質(zhì)譜技術(shù)在臨床微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用

1、（一）、現(xiàn)代感染性疾病和（一）、現(xiàn)代感染性疾病和 臨床微生物檢測現(xiàn)狀臨床微生物檢測現(xiàn)狀耐藥耐藥菌株菌株增多增多疑難疑難菌株菌株增多增多現(xiàn)代感現(xiàn)代感染性疾染性疾病新特病新特點(diǎn)點(diǎn)條件致條件致病菌增病菌增多多人員人員少、少、鑒定鑒定速度速度較慢較慢感染感染菌種菌種類增類增多多臨床微生物當(dāng)前現(xiàn)狀病原病原生長時(shí)間生長時(shí)間報(bào)告時(shí)間報(bào)告時(shí)間需氧菌需氧菌24h2-3個(gè)工作日個(gè)工作日厭氧菌厭氧菌48h酵母菌酵母菌2-5天天2-5個(gè)工作日個(gè)工作日絲狀真菌絲狀真菌2-5天天常規(guī)微生物檢驗(yàn)遇到的困惑：呼吸道、腸道標(biāo)本的細(xì)菌種類繁多，常規(guī)的鑒定成本高或者操作麻煩， 容易漏掉或者忽視某些細(xì)菌。厭氧菌、彎曲菌、分枝桿菌和真

2、菌：細(xì)菌鑒定的死角，技術(shù)上不好掌 握或者目前的方法難以實(shí)施。微生物的分級(jí)報(bào)告制度：存在很多變數(shù)，使得初次報(bào)告的結(jié)果可靠性 得不到臨床的認(rèn)可。（比如：直接涂片，初步能估計(jì)細(xì)菌大類，但是比如：直接涂片，初步能估計(jì)細(xì)菌大類，但是 無法確切的到種，和耐藥情況。）無法確切的到種，和耐藥情況。）實(shí)驗(yàn)室要求：操作方便的，成本便宜的，性價(jià)比高的，臨床迫切需要的。臨床微生物實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化 將實(shí)驗(yàn)室人員從一些技術(shù)要求較低的、能由儀器完成的工作中解脫出來，提高標(biāo)本處理效率，縮短TAT時(shí)間。 臨床的需求安圖安圖生物生物AutofAutof ms1000ms1000MALDI-TOF革命性臨床微生物獸醫(yī)微生物食品微生物（

3、食品安全與質(zhì)控）環(huán)境微生物監(jiān)測質(zhì)譜的應(yīng)用領(lǐng)域（二）（二）、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS 的組成的組成飛行時(shí)間質(zhì)量飛行時(shí)間質(zhì)量檢測器（檢測器（TOFTOF）基質(zhì)輔助激光解吸基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源（電離離子源（MALDIMALDI）數(shù)據(jù)庫主機(jī)（三（三）、MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS 的原理的原理基本原理是將樣品分散在基質(zhì)分子中并形成晶體?；驹硎菍悠贩稚⒃诨|(zhì)分子中并形成晶體。當(dāng)用激光照射晶體時(shí)，基質(zhì)從激光中吸收能量，當(dāng)用激光照射晶體時(shí)，基質(zhì)從激光中吸收能量，樣品解吸附，基質(zhì)樣品解吸附，基質(zhì)- -樣品之間發(fā)生電荷

4、轉(zhuǎn)移使得樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使得樣品分子電離，電離的樣品在電場作用下飛過真樣品分子電離，電離的樣品在電場作用下飛過真空的飛行管，根據(jù)到達(dá)檢測器的飛行時(shí)間不同而空的飛行管，根據(jù)到達(dá)檢測器的飛行時(shí)間不同而被檢測，即通過離子的質(zhì)量電荷之比（被檢測，即通過離子的質(zhì)量電荷之比（M/ZM/Z）與）與離子的飛行時(shí)間成正比來分析離子，從而測得并離子的飛行時(shí)間成正比來分析離子，從而測得并繪出樣品分子的質(zhì)譜圖。繪出樣品分子的質(zhì)譜圖。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)。不同的細(xì)菌或不同疾病的樣品，其蛋白質(zhì)的種類和含量不同。不同的蛋白質(zhì)解析后形成的多肽片段的種類、數(shù)量和分子量也不一樣，因而在一定的條件下，在電離空間的運(yùn)動(dòng)速度和距

5、離不同。用質(zhì)譜儀將各種蛋白質(zhì)解析后在電離空間的運(yùn)動(dòng)速度和距離的軌跡記錄和描繪下來，則會(huì)形成不同的曲線圖形。（四）、操作簡便（四）、操作簡便樣品靶板細(xì)菌與基質(zhì)飛行管檢測器質(zhì)譜圖真空系統(tǒng)樣品靶板 入口幾秒鐘即可得到結(jié)果基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)MALDI-TOF MS蛋白質(zhì)指紋特征蛋白質(zhì)指紋特征MALDI TOF檢測挑取部分菌落點(diǎn)樣至靶板加基質(zhì)液生成圖譜搜庫鑒定質(zhì)譜質(zhì)譜檢測流程檢測流程鑒定結(jié)果顯示綠色并且分?jǐn)?shù) 最高的為該樣品的 鑒定結(jié)果。Bruker的結(jié)果報(bào)告：得分范圍分?jǐn)?shù)的解釋2.300-3.000highly probable species identif

6、ication完全可靠地鑒定到種的水平2.000-2.299secure genus identification, probable species identification可靠鑒定到屬的水平，有可能鑒定到種的水平1.700-1.999 probable genus identification有可能鑒定到屬的水平0.000-1.699 no reliable identification沒有可信的鑒定結(jié)果AnalyteNameOrganism(best match)ScoreOrganism(second best match)ScoreSample1Pseudomonas aerug

7、inosa 19955 1 CHB1.906Pseudomonas aeruginosa DSM 1117 DSM1.881Sample2Proteus mirabilis DSM 18254 DSM1.774no reliable identification1.631Sample3Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae 9295 1 CHB2.064Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae DSM 30104T HAM1.994Sample4Enterobacter cloacae MB11506-1_CHB2.299Ent

8、erobacter cloacae 13159_1 CHB2.072優(yōu)點(diǎn)：直接可以打印缺點(diǎn)：目前沒有做接口連接到實(shí)驗(yàn)室的LIS系統(tǒng)與現(xiàn)有傳統(tǒng)的鑒定診斷技術(shù)相比，具有操作簡單、快速、通量高、靈敏度高、準(zhǔn)確度好、試劑耗品非常經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢。準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度時(shí)間時(shí)間成本成本MALDI-TOF90%5 min2元常規(guī)方法80%548 h50元對(duì)臨床的意義：分級(jí)報(bào)告，縮短了TAT時(shí)間，尤其是厭氧菌、奴卡菌等非常難鑒定的菌提供巨大的幫助。五、實(shí)現(xiàn)血培養(yǎng)的三級(jí)報(bào)告五、實(shí)現(xiàn)血培養(yǎng)的三級(jí)報(bào)告微生物診斷技術(shù)不斷發(fā)展給臨床帶來了什么？1、非培養(yǎng)/難培養(yǎng)微生物的檢測能力大大提高2、縮短了常規(guī)微生物培養(yǎng)鑒定診斷藥敏時(shí)間(即TA

9、T時(shí)間)3、從微生物檢驗(yàn)角度提供精準(zhǔn)的診斷六、安圖微生物質(zhì)譜Autof ms1000的優(yōu)勢1 1、本土產(chǎn)、本土產(chǎn)品品維護(hù)保養(yǎng)維護(hù)保養(yǎng)方便及時(shí)方便及時(shí)試劑、耗試劑、耗材供應(yīng)及材供應(yīng)及時(shí)時(shí)價(jià)格便宜價(jià)格便宜數(shù)據(jù)庫主要包含：數(shù)據(jù)庫主要包含：474474個(gè)屬、個(gè)屬、26132613多種、多種、95319531株（包含株（包含細(xì)菌、真菌等）細(xì)菌、真菌等）正在開發(fā)的數(shù)據(jù)庫：生物反恐生物反恐、腸道微生物、海洋致病微生物、肉類蛋白數(shù)據(jù)庫操作操作簡便簡便中文界面，單個(gè)軟件中文界面，單個(gè)軟件即可完成編輯、采集、即可完成編輯、采集、鑒定；快速鑒定功能鑒定；快速鑒定功能方便使用。方便使用。準(zhǔn)準(zhǔn)確度高，重復(fù)性確度高，重復(fù)

10、性好好上海臨檢中心評(píng)估項(xiàng)目總結(jié)：01 ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株鑒定準(zhǔn)確性安圖質(zhì)譜檢測微生物的結(jié)果與172株ATCC國際標(biāo)準(zhǔn)菌株的一致性為97.67%，高于布魯克的93.60%。02 臨床菌株鑒定準(zhǔn)確性安圖質(zhì)譜Autof ms1000對(duì)176株臨床菌株的鑒定準(zhǔn)確性為100%，高于布魯克的98.30%。04 鑒定重復(fù)性安圖質(zhì)譜Autof ms1000對(duì)65株實(shí)驗(yàn)菌株的鑒定結(jié)果全部可靠，重復(fù)性較好。03 不同前處理方法的鑒定準(zhǔn)確性三種前處理方式安圖質(zhì)譜Autof ms1000的鑒定準(zhǔn)確性均高于布魯克質(zhì)譜，其中甲酸裂解法更適于臨床使用。Autof ms1000鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，適于臨床微生物檢測。中國檢驗(yàn)檢

11、疫科學(xué)研究院評(píng)估結(jié)論Autof ms1000鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性、重復(fù)性可靠MALDI-TOF MS對(duì)血培養(yǎng)陽性樣本的直接檢測優(yōu)點(diǎn)：快速。缺點(diǎn)：操作麻煩，且抽濾容易產(chǎn)生氣溶膠，污染環(huán)境。不易于在臨床推廣。 鑒定的缺陷：多重菌感染不能鑒定，或者鑒定有誤，鏈球菌等難于區(qū)分的菌是最大的問題。MRSA的鑒別和分型Edwards-Jones et al. J Med Microbiol. 2000MRSA的鑒別和分型Wolters et al. IJMM. 2011從圖中可見，可 以做同源性的比 較使用體會(huì)成本低，快速，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確，性價(jià)比高。 可以聚類分析，即同源性的研究，在耐藥上有優(yōu)勢?？梢越熘袥]有的細(xì)菌的數(shù)據(jù)庫，有地域性的數(shù)據(jù)庫。最好選擇血平板