核酸外切酶、內(nèi)切酶、聚合酶、連接酶

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上核酸外切酶（exonuclease） 外切酶是一類能從多核苷酸鏈的一端開(kāi)始按序催化3、5-，降解的酶。其水解的最終產(chǎn)物是單個(gè)的核苷酸（為dNTP，為NTP）。按作用的特性差異可以將其分為單鏈的核酸外切酶和雙鏈的核酸外切酶。 單鏈的核酸外切酶包括大腸桿菌核酸外切酶（exo）和核酸外切酶（exo）。核酸外切酶（exo）能夠從5-末端或3-末端呈單鏈狀態(tài)的DNA分子上降解DNA，產(chǎn)生出短片段，而且是唯一不需要Mg2+離子的活性，是一種耐受性很強(qiáng)的。核酸外切酶（exo）可以用來(lái)測(cè)定基因組DNA中一些特殊的間隔序列和編碼序列的位置。它只切割末端有單鏈突出的DNA分子。 雙鏈的核

2、酸外切酶包括核酸外切酶（exo）、核酸外切酶（exo）以及T7基因6核酸外切酶等。大腸桿菌核酸外切酶（exo ）具有多種功能，可以降解雙鏈DNA分子中的許多類型的磷酸二酯鍵。其中主要的催化活性是催化雙鏈DNA按35的方向從3-OH末端釋放5-單核苷酸。大腸桿菌核酸外切酶（exo）通過(guò)其35外切酶活性使雙鏈DNA分子產(chǎn)生出單鏈區(qū)，經(jīng)過(guò)這種修飾的DNA再配合使用Klenow酶，同時(shí)加進(jìn)帶的核苷酸，便可以制備特異性的放射性探針。 噬菌體核酸外切酶（exo）最初是從感染了噬菌體的大腸桿菌細(xì)胞中純化出來(lái)的。這種酶催化雙鏈DNA分子從5-P末端進(jìn)行逐步的水解釋放出5-單核苷酸。但不能降解5-OH末端。內(nèi)切

3、酶（incision enzyme） 這是一類能從中間水解,從而切斷雙鏈DNA的核酸水解酶。它們不同于一般的脫氧核糖核酸酶（DNase）,它們的切點(diǎn)大多很?chē)?yán)格，要求專一的核苷酸順序識(shí)別順序內(nèi)切酶主要分成三大類。 第一類內(nèi)切酶能識(shí)別專一的核苷酸順序，并在識(shí)別點(diǎn)附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒(méi)有專一性，是隨機(jī)的。這類限制性內(nèi)切酶在或基因工程中沒(méi)有多大用處，無(wú)法用于分析DNA結(jié)構(gòu)或克隆基因。這類酶如EcoB、EcoK等。 第二類內(nèi)切酶能識(shí)別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。由于這類限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和切割的核苷酸都是專一的。所以總能得到同樣核苷酸順序

4、的DNA片段，并能構(gòu)建來(lái)自不同基因組的DNA片段，形成雜合DNA分子。因此，這種限制性內(nèi)切酶是DNA重組技術(shù)中最常用的之一。這種酶識(shí)別的專一核苷酸順序最常見(jiàn)的是4個(gè)或6個(gè)核苷酸，少數(shù)也有識(shí)別5個(gè)核苷酸以及7個(gè)、9個(gè)、10個(gè)和11個(gè)核苷酸的。如果識(shí)別位置在DNA分子中分布是隨機(jī)的，則識(shí)別4個(gè)核苷酸的限制性內(nèi)切酶每隔46（4096）個(gè)核苷酸就有一個(gè)切點(diǎn)。人的單倍體基因組據(jù)估計(jì)為3×199核苷酸，識(shí)別4個(gè)核苷酸的限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)將有（3×109/2.5×102）約107個(gè)切點(diǎn)，也就是可被這種酶切成107片段，識(shí)別6個(gè)核苷酸的限制性內(nèi)切酶也將有（3×109/4

5、×103）約106個(gè)切點(diǎn)。第三類內(nèi)切酶的識(shí)別順序是一個(gè)回文對(duì)稱順序，即有一個(gè)中心對(duì)稱軸，從這個(gè)軸朝二個(gè)方向“讀”都完全相同。這種酶的切割可以有兩種方式。一是交錯(cuò)切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。粘性末端的意義：（1） 連接便利： 不同的DNA雙鏈，只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接，這比連接兩個(gè)平齊末端容易的多；同一個(gè)DNA分子內(nèi)連接，通過(guò)兩個(gè)相同的粘性末端可以連接成環(huán)狀分子。 （2）5末端標(biāo)記： 凸出的5末端可以用DNA多核苷酸激酶進(jìn)行32P標(biāo)記。凸出的3端可以通過(guò)末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個(gè)多聚核苷酸的尾巴(如AAA或TTT等）造成人工粘性

6、末端（3）補(bǔ)平成平齊末端 粘性末端可以用DNA聚合酶補(bǔ)平成平齊末端如EcoRI的識(shí)別順序?yàn)椋?| 5GAA | TTC3 3CTT | AAG5 | 垂直虛線表示中心對(duì)稱軸，從兩側(cè)“讀”核苷酸順序都是GAATTC或CTTAAG，這就是回文順序（palindrome）。實(shí)線剪頭表示在雙鏈上交錯(cuò)切割的位置，切割后生成5G和AATTC3、3CTTAA和G5二個(gè)DNA片段，各有一個(gè)單鏈末端，二條單鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，可通過(guò)形成而“粘合”。另一種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如Hae的識(shí)別位置是： 5GGCC3 3CCGG 在箭頭所指處切割，產(chǎn)生的兩個(gè)DNA片段是： 5GG CC3 和 3CC GG5

7、 有時(shí)候兩種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別核苷酸順序和切割位置都相同，差別只在于當(dāng)識(shí)別順序中有的核苷酸時(shí)，一種限制性內(nèi)切酶可以切割，另一種則不能。例如Hpa和Msp的識(shí)別順序都是5GCGG3，如果其中有5-甲基胞嘧啶，則只有Hpa能夠切割。這些有相同切點(diǎn)的酶稱為同切酶或異源同工酶（isoschizomer）。 第三類內(nèi)切酶也有專一的識(shí)別順序，但不是對(duì)稱的回文順序。它在識(shí)別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈。但這幾個(gè)核苷酸對(duì)則是任意的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長(zhǎng)度DNA片段，具有各種單鏈末端。這對(duì)于克隆基因或克隆DNA片段沒(méi)有多大用處。DNA聚合酶（DNA polymerase） DNA

8、聚合酶（DNA polymerase）是胞復(fù)制的重要作用酶。DNA聚合酶 , 以DNA為復(fù)制模板，從將DNA由5'端點(diǎn)開(kāi)始復(fù)制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具備模板、引物、dNTP等的情況下）及其相輔的活性。DNA聚合酶的共同特點(diǎn)是：（1）需要提供合成模板；（2）不能起始新的DNA鏈，必須要有引物提供3'OH；（3）合成的方向都是5'3'（4）除聚合DNA外還有其它功能。 功能1聚合作用:在引物RNA'-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApol逐個(gè)將核苷酸加上去，就是DNApol的聚合作用。酶的專

9、一性主要表現(xiàn)為新進(jìn)入的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對(duì)時(shí)才有催化作用。dNTP進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)后，可能使酶的構(gòu)象發(fā)生變化，促進(jìn)3'-OH與5'-PO4結(jié)合生成磷酸二酯鍵。若是錯(cuò)誤的核苷酸進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)，則不能與模板配對(duì)，無(wú)法改變酶的構(gòu)象而被3'-5'外切酶活性位點(diǎn)所識(shí)別并切除之。 23'5'外切酶活性校對(duì)作用:這種酶活性的主要功能是從3'5'方向識(shí)別和切除不配對(duì)的DNA生長(zhǎng)鏈末端的核苷酸。當(dāng)反應(yīng)體系中沒(méi)有反應(yīng)底物dNTP時(shí)，由于沒(méi)有聚合作用而出現(xiàn)暫時(shí)的游離現(xiàn)象，從而被3'5'外切酶活性所降解。如果提高反應(yīng)體系的溫度可以促進(jìn)

10、這種作用，這表明溫度升高使DNA生長(zhǎng)鏈3'末端與模板發(fā)生分離的機(jī)會(huì)更多，因而降解作用加強(qiáng)。當(dāng)向反應(yīng)體系加入dNTP，而且只加放與模板互補(bǔ)的上述核苷酸才會(huì)使這種外切酶活性受到抑制，并繼續(xù)進(jìn)行DNA的合成。由此推論，3'5'外切酶活性的主要功能是校對(duì)作用，當(dāng)加入的核苷酸與模板不互補(bǔ)而游離時(shí)則被3'5'外切酶切除，以便重新在這個(gè)位置上聚合對(duì)應(yīng)的核苷酸。在某些T4噬菌體突變株中DNA復(fù)制的真實(shí)性降低，而易發(fā)生突變，從此突變株分離得到的T4DNA聚合酶的3'5'外切酶活性很低。相反，另外一些具有抗突變能力的T4突變株中的T4DNA聚合酶的3'

11、;5'外切酶活性比野生型高得多，因此，其DNA復(fù)制真實(shí)性好，變異率低?？梢?jiàn)，3'5'外切酶活性對(duì)DNA復(fù)制真實(shí)性的維持是十分重要的。 35'3'外切酶活性切除修復(fù)作用:5'3'外切酶活性就是從5'3'方向水解DNA生長(zhǎng)鏈前方的DNA鏈，主要產(chǎn)生5'-脫氧核苷酸。這種酶活性只對(duì)DNA上配對(duì)部分(雙鏈)磷酸二酯鍵有切割活力作用，方向是5'3'。每次能切除10個(gè)核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激5'3'外切酶活力達(dá)10倍以上。因此，這種酶活性在DNA損傷的修復(fù)中可能起著重要作用。對(duì)岡崎片段

12、5'末端的去除依賴此種外切酶活性。 4焦磷酸解作用:DNApol的這種活性可以催化3'末端焦磷酸解DNA分子。這種作用就是無(wú)機(jī)焦磷酸分解DNA生長(zhǎng)鏈，可以認(rèn)為是DNA聚合作用的逆反應(yīng)，而且這種水解DNA鏈作用需要有模板DNA的存在。(dNMP)n+XPPi(dNMP)n-x+X(dNPPP)DNA 5焦磷酸交換作用:催化dNTP末端的PPi同無(wú)機(jī)焦磷酸的交換反應(yīng)。反應(yīng)式為32P32Pi+dNPPPdNP32P32P+PPiDNA 最后兩種作用，都要求有較高濃度的PPi，因此，在體內(nèi)由于沒(méi)有足夠高的PPi而無(wú)重要意義。 DNApol的DNA聚合酶活性和5'3'外切

13、酶活性協(xié)同作用，可以使DNA鏈上的切口向前推進(jìn)，即沒(méi)有新的DNA合成，只有核苷酸的交換。這種反應(yīng)叫缺口平移(Nick translation)。當(dāng)雙鏈DNA上某個(gè)磷酸二酯鍵斷裂產(chǎn)生切口時(shí)，DNApoI能從切口開(kāi)始合成新的NDA鏈，同時(shí)切除原來(lái)的舊鏈。這樣，從切口開(kāi)始合成了一條與被取代的舊鏈完全相同的新鏈。如果新?lián)饺氲拿撗鹾塑账崛姿釣?32P-dNTP，則重新合成的新鏈即為帶有同位素標(biāo)記的DNA分子，可以用作探針進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 大腸桿菌DNA聚合酶1、大腸桿菌DNA聚合酶(DNApolymerase，DNApol)這是1956年由ArthurKornberg首先發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶，又稱Kornbe

14、r酶。此酶研究得清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特點(diǎn)。 (1) 理化性質(zhì)：純化的DNApol由一條多肽鏈組成，約含1000個(gè)氨基酸殘基，MW為109KD。分子含有一個(gè)二硫鍵和一個(gè)-SH基。通過(guò)二個(gè)酶分子上的-SH基與Hg2+結(jié)合產(chǎn)生二聚體，仍有活性。每個(gè)酶分子中含有一個(gè)Zn2+，在DNA聚合反應(yīng)起著很重要的作用。每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中含有約400個(gè)分子，每個(gè)分子每分鐘在37下能催化667個(gè)核苷酸摻入正在生長(zhǎng)的DNA鏈。經(jīng)過(guò)枯草桿菌蛋白酶處理后，酶分子分裂成兩個(gè)片段，大片段分子量為76KD，通常稱為，小片段的分子量為34KD。此酶的模板專一性和底物專一性均較差，它可以用人工合成的RNA作為模板，

15、也可以用核苷酸為底物。在無(wú)模板和引物時(shí)還可以從頭合成同聚物或異聚物。 DNAPol在空間結(jié)構(gòu)上近似球體，直徑約65A。在酶的縱軸上有一個(gè)約20A的深溝(cleft)，帶有正電荷，這是該酶的活性中心位置，在此位置上至少有6個(gè)結(jié)合位點(diǎn):1模板DNA結(jié)合位點(diǎn);2DNA生長(zhǎng)鏈或引物結(jié)合位點(diǎn);3引物末端結(jié)合位點(diǎn)，用以專一引物或DNA生長(zhǎng)鏈的3'-OH;4脫氧核苷三磷酸結(jié)合位點(diǎn);55'3'外切酶活性位點(diǎn)，用以結(jié)合生長(zhǎng)鏈前方的5'-端脫氧核苷酸并切除之;63'5'外切酶活性位點(diǎn)，用以結(jié)合和切除生長(zhǎng)鏈上未配對(duì)的3'-端核苷酸。 大腸桿菌DNA聚合酶I 大

16、片段(Klenow)Klenow酶的基本用途：（1）補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5粘性末端（2）DNA片段的同位素末端標(biāo)記（3）cDNA第二鏈的合成（4）雙脫氧末端終止法測(cè)定DNA序列2、大腸桿菌DNA聚合酶(DNApol)：DNA聚合酶缺陷的突變株仍能生存，這表明DNApol不是DNA復(fù)制的主要聚合酶。人們開(kāi)始尋找另外的DNA聚合酶，并于1970年發(fā)現(xiàn)了DNApol。此酶MW為120KD，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)約有100個(gè)酶分子，但活性只有DNApol的5%。該酶的催化特性如下： (1)聚合作用:該酶催化DNA的聚合，但是對(duì)模板有特殊的要求。該酶的最適模板是雙鏈DNA而中間有空隙(gap)的單鏈DNA部分，而

17、且該單鏈空隙部分不長(zhǎng)于100個(gè)核苷酸。對(duì)于較長(zhǎng)的單鏈DNA模板區(qū)該酶的聚合活性很低。但是用單鏈結(jié)合蛋白(SSBP)可以提高其聚合速率，可達(dá)原來(lái)的50-100倍。 (2)該酶也具有3'5'外切酶活性，但無(wú)5'3'外切酶活性。 (3)該酶對(duì)作用底物的選擇性較強(qiáng)，一般只能將2-脫氧核苷酸摻入到DNA鏈中。 (4)該酶不是復(fù)制的主要聚合酶，因?yàn)榇嗣溉毕莸拇竽c桿菌突變株的DNA復(fù)制都正常?？赡茉贒NA的損傷修復(fù)中該酶起到一定的作用。 3、 大腸桿菌DNA聚合酶(DNApol)：DNA pol 全酶由多種亞基組成(見(jiàn)下表)，而且容易分解。大腸桿菌每個(gè)細(xì)胞中只有10-20個(gè)酶

18、分子，因此不易獲得純品，為研究該酶的各種性質(zhì)和功能帶來(lái)了許多困難。直到不久前，才對(duì)其性質(zhì)和功能有所了解，但每個(gè)亞基的具體作用扔不十分清楚。盡管該酶在細(xì)胞內(nèi)存在的數(shù)量較少，但催化脫氧核苷酸摻入DNA鏈的速率分別是DNA聚合酶的15倍和30倍。該酶對(duì)模板的要求與DNA聚合酶相同，最適模板也是鏈DNA中間有空隙的單鏈DNA，單鏈結(jié)合蛋白可以提高該酶催化單鏈DNA模板的DNA聚合作用。DNApol也有3'5'和5'3'外切酶活性，但是3'5'外切酶活性的最適底物是單鏈?zhǔn)荄NA，只產(chǎn)生5'-單核苷酸，不會(huì)產(chǎn)生二核苷酸，即每次只能從3'端開(kāi)始

19、切除一個(gè)核苷酸。5'3'外切酶活性也要求有單鏈DNA為起始作用底物，但一旦開(kāi)始后，便可作用于雙鏈區(qū)。DNA聚合酶是細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制所必需的酶，缺乏該酶的溫度突變株在限制溫度(non permissive temperature)內(nèi)是不能生長(zhǎng)的，此種突變株的裂解液也不能合DNA，但加入DNA聚合酶則可以恢復(fù)其合成DNA的能力。 大腸桿菌三種DNA聚合酶的特性 功能 pol pol pol 聚合作用5'3' + + + 外切酶活性3'5' + + + 外切酶活性5'3' + - + 焦磷酸解和焦磷酸交換作用 + - + 模板及引物的選

20、擇 完整的DNA雙鏈 - - - 帶引物的長(zhǎng)單鏈DNA + - - 帶缺口的雙鏈DNA + - - 雙鏈而有間障的DNA + + + 一般性質(zhì) 分子量 1 09KD 120KD 140KD 每細(xì)胞中的分子量 400 17-100 10-20 結(jié)構(gòu)基因 polA polB polCT4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶(T4-DNApol)：近年來(lái)在枯草桿菌，鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌等細(xì)胞及噬菌體T4、T5、T7中分離到NDA聚合酶，這里只介紹T4DNA聚合酶。T4DNA聚合酶與大腸桿菌DNA聚合酶相似，也是一條多肽鏈，分子量亦相近，但氨基酸組成不同，它至少含有15個(gè)半胱氨酸殘基。但是，它在作用上與大腸桿

21、菌DNApol不同;1它無(wú)5'3'外切酶活性;2它需要一條有引物的單鏈DNA作模板。在有缺口的雙鏈DNA作模板時(shí)，需要有基因32蛋白的輔助(基因32蛋白在T4DNA復(fù)制中的作用和大腸桿菌單鏈結(jié)合蛋白的作用相似，基因32蛋白在復(fù)制叉處和單鏈DNA結(jié)合后可以促進(jìn)雙鏈的進(jìn)一步打開(kāi)，并保持其單鏈狀態(tài)有利于新生鏈的合成);它利用單鏈DNA為模板進(jìn)，可同時(shí)利用它作為引物，即此單鏈DNA的3'端能環(huán)繞其本身的某一順序形成氫鍵配對(duì)，3'端的未雜交部分即被T4DNA聚合酶的3'5'外切酶活性切去，然后在其作用下從3'-OH端開(kāi)始聚合，合成該模板DNA的互補(bǔ)

22、鏈，再以互補(bǔ)鏈為模板合成原來(lái)的單鏈DNA實(shí)驗(yàn)室常用的耐熱DNA聚合酶耐熱DNA聚合酶多應(yīng)用在PCR技術(shù)中。各種耐熱DNA聚合酶均具有5'-3'聚合酶活性，但不一定具有3'-5'和5'-3'的外切酶活性。3'-5'外切酶活性可以消除錯(cuò)配，切平末端；5'-3'外切酶活性可以消除合成障礙。由于上述這些不同，可以將耐熱DNA聚合酶分為三類： 一、普通耐熱DNA聚合酶 Taq DNA 聚合酶 由一種水生棲熱菌yT1株分離提取出，是發(fā)現(xiàn)的耐熱DNA聚合酶中活性最高的一種，達(dá)200,000單位/mg。具有5'-3'

23、;外切酶活性，但不具有3'-5'外切酶活性，因而在合成中對(duì)某些單核苷酸錯(cuò)配沒(méi)有校正功能。 還要具有非模板依賴性活性，可將PCR雙鏈產(chǎn)物的每一條鏈3'加入單核苷酸尾，故可使PCR產(chǎn)物具有3'突出的單A核苷酸尾；另一方面，在僅有dTTP存在時(shí)，它可將平端的質(zhì)粒的3'端加入單T核苷酸尾，產(chǎn)生3'端突出的單T核苷酸尾。應(yīng)用這一特性，可實(shí)現(xiàn)PCR產(chǎn)物的T-A克隆法。 Tth DNA 聚合酶 從Thermus thermophilus HB8中提取而得，改酶在高溫和MnCl2條件下，能有效地逆轉(zhuǎn)錄RNA；當(dāng)加入Mg2+后，該酶的聚合活性大大增加，從而使cDN

24、A合成與擴(kuò)增可用一種酶催化。 2、 高保真DNA聚合酶 pfu DNA 聚合酶 是從Pyrococcus furiosis中精制而成的高保真耐高溫DNA聚合酶，它不具有5'-3'外切酶活性，但具有3'-5'外切酶活性，可校正過(guò)程中產(chǎn)生的錯(cuò)誤，使產(chǎn)物的堿基錯(cuò)配率極低。PCR產(chǎn)物為平端，無(wú)3'端突出的單A核苷酸。 Vent DNA 聚合酶 改酶是從Litoralis棲熱球菌中分離出的，不具有5'-3'外切酶活性，但具有3'-5'外切酶活性，可以去除錯(cuò)配的堿基，具有校對(duì)功能。 3、 DNA序列測(cè)定中應(yīng)用的耐熱DNA聚合酶 Pro

25、mega公司測(cè)序級(jí)TaqDNA聚合酶 是在TaqDNA聚合酶的基礎(chǔ)上對(duì)它進(jìn)行修飾，去除5'-3'外切酶活性，保證測(cè)序記過(guò)的高度準(zhǔn)確性，可產(chǎn)生強(qiáng)度均一的測(cè)序條帶，背景清晰。 Bca Best DNA 聚合酶 從Bacillus Caldotenax YT-G菌株中提純，并使其5'-3'外切酶活性缺失的DNA聚合酶。它的伸長(zhǎng)性能優(yōu)越；可抑制DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)形成，可以得到均一的DNA測(cè)序帶。 Sac DNA 聚合酶 從酸熱浴流化裂片菌中分離，無(wú)3'-5'外切酶活性，可用于DNA測(cè)序，但測(cè)序反應(yīng)中ddNTP/dNTP的比率要高。DNA連接酶（DNA lig

26、ase） DNA連接酶是1967年在三個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)發(fā)現(xiàn)的，最初是在大腸桿菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的。它是一種封閉DNA 鏈上缺口酶，借助或水解提供的能量催化DNA鏈的5'-PO4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必須是與同一條互補(bǔ)鏈配對(duì)結(jié)合的(除外)，而且必須是兩條緊鄰DNA鏈才能被DNA連接酶催化成磷酸二酯鍵。DNA連接酶主要用于，將由限制性核酸內(nèi)切酶“剪”出的粘性末端重新組合，故也稱“基因針線”。 在大腸桿菌及其他細(xì)菌中，DNA連接酶催化的連接反應(yīng)是利用NAD+做能源的；而在動(dòng)物細(xì)胞及噬菌體中，是利用ATP作能源。DNA連接酶并不能連接兩條單鏈的DNA分子或環(huán)化的單鏈

27、DNA分子，被連接的DNA鏈必須是雙螺旋的一部分。實(shí)際上，DNA連接酶是封閉雙螺旋DNA骨架上的切口（nick)，即在雙鏈DNA的某一條鏈上的兩個(gè)相鄰核苷酸之間失去一個(gè)磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈斷裂 大腸桿菌DNA連接酶：只能催化雙鏈DNA的互補(bǔ)粘性末端，以NAD為能量；T4噬菌體連接酶：粘性、平末端均可連接，以ATP為能量。從分子動(dòng)力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢得多T4DNA連接酶T4DNA連接酶是ATP依賴的DNA連接酶，催化兩條DNA雙鏈上相鄰的5磷酸基和3羥基之間形成磷酸二酯鍵?？山与p鏈DNA

28、的平末端、相容粘末端及其中的單鏈切口，在中有廣泛的應(yīng)用。T4DNA連接酶是經(jīng)原核表達(dá)，純化獲得的高純T4DNA接酶，顯示為一條62kD的蛋白條帶。本品附帶10xLigationBuffer含有ATP。適用于DNA片斷接、克隆等各種反應(yīng)。 內(nèi)容與儲(chǔ)存方法名稱:T4DNALigase :20ml 保存條件:-20 名稱:10xLigationBuffer 數(shù)量:100ml 保存:-20 T4DNA接酶活性為3u/ml，單位定為Weiss（0.01Weiss單位活性的T4DNA接酶在16時(shí)20ml體系反應(yīng)20分鐘，可以連接95%的1gDNA-HindIII的酶切物）。無(wú)DNA外切酶或內(nèi)切酶活性?？蛇M(jìn)行50次以上常規(guī)DNA接反應(yīng)。低溫運(yùn)輸，-20保存。有效期6個(gè)月。 10×LigationBuffer： Tris-HClpH7.8600mM MgCl215mM DTT100mM ATP10mM 連接條件推薦在1020ml反應(yīng)體系中進(jìn)行接反應(yīng)，反應(yīng)中DNA最大可達(dá)1mM（1kbDNA約1mg/ml