實驗四、原生質(zhì)體的分離效率、體積和表面積測定

1、實驗四、實驗四、 原生質(zhì)體的分離效率、體積和原生質(zhì)體的分離效率、體積和表面積的測定表面積的測定1、掌握原生質(zhì)的分離和提純技術(shù)；2、原生質(zhì)體積和表面積的測定；3、分離效率的測定（目視法和熒光雙醋酸酯法）實驗?zāi)康模簩嶒災(zāi)康模簩嶒炘韺嶒炘碓|(zhì)體的研究是近年來在生物學(xué)中比較活躍的領(lǐng)域之一。原生質(zhì)體的研究是近年來在生物學(xué)中比較活躍的領(lǐng)域之一。原生質(zhì)體（原生質(zhì)體（ProtoplastProtoplast）一詞的使用始自一詞的使用始自Hanstein(1880), 是指：是指：“用質(zhì)壁分離能夠和細胞壁分開的那部分物質(zhì)組成了一個原生質(zhì)體用質(zhì)壁分離能夠和細胞壁分開的那部分物質(zhì)組成了一個原生質(zhì)體”或或“除去

2、了全部細胞壁的細胞除去了全部細胞壁的細胞”，“一個為質(zhì)膜所包圍的裸露細胞一個為質(zhì)膜所包圍的裸露細胞”。原生質(zhì)體的分離和提純是植物生理學(xué)、細胞生物學(xué)中的一項基本技術(shù)。原生質(zhì)體的分離和提純是植物生理學(xué)、細胞生物學(xué)中的一項基本技術(shù)。利用制備的原生質(zhì)體可進行離體培養(yǎng)、全能性表達、細胞壁再生、質(zhì)利用制備的原生質(zhì)體可進行離體培養(yǎng)、全能性表達、細胞壁再生、質(zhì)膜特性，以及各種細胞操作（如原生體融合）、遺傳操作（如外源基膜特性，以及各種細胞操作（如原生體融合）、遺傳操作（如外源基因的導(dǎo)入）等，廣泛應(yīng)用于抗性生理、病性生理和細胞融合等領(lǐng)域。因的導(dǎo)入）等，廣泛應(yīng)用于抗性生理、病性生理和細胞融合等領(lǐng)域。 早期分離制備

3、原生質(zhì)體采用早期分離制備原生質(zhì)體采用機械法機械法。其。其缺點缺點是：是： （1）手續(xù)繁多，得率少；）手續(xù)繁多，得率少； （2）材料局限于具有較大液泡的細胞或長形細胞的組）材料局限于具有較大液泡的細胞或長形細胞的組織，如葉片、球莖的鱗片，果實表皮等?？?，如葉片、球莖的鱗片，果實表皮等。 直到直到1960年，年，Cocking 試用試用酶解法酶解法制備番茄原生質(zhì)制備番茄原生質(zhì)體首次獲得成功。體首次獲得成功。 其原理是細胞壁的組成物質(zhì)主要有纖維素、半纖維素其原理是細胞壁的組成物質(zhì)主要有纖維素、半纖維素和果膠等，利用和果膠等，利用纖維素酶和果膠酶纖維素酶和果膠酶等在一定的條件下等在一定的條件下可將細胞

4、壁的組成物質(zhì)分解掉，使得原生質(zhì)體游離出可將細胞壁的組成物質(zhì)分解掉，使得原生質(zhì)體游離出來。來。 圖1、利用酶解法獲得的蠶豆葉片細胞原生質(zhì)體A Root400 B Leaf400圖圖2 大豆幼苗根和葉片原生質(zhì)體的分離和純化大豆幼苗根和葉片原生質(zhì)體的分離和純化實驗材料實驗材料 未經(jīng)抗寒未經(jīng)抗寒鍛煉的小鍛煉的小麥幼苗麥幼苗 抗寒鍛煉抗寒鍛煉的小麥幼的小麥幼苗。苗。 儀器與藥品儀器與藥品光學(xué)顯微鏡、培養(yǎng)箱、血球計數(shù)板、計數(shù)器、物鏡和目鏡測微尺、小搖床、離心機、酸度計。纖維素酶、果膠酶、山梨醇、KCl、 CaCl2、山梨醇、金鋼砂。實驗步驟實驗步驟（1 1）酶液配制：）酶液配制： 根據(jù)酶液用量，用冰冷的含

5、5mmol/L KCl、5mmol/L CaCl2、0.6mol/L山梨醇等滲溶液配制含1.5% 纖維素酶、0.5%果膠酶的溶液（用于分離未經(jīng)鍛煉的植物組織，經(jīng)鍛煉的植物組織用0.9mol/L 山梨醇等滲溶液配制），攪拌溶解，用1N HCl調(diào)pH至5.5, 1500g離心10分鐘，上清液（酶液）冷貯備用。等滲溶液（適用于等滲溶液（適用于鍛煉和非鍛煉材料鍛煉和非鍛煉材料2種）種）酶液（適用于鍛煉和酶液（適用于鍛煉和非鍛煉材料非鍛煉材料2種）種）原生體的分離：原生體的分離：（1）取小麥葉片（挑大者），去除尖端和基部后（中段）稱取0.5克；（2）置于培養(yǎng)皿中加入少量金鋼砂，用毛刷刷去表皮角質(zhì)層，經(jīng)自

6、來水沖洗后用濾紙吸干，葉面呈均勻水漬狀即可；（3）用鋒利剪刀或刀片將其制成2mm長的小段，放入100ml燒杯中加入10 ml酶液；（4）置于33-35C的培養(yǎng)箱內(nèi)的小搖床上（約30-40rpm）培養(yǎng)3h, 或靜置培養(yǎng)5h左右；（5）混合物經(jīng)雙層紗布過濾，以去除組織的殘余物，用500rpm離心3-5min, 小心果斷棄去上清液；（6）小心懸浮沉淀物，加相應(yīng)等滲溶液5ml稀釋；（7）再離心一次，去上清液，小心懸浮，用等滲溶液定容 至一定體積(0.2-0.5 ml, 具體視原生質(zhì)體數(shù)量而定）。計數(shù)和測定分離效率：計數(shù)和測定分離效率：熟悉血球計數(shù)板的使用和計數(shù)方法，按下列要求進行計數(shù)： （a) 洗凈、

7、涼干計數(shù)板； (b) 上板均勻； (c) 以綠、亮、圓形的原生質(zhì)體為有活力的； (d) 同區(qū)域計數(shù)要設(shè)重復(fù)（10個左右）。因而可計算出每克鮮重葉片所分離出的原生質(zhì)體數(shù)(單位：個/g FW)。血球計數(shù)板的總體積為：0.30.3（長）（長） 0.30.3（寬）（寬） 0.010.01（厚）（厚）=0.0009(cm=0.0009(cm3 3) ) 原生質(zhì)體表面積（原生質(zhì)體表面積（SA）和體積（）和體積（V）的）的測定測定目鏡和物鏡測微尺的校正（?m/格目鏡）；離體原生質(zhì)體在等滲溶液中呈圓球形;計數(shù)要設(shè)重復(fù)（10個左右）懸浮于等滲溶液中的原生質(zhì)體的表面積和體積，可通過在高倍光學(xué)顯微鏡下用目鏡和物鏡測

8、微尺測量其直徑(D)而求得。為了便于在冰凍過程中對植物細胞的脫植物細胞的脫水情況和原生體失去滲透反應(yīng)能力水情況和原生體失去滲透反應(yīng)能力進行定量的研究。 SA=4（D/2）2 V=4(D/2)3/3 圖3 物鏡測微尺示意圖4 目鏡測微尺示意圖5 目、物鏡測微尺校準(zhǔn)示意（舉例）提純：提純：可采用離心洗滌法和漂浮法兩種方法。離心洗滌法就是重復(fù)（二）中離心、棄上清、懸浮沉淀、加等滲液再離心、再棄上清和懸浮沉淀的過程，鏡檢直至滿意為止。其優(yōu)點是省事，但缺點是比原生質(zhì)體重的雜質(zhì)（如金鋼砂）去不掉。漂浮法：加4ml左右17%蔗糖溶液（用于未經(jīng)鍛煉的植物材料，鍛煉材料用23%的蔗糖溶液）于離心管中，再用彎頭吸管緩 慢加入等體積的 0.6mol/L山梨醇溶液（用于未經(jīng)鍛煉的植物材料，鍛煉材料用0.9mol/L山梨醇溶液）,使兩溶液間建立界面層，用彎頭吸管把1/3