蛋白質(zhì)研究的基本實(shí)驗(yàn)方法

1、蛋白質(zhì)研究的基本實(shí)驗(yàn)方法南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室鄒惟瑩實(shí)驗(yàn)研究三個水平n整體水平：動物模型n細(xì)胞水平：形態(tài)、功能n分子水平：基因、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的調(diào)控n基因序列的變化：ErbB2n染色質(zhì)水平上基因活化的調(diào)節(jié)： 染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)（對核酸酶的敏感程度增加） 組蛋白的甲基化（H3-K9 基因沉默，H3-K4 基因活化） 組蛋白的乙酰化 DNA的甲基化（5%C 甲基化 m5C； 5端CpG ）蛋白質(zhì)的調(diào)控n轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控 順式作用元件，反式作用因子（轉(zhuǎn)錄因子）n轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控n翻譯水平的調(diào)控n翻譯后調(diào)控 磷酸化、糖基化、泛素化n定位蛋白質(zhì)調(diào)控的研究nQualitative model (cyclins)n

2、Quantitative model (CDK)蛋白質(zhì)研究的基本方法n免疫印跡（Western Blot）n免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）n染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）Western Blotn免疫印跡（蛋白質(zhì)印跡） 是一種借助特異性抗體鑒定抗原的有效方法。 是在凝膠電泳（高分辨率）和固相免疫測定技術(shù)（高特異性，高靈敏性）基礎(chǔ)上發(fā)展而來。Western BlotWestern BlotnA. Sample preparationnB. ElectrophoresisnC. Transfer of proteins and staining (Western blot

3、ting)蛋白裂解液的制備n組織樣品組織樣品：取適量（約100mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品，加1ml 含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑），勻漿后抽提總蛋白（或核蛋白）。n細(xì)胞樣品細(xì)胞樣品：每份樣品取11061107 細(xì)胞，PBS 清洗細(xì)胞，去PBS，加0.1ml1ml 含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑）抽提總蛋白（或核蛋白）。蛋白裂解液的制備蛋白裂解液的制備nRIPA Buffer： 裂解液和細(xì)胞應(yīng)充分接觸，RIPA buffer足量。RIPA裂解液中蛋白樣品含有較高濃度的去垢劑，不能用Bradford法但可用BCA法測定蛋白濃度。蛋白裂解液的制備n當(dāng)

4、細(xì)胞破碎的時候，蛋白水解酶就會被釋放出來或被激活。為了避免這些情況的出現(xiàn)，在樣品制備時盡可能在低溫下進(jìn)行。但是有些蛋白酶在上述條件下仍然保持著活性，此時應(yīng)當(dāng)使用蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑。nWestern Blot 臨用前可新鮮加入最終濃度為1mM的 PMSF（苯甲基磺酰氟）。nCo-IP 蛋白酶抑制劑：胃蛋白酶抑制劑(pepstantin)、亮抑蛋白酶肽(leupeptin)、胰蛋白酶抑制劑(aprotinin)等；能夠強(qiáng)烈抑制所有蛋白酶的活性（如絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、金屬蛋白酶、酸性蛋白酶）。蛋白裂解液的制備n組織細(xì)胞裂解過程中釋放大量內(nèi)源性蛋白磷酸酶，以各種方式催化磷酸化蛋白的去磷酸化

5、。nWestern Blot和免疫共沉淀檢測磷酸化蛋白質(zhì)、蛋白激酶活性測定，抑制磷酸化蛋白質(zhì)去磷酸化，維護(hù)蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)。nNa3VO4、NaFn蛋白磷酸酶抑制劑蛋白磷酸酶抑制劑：特異性抑制某一種或幾種蛋白磷酸酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以強(qiáng)烈?guī)缀跛兄匾牡鞍琢姿崦富钚裕ǖ鞍捉z/蘇氨酸磷酸酶(PP1、PP2A、PP2B、PP2C)、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶等。蛋白質(zhì)定量n直接紫外吸收法 含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸 280nm附近的紫外吸收峰 測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì) 嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物質(zhì)干擾 適合于與色譜柱聯(lián)用，達(dá)到實(shí)時監(jiān)控，較

6、不準(zhǔn)確n比色測定法蛋白質(zhì)定量n比色測定法 在典型的蛋白測定中，化學(xué)試劑加入到蛋白樣品溶液里產(chǎn)生顏色變化，這一變化可由分光光度計或酶標(biāo)儀檢測，并與已知濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線作比較。nBradford法 蛋白質(zhì)與染料考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合 最大吸收峰從465nm變?yōu)?95nm 在一定的線性范圍內(nèi)，反應(yīng)液595nm處吸光度的變化量與反應(yīng)蛋白量成正比 不能含有太高濃度的去污劑，對樣品的要求較高。蛋白質(zhì)定量nLorry法 蛋白質(zhì)與堿性銅溶液中的Cu2+絡(luò)和使肽鍵伸展，暴露出酪氨酸和色氨酸，在堿性銅條件下與福林試劑反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色，在一定濃度范圍內(nèi)，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由于各種

7、蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在測定時需使用同種蛋白質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)。Lorry法進(jìn)行了改良蛋白質(zhì)定量nBicinchoninic acid (BCA )法 近來廣為應(yīng)用的蛋白定量方法。 原理與Lowery法蛋白定量相似，即在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合并將Cu2+還原成Cu1+。BCA與 Cu1+結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在562 nM處有高的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比。 靈敏度高，操作簡單，試劑及其形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性俱佳，并且受干擾物質(zhì)影響小。 BCA法的顯著優(yōu)點(diǎn)是不受去垢劑的影響。蛋白質(zhì)定量n繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別取一定體積的濃度為2mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液，加PBS溶液至

8、20ul配成如下濃度梯度的BSA溶液:0m g/ml、0.015625mg/ml、0.03125mg/ml、0.0625mg/ml、0.125mg/ml、0. 25 mg/ml、0.5 mg/ml、1mg/ml、2 mg/ml。樣品(樣品BSA溶液或蛋白質(zhì)溶液)與PBS共25ul（0.1ml）加樣，最后每孔均加200ul（2ml）工作液（BCA：Cu 50：1 嫩綠色）混勻，37 C孵育30 min, 冷卻到室溫后，酶標(biāo)儀上562 nm處讀數(shù)。Western Blot蛋白免疫印跡（Immunoblotting） n凝膠電泳（SDS -聚丙烯酰胺凝膠）n樣品的印跡（蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移固相支持物：硝酸纖維

9、素膜（NC 膜）和PVDF 膜）n免疫學(xué)檢測（用特異性的抗體檢測所要研究的相應(yīng)抗原）SDS-PAGESDS-PAGE原理原理n蛋白質(zhì)中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同的蛋白在不同的pH值下表現(xiàn)出不同的電荷。n為了使蛋白在電泳中的遷移率只與分子量有關(guān)，我們在上樣前，通常會進(jìn)行一些處理(上樣緩沖液)。即在樣品中加入含有SDS 和-巰基乙醇的上樣緩沖液。SDS-PAGEnSDS 即十二烷基磺酸鈉（CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na）：一種陰離子表面活性劑，它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結(jié)構(gòu)。n -巰基乙醇：強(qiáng)還原劑，它可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵。S

10、DS-PAGEn溴酚藍(lán)染料：用于監(jiān)控整個電泳過程。n蔗糖或甘油：增大溶液密度，使加樣時樣品溶液可以快速沉入樣品凹槽底部。n高溫處理，其目的是將SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，以使蛋白質(zhì)完全變性和解聚，并形成棒狀結(jié)構(gòu)同時使整個蛋白帶上負(fù)電荷。SDS-PAGEn1xSample buffer: 60mM Tris-Cl pH 6.8 2% SDS（心臟，肌肉5%） 10% glycerol 0.01% Bromophenol blue 1.5% 2-mercaptoethanol SDS-PAGE SampleSDS-PAGEnpH 不連續(xù)和膠孔徑大小不連續(xù)n電泳啟動時，蛋白樣品處于pH6.8 的上層（孔

11、徑大），pH8.8 的分離膠層在下層（孔徑?。?，上槽為負(fù)極，下槽為正極。SDS-PAGEnPAGE 膠的聚合原理：甲叉雙丙烯酰胺和丙烯酰胺在過硫酸胺的作用下聚合，形成膠。SDS-PAGEn在濃縮膠運(yùn)動中，Cl解離度大，Pro解離度居中，甘aaCOO解離度小，遷移順序?yàn)椋≒H6.8）Cl Pro COO，一個Cl領(lǐng)路，COO推動，蛋白在中間，這樣就起到濃縮的作用了。n由于膠聯(lián)度小，孔徑大，Pro受阻小，因此不同的蛋白質(zhì)就濃縮到分離膠之上成層，起濃縮效應(yīng)，使全部蛋白質(zhì)處于同一起跑線上。n當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)進(jìn)入分離膠時，此時Pro，Cl，甘aa 離子在PH8.8 的溶液中，Cl完全電離而很快到達(dá)正極，甘aa

12、電離度加大很快躍過蛋白質(zhì)，而到達(dá)正極，只有蛋白質(zhì)分子在分離膠中較為緩慢的移動。SDS-PAGEn由于Pro在電泳過程中，帶負(fù)電荷多者遷移快，反之則慢，這就現(xiàn)了電荷效應(yīng)電荷效應(yīng)。由于膠孔徑小，而且成為一個整體的篩狀結(jié)構(gòu)，它們對大分子阻力大，小分子阻力小，起著分子篩分子篩效應(yīng)，也就是蛋白質(zhì)在分離膠中，以分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)而出現(xiàn)遷移率的差異，最終達(dá)到彼此分開。SDS-PAGESDS-PAGEn催化劑：過硫酸銨（AP）在隔氧的狀態(tài)下，最好現(xiàn)配現(xiàn)用，使用新鮮的。n加速催化劑：TEMED，四甲基乙二胺。催化劑的作用是使單體聚合成網(wǎng)狀聚合物。SDS-PAGESDS-PAGEn上樣量：總蛋白量 20-50u

13、g（上樣量過多使電泳條帶變形）n70V，30min；110V，與待分離樣品靶蛋白分子量相適應(yīng)。SDS-PAGE Electrophoresis轉(zhuǎn)膜（電轉(zhuǎn)移）n印跡中常用的固相材料有NC 膜、尼龍膜、PVDF 等。nPVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理強(qiáng)度，以及具有更好的化學(xué)兼容性。n有兩種規(guī)格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2um for MW20kDa)。轉(zhuǎn)膜nNC膜及濾紙的預(yù)處理： 剪裁與膠大小一致的NC膜，將其浸入1轉(zhuǎn)移緩沖液平衡5分鐘以上。（注意：必須保證NC膜始終完全浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中）nPVDF 膜的預(yù)處理： 剪裁與膠大小一致

14、的膜泡入甲醇中，約1-2 分鐘。將其浸入1轉(zhuǎn)移緩沖液平衡5分鐘以上。轉(zhuǎn)膜n緩沖液通過凝膠時會將蛋白質(zhì)帶到硝酸纖維素（或PVDF）膜上，膜可以與蛋白質(zhì)通過疏水相互作用產(chǎn)生不可逆的結(jié)合。n有孔的塑料和有機(jī)玻璃板將凝膠和硝酸纖維素膜夾成三明治形狀，而后浸入兩個平行電極中間的緩沖液中進(jìn)行電泳，選擇適當(dāng)?shù)碾娪痉较蚓涂梢允沟鞍踪|(zhì)離開凝膠結(jié)合在硝酸纖維素（或PVDF）膜上。轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜n電流1mA-2mA/cm2，我們通常200mA-350mA，按照目的蛋白分子大小、膠濃度選擇轉(zhuǎn)移時間Western BlotWestern Blotn封閉（2h）：用蛋白溶液（如5的脫脂奶粉或BSA）處理以封閉硝酸纖維素（或PV

15、DF）膜上剩余的疏水結(jié)合位點(diǎn)。（先用0.2-0.5%麗春紅預(yù)染）n一抗（過夜或2h）：只有待研究的蛋白質(zhì)與一抗結(jié)合，而其它蛋白質(zhì)不與一抗結(jié)合，這樣清洗去除未結(jié)合的一抗后，印跡中只有待研究的蛋白質(zhì)的位置上結(jié)合著一抗。（反貼法）Western BlotWestern Blotn二抗（1h）：帶有標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質(zhì)的位置。n最常用的一種是酶連的二抗，印跡用酶連二抗處理后，再用適當(dāng)?shù)牡孜锶芤禾幚?，?dāng)酶純化底物生成有顏色的產(chǎn)物時，就會產(chǎn)生可見的區(qū)帶，指示所要研究的蛋白質(zhì)的位置。eg：辣根過氧化物酶；堿性磷酸酶Western Blotn檢測辣根過氧化物酶的方法n增

16、強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL；2min） 辣根過氧化物酶在H2O2 存在下，氧化化學(xué)發(fā)光物質(zhì)魯米諾（luminol，氨基苯二酰一肼）并發(fā)光，在化學(xué)增強(qiáng)劑存在下光強(qiáng)度可以增大1000 倍，通過將印跡放在照相底片上感光就可以檢測辣根過氧化物酶的存在。Western Blot 必需要內(nèi)參！必需要內(nèi)參！Western Blotn一、二抗的選擇及比例n凝膠質(zhì)量（氣泡，脆）n電轉(zhuǎn)方向，氣泡，電流電壓，溫度nNC Tween200.3%n洗膜免疫共沉淀（co-IP）n免疫沉淀(IP) 利用抗原抗體特異性結(jié)合的特性，將抗原（靶蛋白）從混合體系沉淀下來，初步分離靶蛋白的一種方法。n免疫共沉淀(co-IP) 在體外探測2個蛋白質(zhì)分子之間是否存在特異性相互作用的一種方法。免疫共沉淀n原理 如果2個蛋白質(zhì)分子能夠發(fā)生特異性相互作用，當(dāng)用一種蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行免疫沉淀，另一個蛋白質(zhì)也會同時被沉淀下來。 抗原-抗體的免疫反應(yīng)免疫共沉淀n抗體的選擇 多克隆抗體：多位點(diǎn)結(jié)合，抗原抗體復(fù)合物 穩(wěn)定；廣泛，假陽性 單克隆抗體：單一結(jié)合特異性，相同靶蛋白 的不同修飾；非特異性少，交 叉反應(yīng)免疫共沉