微生物檢驗(yàn)的基本操作技術(shù)

1、微生物檢驗(yàn)的基本操作技術(shù)一、無菌操作技術(shù)1、定義是指在執(zhí)行實(shí)驗(yàn)過程中，防止一切微生物侵入機(jī)體和保持無菌物品及無菌區(qū)域不被污染的操作技術(shù)和管理方法；無菌操作技術(shù)是微生物實(shí)驗(yàn)的基本技術(shù)，是保證微生物實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確和順利完成的重要環(huán)節(jié)。2、內(nèi)容無菌操作技術(shù)主要包括兩方面：1）創(chuàng)造無菌的培養(yǎng)環(huán)境。包括提供密閉的培養(yǎng)容器、培養(yǎng)容器的滅菌、培養(yǎng)基的滅菌等；2）在操作和培養(yǎng)過程中防止一切其它微生物的侵入的措施。包括紫外線殺菌、甲醛熏蒸、超凈臺的消毒與檢測、操作工具、器皿滅菌、操作方法等。3、無菌操作原則1）在執(zhí)行無菌操作時(shí)，必須明確物品的無菌區(qū)和非無菌區(qū)，接種時(shí)必須穿工作服、戴工作帽，應(yīng)在進(jìn)無菌室前用肥皂洗手，然

2、后用75%酉精棉球?qū)⑹植粮蓛簦?）在操作前2030分鐘要先啟動超凈臺和紫外燈，進(jìn)行接種所用的吸管、平皿及培養(yǎng)基等必須經(jīng)消毒滅菌，打開包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應(yīng)高壓滅菌或用95%酉精點(diǎn)/燒灼3次后使用。嚴(yán)禁用手直接拿無菌物品，如瓶塞等，而必須用消毒的鉗、鐐子等；3）從包裝中取出吸管時(shí)，吸管尖部不能觸及外露部位，使用吸管接種于試管或平皿時(shí)，吸管尖不能觸及試管或平皿邊；4）接種樣品、轉(zhuǎn)種細(xì)菌必須在酒精燈前操作，接種細(xì)菌或樣品時(shí)，吸管從包裝中取出后及打開試管塞都要通過火焰消毒；5）接種環(huán)或接種針在接種細(xì)菌前應(yīng)經(jīng)火焰燒灼全部金屬絲，必須時(shí)還要燒到環(huán)和針與桿的連接處；6）吸管吸取菌液

3、或樣品時(shí)，應(yīng)用相應(yīng)的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。傾倒平板應(yīng)在超凈臺內(nèi)操作，并且在開啟和加蓋瓶塞時(shí)需反復(fù)用酒精燈燒。二、無菌操作的環(huán)境要求1、無菌室（1）無菌室的結(jié)構(gòu)：更衣間、緩沖間、操作間；(2)無菌室的消毒和防污染?每日(使用前)紫外線照射(0.51小時(shí))；?每月用新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)行消毒；?每季度用甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸(2小時(shí))，特殊情況下可增加熏蒸頻次。(3)無菌室使用要求無菌室內(nèi)應(yīng)保持清潔，工作后用2%-3淋酚皂溶液消毒，拭擦工作臺面，不得存放與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的物品；無菌室使用前后應(yīng)將門關(guān)緊，打開紫外線，如采用室內(nèi)懸吊紫外燈消毒時(shí)，需30W紫外燈，距離在1.0m處,照射時(shí)

4、間不少于30min,使用紫外燈，應(yīng)注意不得直接在紫外線下操作，以免引起損傷，燈管每隔兩周需用酒精棉球輕輕拭擦，除去上面灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響；處理和接種食品標(biāo)本時(shí)，進(jìn)入無菌室操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過小窗傳遞。在無菌室內(nèi)如需要安裝空調(diào)時(shí)，則應(yīng)有過濾裝置。2、超凈工作臺超凈臺的使用與保養(yǎng)：(1)風(fēng)速穩(wěn)定，且符合要求；(2)使用前開啟紫外燈照射30分鐘以上；(3)讓超凈臺預(yù)工作1015分鐘；(4)使用完畢后，用70%酉精將臺面和臺內(nèi)四周擦拭干凈。3、無菌器材(1)滅菌器材：玻璃器皿、培養(yǎng)基、無菌衣等；(2)消毒器材：無菌室內(nèi)的凳子、試管架、天平、工作臺、手等。(3)無菌

5、間一般只允許放置無菌操作臺、轉(zhuǎn)椅等物品；無菌操作臺上一般只允許擺放以下物品：酒精燈、打火機(jī)、接種針、消毒棉球、洗耳球、鐐子、油性筆、滅菌平皿、試管架、滅菌吸管、電子天平、250ml滅菌三角瓶、培養(yǎng)基、均質(zhì)器等。三、無菌操作的基本技術(shù)1、無菌接種操作培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個(gè)過程叫做無菌接種操作。無菌操作料面斜網(wǎng)版國攙作口腳恢a。講啟犍e虐口耀（族斑造（5藤稗i健林基在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必須是無菌操作。2、微生物檢驗(yàn)過程中的無菌操作要求(1)在操作中不應(yīng)有大幅度或快速的動作;(2)使用玻璃器皿應(yīng)輕

6、取輕放;(3)在正火焰上方操作;(4)接種用具在使用前、后都必須灼燒滅菌;(5)在接種培養(yǎng)物時(shí)，協(xié)作應(yīng)輕、準(zhǔn);(6)不能用嘴直接吸吹吸管;(7)帶有菌液的吸管、玻片等器材應(yīng)及時(shí)置于盛有5啾蘇爾溶液的消毒桶內(nèi)消毒。3、無菌操作技術(shù)詳細(xì)圖解(1)取菌技巧(1)取菌技巧A接種環(huán)在火壇上充分燒紅(接種柄,一邊茸動一邊慢慢地來回通過火電三次)(1)取菌技巧A4,試節(jié)斜低，族人接種環(huán)5.試管的蝴過火女上演重6,接種壞境缸滅烹2.自平板上取單一函落(方法一：鼻子微開遮住培養(yǎng)基,避免空氣中營體掉入)(1)取菌技巧C1.調(diào)瞥Pipetmun劃，度（P1000喙.取范圍2001000g1）2.插上滅過菌之Tip（

7、用力插胃、.（1）取菌技巧D3.按鈕壓至第一段（不可壓至最底）4.深入液面下24nun(I)取菌技巧D(2)接種技巧(2)接種技巧(2)接種技巧方法二：以安全吸球吸取菌液，放入新的培株基中，向下排出酒液方法一：以接種環(huán)沾西-旗A所的培赤基申接的方法三：以Pipetman吸聚前液，按短壓至量底排出辿液(3)錯(cuò)誤小范(3)錯(cuò)誤示范操作畤離火源遙遠(yuǎn)試管直放，空氣中菌體容易掉入(3)錯(cuò)誤示范(3)錯(cuò)誤示范Pipetmac倒放，茵液容易流入Pipetnian用、接種1、接種定義接種：將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種。2、接種工具在實(shí)驗(yàn)室中，用得最多的接種工具是接種環(huán)、

8、接種針。有時(shí)滴管、吸管也可作為接種工具進(jìn)行液體接種。在固體培養(yǎng)基表面要將菌液均勻涂布時(shí)，需要用到涂布棒。1.接種針2.接種環(huán)3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀3、微生物檢驗(yàn)常見接種方法(1)劃線接種法1、平板劃線分離法圖41平板劃線分離法L斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.口冷,平板劃線分離法-分區(qū)劃線分離法用接種環(huán)先將培養(yǎng)物涂布于平板1區(qū)并作數(shù)次劃線，再在2、3區(qū)依次劃線；每劃完一個(gè)區(qū)域，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約70度角，并將接種環(huán)滅菌一次，待冷后再劃下一區(qū)域；每一區(qū)域的劃線均接觸上一區(qū)域的接種線12次，使接種量逐漸減少，以獲得單個(gè)菌落；其他操作與上述曲線劃線分離法相同。(

9、2)斜面接種法主要用于經(jīng)劃線分離培養(yǎng)所獲得的單個(gè)菌落的移種，以及觀察細(xì)菌的某些培養(yǎng)特征。以菌種移種為例，其接種方法是：取一菌種管和培養(yǎng)基管，置左手食指、中指、無名指間，拇指壓住兩管底部上側(cè)面，使菌種管位于外側(cè)，培養(yǎng)基管位于內(nèi)側(cè)；12次;右手拇指和食指分別旋松兩管棉塞?；鹧鏈缇臃N環(huán)；以右手小指與手掌，小指與無名指分別夾取棉塞(先外管后內(nèi)管)，將兩管口迅速通過火焰將已滅菌的接種環(huán)伸入菌種管中，從斜面上取菌少許，迅速伸入待接種的培養(yǎng)基管中，在斜面底部向上劃一條直線，然后從底部起向上作曲折連續(xù)劃線，直至斜面上方頂端;取出接種環(huán)，火焰滅菌管口，塞上棉塞（先塞內(nèi)管）；最后將接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌放好;做好標(biāo)識

10、，置35c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1824小時(shí)。斜面培養(yǎng)一般形成均勻一致的菌苔。一般可觀察表面、透明度、色澤等特征。(3)涂布接種法涂布法接種是一種常用的接種方法，不僅可以用于計(jì)算活菌數(shù)，還可以利用其在平板表面生長形成菌苔的特點(diǎn)書于檢測化學(xué)因素對微生物的抑殺效應(yīng)。原理：將一定濃度，一定量的待分離菌液移到已凝固的培養(yǎng)基平板上，再用涂布棒快速地將其均勻涂布，使長出單菌落而達(dá)到分離的目的。(4)液體接種法(肉湯接種)如斜面接種法持好菌種管及培養(yǎng)基管;滅菌接種環(huán)，從菌種管取菌，伸入培養(yǎng)基管中，在接近液面的管壁上方輕輕研磨，并沾取少許培養(yǎng)基液體調(diào)和，使細(xì)菌混合于培養(yǎng)基的液體中。液體培養(yǎng)基一般以1824小時(shí)培養(yǎng)后觀察

11、生長特征。肉湯培養(yǎng)可觀察如下幾項(xiàng)：a.發(fā)育程度：有無生長、微弱、中等、旺盛；b.混濁度：有無及程度（混、中等、微混、透明）、均勻混濁、有顆粒、絮狀生長；c.沉淀：有無及量多少、性狀（粉狀、顆粒狀、絮狀、沾性）；d.表面：有無生長、性狀（膜狀、環(huán)狀）、菌膜厚薄及表面特征（光滑、顆粒、皺狀）；e.其他：有無特殊氣味，色素。如果是糖發(fā)酵培養(yǎng)基則主要觀察是否產(chǎn)酸和有無氣體。（5）穿刺接種法（半固體接種）多用于保存菌種、觀察動力及厭氧培養(yǎng)等也可以用于觀察細(xì)菌的某些生化反應(yīng)。如斜面接種法持好菌種管及培養(yǎng)基管；以滅菌接種針從菌種管取菌，垂直刺入培養(yǎng)基的中心（半固體或一般瓊脂高層）直達(dá)近管底部（但不能完全刺到

12、管底），接種針應(yīng)沿原路退出；二經(jīng)培養(yǎng)后半固體培養(yǎng)基可觀察到：沿穿刺線生長，線外的培養(yǎng)基清亮表示細(xì)菌無動力；穿刺線模糊不清，或沿穿刺線向外擴(kuò)散生長，或整個(gè)培養(yǎng)基混濁表示細(xì)菌有動力。半固體穿刺營養(yǎng)肉漏：涌體芟混濁半固體球脆培養(yǎng)基。3引向二濕竽應(yīng)長二、分離純化1、幾個(gè)定義混和培養(yǎng)物：含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物(Mixedculture);純培養(yǎng)：如果在一個(gè)菌落中所有細(xì)胞均來自于一個(gè)親代細(xì)胞，那么這個(gè)菌落稱為純培養(yǎng)(Pureculture);分離純化：在進(jìn)行菌種鑒定時(shí)，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物，得到純培養(yǎng)的過程稱為分離純化。包括傾注平板法、涂布平板法、平板劃線法等等。2、傾注平

13、板法(倒平板)將無菌培養(yǎng)皿放入生物安全柜或凈化臺中，然后分別倒入15ml已融化并且冷卻至45c左右的牛肉膏蛋白月東瓊脂培養(yǎng)基，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布，待凝固之后，把這平板倒置在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。單一細(xì)胞經(jīng)過多次增殖后形成一個(gè)菌落，取單個(gè)菌落制成懸液，重復(fù)上述步驟數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)物。整個(gè)操作過程應(yīng)嚴(yán)格按照無菌操作。三、微生物的培養(yǎng)方法微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到許多外界因素的影響，如營養(yǎng)物濃度、溫度、水分、氧氣、pH等。微生物的種類不同，培養(yǎng)的方式和條件也不盡相同。通常分為：1、一般培養(yǎng)法(需氧培養(yǎng))培養(yǎng)溫度：2537c2、厭氧培養(yǎng)方法(1)簡易的厭氧培養(yǎng)

14、法:A、庖肉培養(yǎng)法日鐵絲圈厭氧培養(yǎng)法C焦性沒食子酸法(2)厭氧罐法(3)厭氧手套箱法厭氧缸法:厭氧缸是普通的干燥缸，用物理化學(xué)的方法使缸內(nèi)造成厭氧環(huán)境，從而將厭氧菌培養(yǎng)出來。接種好標(biāo)本的平板或液體培養(yǎng)基試管，可放入?yún)捬醺變?nèi)培養(yǎng)。厭氧罐法:裝入待培養(yǎng)的對象，然后密閉罐蓋，接著可采用抽真空一灌氮一抽真空一灌氮一抽真空一灌混合氣(N2：CO2：H2=80：10：10,V/V)。3、二氧化碳培養(yǎng)法(4)二氧化碳培養(yǎng)箱法四、微生物常規(guī)鑒定技術(shù)1、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察(1)在固體培養(yǎng)基上，觀察:菌落大小、形態(tài)、顏色(色素是水溶性還是脂溶性)、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性(2)在液體培

15、養(yǎng)中:表面生長情況(菌膜、環(huán))混濁度及沉淀等;(3)半固體培養(yǎng)基穿刺接種:觀察運(yùn)動、擴(kuò)散情況。AX，手RU12L點(diǎn)狀2.圓形3,絲狀4.不規(guī)則形5.假根狀6.紡錘狀7.扁平S.隆起9.凸起10.墊狀11.臍狀12.邊每整齊13.波狀14.裂片狀1艮嚙蝕狀16.建狀17,卷發(fā)狀18.絲線狀19,剌毛狀20.串珠狀2L疏展?fàn)?2.樹根狀23.假根狀24,絲狀25.串珠狀26.乳頭狀2,絨毛狀2g.樹根狀29,量杯狀沁蘿卜狀31.漏斗就32囊狀33,層狀34.絮狀35,訴狀36.套狀37-臏狀2、染色鏡檢(1)染色原理由于微生物細(xì)胞含有大量水分，機(jī)體是無色透明的，與周圍背景沒有明顯的反差，必須進(jìn)行染

16、色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。微生物中細(xì)菌、致病菌是很小的生物體，必須通過染色的方法，在顯微鏡下才能看得清楚，并且還可以通過染色的方法鑒別革蘭氏染色特性，以及是否長有鞭毛、周毛、莢膜和芽抱等。(2)染色方法簡單染色法簡單染色法又叫作普通染色法，只用一種染料使細(xì)菌染上顏色，觀察細(xì)菌的形態(tài)。復(fù)染色法用兩種或多種染料染細(xì)菌，目的是為了鑒別不同性質(zhì)的細(xì)菌，所以又叫鑒別染色法。主要的復(fù)染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法。（3）革蘭氏染色法原理革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法。1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽性細(xì)菌，用G+表示；染色反應(yīng)呈紅色的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌，用G表示。細(xì)菌對革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。細(xì)菌的革蘭氏染色步驟涂片一干燥一固定一初染一水洗一媒染一水洗一脫色一水洗一復(fù)染一水洗一干燥一觀察A）取培養(yǎng)物分別做涂片、干燥、固定，方法均與簡單染色的相同；B）用草酸俊結(jié)晶紫染色1min后水洗；C）加碘?媒染1min后水洗；D）斜置載玻片，滴加95%乙醇脫色，至流出的乙醇不現(xiàn)紫色為止，大約需時(shí)2030s,隨即