綜述細(xì)菌原生質(zhì)體融合進(jìn)展

1、綜述細(xì)菌原生質(zhì)體融合進(jìn)展 馮丹 10級(jí) 杏壇生工 202112401007摘要：原生質(zhì)體融合技術(shù)由于可以在種間、屬間及科之間構(gòu)建出新型菌株，已成為一項(xiàng)公認(rèn)的快速組裝新物種，尤其是微生物新物種的基因工程技術(shù)。在細(xì)菌、酵母菌、真菌等遺傳育種方面被廣泛應(yīng)用。文中綜述并舉例說(shuō)明原生質(zhì)體的制備與再生技術(shù)與影響因素、原生質(zhì)體形成率及原生質(zhì)體融合條件。介紹了細(xì)菌原生質(zhì)體融合技術(shù)在遺傳育種中的應(yīng)用，并展望了細(xì)菌原生質(zhì)體融合技術(shù)的開展前景。關(guān)鍵詞：原生質(zhì)體融合；原生質(zhì)體制備；融合條件；融合子 細(xì)菌原生質(zhì)體融合(bacterial protoplast fusion)是20世紀(jì)70年代開展起來(lái)的重要基因重組技術(shù)。

2、1976年FODORK等【l】采用聚乙二醇(PEG)、磷酸鈣誘導(dǎo)巨大芽孢桿菌(Bacillusmegateriutrb原生質(zhì)體的融合，SCHAEFFER P等【2】翻報(bào)道了用PEG誘導(dǎo)枯草芽孢桿菌(Bsubtillis)的原生質(zhì)體融合，這2項(xiàng)重要研究成果同時(shí)發(fā)表在美國(guó)科學(xué)院院報(bào)上，是細(xì)菌原生質(zhì)體融合技術(shù)開展的里程碑。細(xì)菌原生質(zhì)體融合育種技術(shù)不但可以改進(jìn)菌種遺傳性狀、提高有用代謝產(chǎn)物產(chǎn)量，還可以綜合不同菌株代謝特征，產(chǎn)生新的有用代謝產(chǎn)物，在工業(yè)生產(chǎn)和遺傳育種上展示出美好的應(yīng)用前景。1細(xì)菌原生質(zhì)體制備和再生11細(xì)菌原生質(zhì)體制備制備細(xì)菌原生質(zhì)體，是進(jìn)行原生質(zhì)體融合的前提和根底，不同細(xì)菌細(xì)胞壁組成各不

3、相同，所以制備原生質(zhì)體最正確條件也存在著很大差異。在制備細(xì)菌原生質(zhì)體時(shí)，曾采用過(guò)機(jī)械法脫壁，但原生質(zhì)體制備數(shù)量有限而且容易使原生質(zhì)體受到損傷，不利于再生。目前主要使用酶法脫壁，絕大多數(shù)細(xì)菌使用溶菌酶作為工具酶，但也有例外，YOSHINO S等舊制備糖丁醇乙酸梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)原生質(zhì)體時(shí)，除使用溶菌酶外，還使用了N乙酰胞壁酸L丙氨酸酰胺酶；張莉滟等【3】制備長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobactefium longum)原生質(zhì)體時(shí)，使用5mgL的變?nèi)芫?Mutanolysil進(jìn)行菌體脫壁。而且使用的最適溶菌酶濃度為01mgml_2Om

4、gmL。12細(xì)菌原生質(zhì)體再生酶解脫壁后的原生質(zhì)體應(yīng)該具有再生能力，這是原生質(zhì)體融合育種的必要條件。細(xì)菌原生質(zhì)體再生包括壁再生、功能修復(fù)、分裂和萌發(fā)這些相互聯(lián)系而又具有一定獨(dú)立性的生理過(guò)程。盡管原生質(zhì)體具有生物活性，但它不是正常細(xì)胞，在普通培養(yǎng)基平板上不能正常的生長(zhǎng)、繁殖。影響原生質(zhì)體再生的因素主要有菌種本身特性、原生質(zhì)體制備條件、再生條件和操作方式等，尤其是原生質(zhì)體制備時(shí)酶濃度和酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體再生的影響較大，酶濃度過(guò)大、酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)那么再生率降低。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌在原生質(zhì)體再生過(guò)程中能明顯提高再生率。(1) 原生質(zhì)體形成率P=經(jīng)酶處理后形成的原生質(zhì)體數(shù)未經(jīng)酶處理的總菌落數(shù)*100%(2) 原

5、生質(zhì)體再生率Rp =(能再生的原生質(zhì)體數(shù)經(jīng)酶處理后形成的原生質(zhì)體數(shù))*100%1.21以蘇云芽孢桿菌為例論述影響原生質(zhì)體形成率與再生率的因素青霉素對(duì)原生質(zhì)體形成率(P)的影響裹1 青霉素濃度對(duì)破璧效果的影響青霉素濃度u*ml-1 1*(%) 2*% 00.40.81.21.62.02.42846504742403630586765575048裹2 青霉素參加時(shí)間對(duì)破壁效果的影響參加時(shí)間h 1*(%) 2*% 12345600434650410056636759注：1、 時(shí)間從菌種接人培養(yǎng)基算起2、因青霉素的抑制，菌體未生長(zhǎng)。由表1，表2的結(jié)果可知，青霉紊對(duì)Bt的原生質(zhì)體形成有明顯的促進(jìn)作用，且

6、參加時(shí)間以5 h時(shí)為好。此時(shí)剛剛進(jìn)入對(duì)數(shù)期，細(xì)胞處于生長(zhǎng)繁殖最旺盛的時(shí)期，大量細(xì)胞壁物質(zhì)被合成，這時(shí)參加青霉素可在對(duì)數(shù)期后期獲得大量的細(xì)胞壁有缺陷但仍具活力的細(xì)胞，增加了苗體對(duì)溶菌酶的敏感性，可獲得較高的原生質(zhì)體形成率。由結(jié)果可知，青霉素濃度以08 umL，參加時(shí)間以5 h時(shí)為最正確?！?】22 菌齡對(duì)原生質(zhì)體形成率P)及再生率(Rp )的影響表3 菌齡對(duì)原生質(zhì)體形成率P )及再生率( Rp)的影響菌齡1*P%1*(Rp)%2*(P)%2*(Rp)%對(duì)數(shù)期前期6h64107512對(duì)數(shù)期中后期10h60137215穩(wěn)定期13h222248表3顯示1 ，2 的對(duì)數(shù)期菌體比穩(wěn)定期的易于破壁，這是因?yàn)?/p>

7、穩(wěn)定期產(chǎn)生大量芽孢，其胞壁結(jié)構(gòu)要比營(yíng)養(yǎng)體結(jié)實(shí)，也較復(fù)雜，因此釋放原生質(zhì)體較困難。我們選擇對(duì)數(shù)期中后期的菌體來(lái)制備原生質(zhì)體，是因?yàn)檫@一時(shí)期的原生質(zhì)體再生率高。1.22再生培養(yǎng)基是原生質(zhì)體進(jìn)行再生的最重要外界因素之一。細(xì)菌再生培養(yǎng)基中常補(bǔ)加2類物質(zhì)，一類是水解酪蛋白、血清血蛋白、氨基酸和琥珀酸鈉等營(yíng)養(yǎng)因子；另一類是滲透壓穩(wěn)定劑，包括KC1、NaC1、CaC12、MgCh等無(wú)機(jī)物質(zhì)和蔗糖、山梨醇、甘露醇、肌醇和琥珀酸鈉等有機(jī)物質(zhì)。OKAMOTO T等【5】研究乳鏈球菌(Streptococcus lactis)原生質(zhì)體再生時(shí)發(fā)現(xiàn)Ca2+、M 的存在可以顯著提高原生質(zhì)體的再生率，Ca、M 對(duì)維持原生質(zhì)

8、體穩(wěn)定性具有一定作用。1.23細(xì)菌原生質(zhì)體再生時(shí)的培養(yǎng)方式也會(huì)對(duì)再生率產(chǎn)生影響。固體培養(yǎng)法比液體培養(yǎng)法明顯有利于細(xì)菌原生質(zhì)體再生，并且雙層平板法培養(yǎng)的再生率高于單層平板培養(yǎng)的再生率。再生培養(yǎng)基上的菌體密度也不能過(guò)高，否那么先長(zhǎng)出的菌落會(huì)覆蓋后生長(zhǎng)的菌落，一般認(rèn)為原生質(zhì)體數(shù)量級(jí)在10s時(shí)，再生平板上的原生質(zhì)體才能呈現(xiàn)良好的別離狀態(tài)【6】1.24細(xì)菌原生質(zhì)體制備時(shí)，還受其他因素的影響。如酶解pH值一般為75左右；酶解時(shí)間從20min-10h都有報(bào)道；酶解溫度多采用3537或42；同無(wú)機(jī)滲透壓穩(wěn)定劑相比，05molL蔗糖或05molL甘露醇作滲透壓穩(wěn)定劑制備率更高；另外，菌體預(yù)處理、鰲合劑的使用、培

9、養(yǎng)方式等都會(huì)影響細(xì)菌原生質(zhì)體制備率。2.親本菌株的選擇進(jìn)行細(xì)菌原生質(zhì)體融合的最終目的就是要獲得遺傳穩(wěn)定的融合子，合理的親本菌株的選擇性遺傳標(biāo)記是篩選融合子的前提，是細(xì)菌原生質(zhì)體融合技術(shù)得以應(yīng)用的關(guān)鍵。在細(xì)菌原生質(zhì)體融合過(guò)程中，營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記【7】、抗藥性標(biāo)記【8】、熒光染色標(biāo)記【9】、滅活標(biāo)記【10】、形態(tài)標(biāo)記【11】等被經(jīng)常采用。3. 細(xì)菌原生質(zhì)體融合技術(shù)細(xì)菌原生質(zhì)體融合技術(shù)是親株細(xì)胞被酶解脫壁形成原生質(zhì)體后，在高滲條件下混合并參加化學(xué)或物理助融條件，使雙親株原生質(zhì)體相互凝集，通過(guò)質(zhì)融合、核融合、基因組間的交換、重組，進(jìn)而在適宜條件下再生出細(xì)菌細(xì)胞壁、獲得重組子的過(guò)程。31誘導(dǎo)融合的方式原生

10、質(zhì)體融合研究早期曾用過(guò)離心方法，使原生質(zhì)體緊密接觸或在冷的滲透穩(wěn)定液中凝集融合。目前除經(jīng)常使用的化學(xué)融合劑聚乙二醇【12】外，電場(chǎng)誘導(dǎo)與激光誘導(dǎo)方法【13】也被廣泛地應(yīng)用。32原生質(zhì)體融合及融合子的檢出參照梁平顏等【14】的方法進(jìn)行,融合頻率F=融合平板菌落數(shù)-雙親存活菌落數(shù)雙親株原生質(zhì)體總數(shù)*100%融合子的檢出：在原代融合平板上參加2種抗生素，可以保證生長(zhǎng)的菌或者是形成雜合雙倍體或單倍重組體的真正融合，或者是形成異核體的暫時(shí)融合，因此，對(duì)這些菌在進(jìn)行連續(xù)傳代10 次后，不回復(fù)的可以認(rèn)為是真正的融合子。參考文獻(xiàn)：1FODOR K，ALFOLDI LFuon of protoplasts of

11、 Bacillus megateriumJProcNaAcad SciUSA，1976，73(6)：214721502SCHAEFFER P，CAMI B，HOTCHKISS R DFusion ofbacterial protoplastsJ】Proc Natl Acad Sci US 1976，73(6)：215 1-21553張莉滟，黃勇，張德純雙歧桿菌原生質(zhì)體的制備與回復(fù)研究【J】微生物學(xué)雜志，2004，24(2)：24-26。4 10陳五嶺張芳琳 景建洲 孫連魁等滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)選育蘇云金桿菌新菌種5OKAMOTO FUJITA Y，IRIE R Protoplast forma

12、tion and regenerationofStreptococcuslactis cellsJ，AgricBoilChem，1983，47(2)：259-2636 8金玉娟，劉自镕，任建平芽孢桿菌和歐文氏菌的原生質(zhì)體融合的研究 微生物學(xué)雜志，2002，22G)：10117DAI M H，ZIESMAN S，RATCLIFFE T，et a1Visualization ofprotoplastfusion and quantitation ofrecombination in fused protoplasts ofauxotrophic strains ofEscherichia coli

13、JMetab Eng，2005，7(1)：5-529黎永學(xué)，張德純，李代昆雙歧桿菌和釀酒酵母原生質(zhì)體融合子篩選方法的探討J食品科學(xué)，2006，27(2)：848611CHEN OHMIYA K SHIMIZU S Intergeneric protoplast fusion bet-weellFusobacteum vanum an dEnterococcusfaecium forenhancingdehydrodivanillin degradationJAppl Environ Mierobiol，1 987，53(3)：54254812KAOKN，MICHAYLUKM RA method for High-frequency intergenericfusion ofplantprotoplastsJ，Planta，1974，