不能肯定克隆多莉羊的方法也適用于其它動(dòng)物或其它不同組織器官的細(xì)胞。2） 遺傳、疾病問(wèn)題 克隆動(dòng)物夭折率高，不少克隆動(dòng)物天生患有疾病或體形過(guò)大?？寺⊙蚝涂寺∨６加畜w形過(guò)度龐大的問(wèn)題。該缺陷在克隆鼠身上也存在?？寺∨！⒀?、豬都存在發(fā)育不良、免疫系統(tǒng) 缺陷和心肺功能不健全的問(wèn)題?？寺?dòng)物沒(méi)有遺傳物質(zhì)的交流和互補(bǔ)，將會(huì)加劇一些遺傳疾病的發(fā)生。 3） 克隆人帶來(lái)的社會(huì)、倫理學(xué)問(wèn)題父子？兄弟？母親？歸屬感？人的唯一性問(wèn)題。犯罪問(wèn)題我是誰(shuí)？“多利羊”制造者反對(duì)克隆人伊斯維姆伊斯維姆.穆特穆特“我認(rèn)為，已經(jīng)有足夠的證據(jù)表明，克隆人的行動(dòng)是完全不負(fù)責(zé)