動(dòng)物性食品大腸菌群計(jì)數(shù)

1、動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定 知識(shí)目標(biāo)：知識(shí)目標(biāo)： 理解大腸菌群的測(cè)定意義。理解大腸菌群的測(cè)定意義。 了解了解MPNMPN計(jì)數(shù)法和平板計(jì)數(shù)法的區(qū)別。計(jì)數(shù)法和平板計(jì)數(shù)法的區(qū)別。 掌握動(dòng)物性食品大腸菌群掌握動(dòng)物性食品大腸菌群MPNMPN計(jì)數(shù)法。計(jì)數(shù)法。 能力目標(biāo)：能力目標(biāo)： 會(huì)進(jìn)行初發(fā)酵試驗(yàn)和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)方法。會(huì)進(jìn)行初發(fā)酵試驗(yàn)和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)方法。 會(huì)查會(huì)查MPNMPN檢索表并正確報(bào)告結(jié)果。檢索表并正確報(bào)告結(jié)果。 動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定n 大腸菌群：大腸菌群：系在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的系在一定

2、培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。n 大腸菌群包括許多生化及血清學(xué)特性均很不相同的細(xì)菌，大腸菌群包括許多生化及血清學(xué)特性均很不相同的細(xì)菌，其中有埃希氏菌屬、枸椽酸菌屬、腸桿菌屬和克雷伯氏菌其中有埃希氏菌屬、枸椽酸菌屬、腸桿菌屬和克雷伯氏菌屬等，以埃希氏菌屬為主。屬等，以埃希氏菌屬為主。 動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定n 生產(chǎn)實(shí)踐中為嚴(yán)格監(jiān)控消化道傳染病的病原菌和引起食生產(chǎn)實(shí)踐中為嚴(yán)格監(jiān)控消化道傳染病的病原菌和引起食物中毒的病原菌污染，常用某些指示菌來(lái)評(píng)定食品的衛(wèi)物中毒的病原菌污染，

3、常用某些指示菌來(lái)評(píng)定食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推測(cè)病原微生物污染的可能性。生質(zhì)量，推測(cè)病原微生物污染的可能性。n 作為指示菌，應(yīng)是人和動(dòng)物腸道內(nèi)特有的細(xì)菌，在腸道作為指示菌，應(yīng)是人和動(dòng)物腸道內(nèi)特有的細(xì)菌，在腸道內(nèi)占有極高的數(shù)量，盡管少量存在，也能用簡(jiǎn)單方法快內(nèi)占有極高的數(shù)量，盡管少量存在，也能用簡(jiǎn)單方法快速準(zhǔn)確地檢查出來(lái)，對(duì)不良因素的抵抗力應(yīng)與腸道致病速準(zhǔn)確地檢查出來(lái)，對(duì)不良因素的抵抗力應(yīng)與腸道致病菌相同。菌相同。 動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定1和腸道致病菌和腸道致病菌的來(lái)源相同的來(lái)源相同3檢驗(yàn)方法比較檢驗(yàn)方法比較簡(jiǎn)便簡(jiǎn)便2在外界環(huán)境中在外界環(huán)境中的生存時(shí)間

4、長(zhǎng)的生存時(shí)間長(zhǎng)指示菌的條件指示菌的條件動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定n 人們通過(guò)大量研究發(fā)現(xiàn)，大腸菌群的來(lái)源與腸道致病菌相人們通過(guò)大量研究發(fā)現(xiàn)，大腸菌群的來(lái)源與腸道致病菌相同，均來(lái)源于人和溫血?jiǎng)游锏募S便中，且在外界環(huán)境中的同，均來(lái)源于人和溫血?jiǎng)游锏募S便中，且在外界環(huán)境中的生存時(shí)間也與主要腸道致病菌一致，在數(shù)量和檢驗(yàn)方面均生存時(shí)間也與主要腸道致病菌一致，在數(shù)量和檢驗(yàn)方面均符合指示菌的三項(xiàng)要求。我國(guó)近年來(lái)有人研究了人、畜、符合指示菌的三項(xiàng)要求。我國(guó)近年來(lái)有人研究了人、畜、禽類禽類104104份糞便，結(jié)果大腸菌群檢出率為份糞便，結(jié)果大腸菌群檢出率為88.8

5、88.8100%100%。因。因此，用大腸菌群作為標(biāo)志食品是否已被腸道致病菌污染及此，用大腸菌群作為標(biāo)志食品是否已被腸道致病菌污染及其污染的程度的指標(biāo)菌是合適的。其污染的程度的指標(biāo)菌是合適的。 大腸菌群作為指示菌的原因大腸菌群作為指示菌的原因動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定n 大腸菌群作為食品的指示菌即是說(shuō)：在食品中存在的大腸大腸菌群作為食品的指示菌即是說(shuō)：在食品中存在的大腸菌群數(shù)量越多，表示該食品受糞便污染的程度越大，也就菌群數(shù)量越多，表示該食品受糞便污染的程度越大，也就相應(yīng)地表示該食品被腸道致病菌污染的可能性也就越大。相應(yīng)地表示該食品被腸道致病菌污

6、染的可能性也就越大。為確保食品的衛(wèi)生質(zhì)量，就必須要求盡可能使大腸菌群的為確保食品的衛(wèi)生質(zhì)量，就必須要求盡可能使大腸菌群的數(shù)量降低到最小的程度，因?yàn)橐笫称分型耆淮嬖诖竽c數(shù)量降低到最小的程度，因?yàn)橐笫称分型耆淮嬖诖竽c菌群實(shí)際上是不可能的，重要的是它的污染程度。菌群實(shí)際上是不可能的，重要的是它的污染程度。動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定n 大腸菌群數(shù)量的表示方法有兩種：大腸菌群數(shù)量的表示方法有兩種：n 大腸菌群大腸菌群MPNMPN：大腸菌群大腸菌群MPNMPN是采用一定的方法，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)是采用一定的方法，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)的原理所測(cè)定和計(jì)算出的一種最近似數(shù)值。

7、學(xué)的原理所測(cè)定和計(jì)算出的一種最近似數(shù)值。n 大腸菌群值：大腸菌群值：大腸菌群值是指在食品中檢出一個(gè)大腸菌群大腸菌群值是指在食品中檢出一個(gè)大腸菌群細(xì)菌時(shí)所需要的最少樣品量。故大腸菌群值越大，表示食細(xì)菌時(shí)所需要的最少樣品量。故大腸菌群值越大，表示食品中所含的大腸菌群細(xì)菌的數(shù)量越少，食品的衛(wèi)生質(zhì)量也品中所含的大腸菌群細(xì)菌的數(shù)量越少，食品的衛(wèi)生質(zhì)量也就越好。就越好。大腸菌群數(shù)量的表示方法大腸菌群數(shù)量的表示方法動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定大腸菌群大腸菌群MPNMPN 原理：原理： MPNMPN（most probable numbermost probabl

8、e number）最可能數(shù)，基于泊松分布）最可能數(shù)，基于泊松分布的一種間接計(jì)數(shù)方法。的一種間接計(jì)數(shù)方法。 大腸菌群大腸菌群MPNMPN是指是指100g100g（mLmL）食品檢樣中所含的大腸菌群）食品檢樣中所含的大腸菌群的最近似數(shù)或最可能數(shù)。的最近似數(shù)或最可能數(shù)。動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定n 檢驗(yàn)依據(jù)：GB4789.3-2010 大腸菌群大腸菌群MPNMPN的常規(guī)檢驗(yàn)方法的常規(guī)檢驗(yàn)方法 動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定大腸菌群大腸菌群MPNMPN的測(cè)定方法的測(cè)定方法 測(cè)定方法測(cè)定方法大腸菌群 MPN計(jì)數(shù)法

9、n大腸菌群平板計(jì)數(shù)法。 動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定初發(fā)酵試驗(yàn)復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告樣品的稀釋一、大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定1.1.樣品的稀釋樣品的稀釋n 固體和半固體樣品：固體和半固體樣品：稱取稱取25g25g樣品，放入盛有樣品，放入盛有225mL225mL磷酸鹽磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min8000r/min10000r/min10000r/min均質(zhì)均質(zhì)1min1min2min2min。n 液體樣品：液體樣品：以無(wú)菌吸管吸

10、取以無(wú)菌吸管吸取25mL25mL樣品置盛有樣品置盛有225mL225mL磷酸鹽磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶 （瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分混勻，制成無(wú)菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:101:10的樣品勻液。的樣品勻液。動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定1.1.樣品的稀釋樣品的稀釋n 樣品勻液的pH值應(yīng)在6.57.5之間。n 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。n 從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過(guò)程不得超過(guò)15min。動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)

11、定動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定2.2.初發(fā)酵試驗(yàn)初發(fā)酵試驗(yàn)n 選擇選擇3 3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液，每個(gè)稀釋度接種樣品勻液，每個(gè)稀釋度接種3 3 管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LSTLST）肉湯，每管接種）肉湯，每管接種1mL1mL（如接種量超過(guò)如接種量超過(guò)1 mL1 mL，則用雙，則用雙料料LSTLST肉湯）。肉湯）。n 培養(yǎng)：培養(yǎng)：3636士士ll，24h24h士士2h2h動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定n 觀察產(chǎn)氣情況n 產(chǎn)氣者，陽(yáng)性管。動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)

12、定月桂基硫酸鹽胰蛋白月桂基硫酸鹽胰蛋白( (月示月示)(LST)(LST)肉湯肉湯用用 途：途：用于多管發(fā)酵法測(cè)定大腸菌群和糞大腸用于多管發(fā)酵法測(cè)定大腸菌群和糞大腸菌群菌群(SN0169-92)(SN0169-92)。原原 理：理：胰蛋白胨提供碳源和氮源滿足細(xì)菌生長(zhǎng)胰蛋白胨提供碳源和氮源滿足細(xì)菌生長(zhǎng)的需求；氯化鈉可維持均衡的滲透壓；乳糖是的需求；氯化鈉可維持均衡的滲透壓；乳糖是大腸菌群可發(fā)酵的糖類；磷酸二氫鉀和磷酸氫大腸菌群可發(fā)酵的糖類；磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀是緩沖劑；月桂基硫酸鈉可抑制非大腸菌二鉀是緩沖劑；月桂基硫酸鈉可抑制非大腸菌群細(xì)菌的生長(zhǎng)。群細(xì)菌的生長(zhǎng)。 配方（每升）：配方（每升）：胰

13、酪胨胰酪胨 20g20g；氯化鈉；氯化鈉 5g5g；乳糖；乳糖 5g5g；磷酸二氫鉀；磷酸二氫鉀 2.75g2.75g；磷酸氫二鉀；磷酸氫二鉀 2.75g2.75g；月桂基硫酸鈉月桂基硫酸鈉0.1g0.1g；最終；最終pH6.8pH6.80.20.2動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定3.3.復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)n 試驗(yàn)方法：試驗(yàn)方法：用接種環(huán)從產(chǎn)氣的用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LSTLST肉湯管中分別取培養(yǎng)物肉湯管中分別取培養(yǎng)物1 1環(huán)，移種環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLBBGLB）管）管中。中。n 培養(yǎng)：培養(yǎng)：36 36 1 1 ，48 h

14、48 h2 h2 h。煌綠乳糖膽鹽（BGLG）肉湯管中動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定n 觀察產(chǎn)氣情況n 產(chǎn)氣者，計(jì)為大腸菌群陽(yáng)性管。動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定4.4.大腸菌群最可能數(shù)（大腸菌群最可能數(shù)（MPNMPN）的報(bào)告）的報(bào)告n 根據(jù)復(fù)發(fā)酵確證的大腸菌群根據(jù)復(fù)發(fā)酵確證的大腸菌群LSTLST陽(yáng)性管數(shù)，檢索陽(yáng)性管數(shù)，檢索MPNMPN表，報(bào)表，報(bào)告每告每g g（mLmL）樣品中大腸菌群的）樣品中大腸菌群的MPNMPN值。值。動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定平板計(jì)數(shù)

15、平板菌落數(shù)的選擇證實(shí)試驗(yàn)樣品的稀釋結(jié)果報(bào)告二、大腸菌群平板計(jì)數(shù)法二、大腸菌群平板計(jì)數(shù)法 動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定1.1.樣品的稀釋樣品的稀釋n 同大腸菌群同大腸菌群MPNMPN計(jì)數(shù)法中樣品稀釋方法相同。計(jì)數(shù)法中樣品稀釋方法相同。動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定2.2.平板計(jì)數(shù)平板計(jì)數(shù)n 選取選取2 2個(gè)個(gè)3 3個(gè)適宜連續(xù)稀釋度個(gè)適宜連續(xù)稀釋度, , 每個(gè)稀釋度接種每個(gè)稀釋度接種2 2個(gè)無(wú)菌平皿個(gè)無(wú)菌平皿，每皿，每皿1mL1mL。同時(shí)取。同時(shí)取1mL1mL生理鹽水加入無(wú)菌平皿作空白對(duì)照。生理鹽水加入無(wú)菌平

16、皿作空白對(duì)照。n 及時(shí)將及時(shí)將15 mL15 mL20 mL20 mL冷至冷至4646的的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBAVRBA）約傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分約傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL3mL4mLVRBA4mLVRBA覆蓋平板表層。覆蓋平板表層。n 培養(yǎng)：36 士l，18h24h.n 觀察結(jié)果。動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBAVRBA） 用途：用于大腸菌群固體平板檢測(cè)。用途：用

17、于大腸菌群固體平板檢測(cè)。原理：蛋白胨和酵母粉提供碳氮源和微量原理：蛋白胨和酵母粉提供碳氮源和微量元素；乳糖是可發(fā)酵的糖類；氯化鈉可維元素；乳糖是可發(fā)酵的糖類；氯化鈉可維持均衡的滲透壓；膽鹽和結(jié)晶紫抑制革蘭持均衡的滲透壓；膽鹽和結(jié)晶紫抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，特別抑制革蘭氏陽(yáng)性桿菌和糞氏陽(yáng)性菌，特別抑制革蘭氏陽(yáng)性桿菌和糞鏈球菌；中性紅為鏈球菌；中性紅為pHpH指示劑。指示劑。 配方（每升）：蛋白胨配方（每升）：蛋白胨7g7g；酵母浸膏；酵母浸膏3g3g；乳糖乳糖10g10g；氯化鈉；氯化鈉5g5g；三號(hào)膽鹽；三號(hào)膽鹽1.5g1.5g；中；中性紅性紅0.03g0.03g；結(jié)晶紫；結(jié)晶紫0.002g0.00

18、2g；瓊脂；瓊脂15g15g；最；最終終pH7.4pH7.40.20.2。動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定n 典型菌落：紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5 mm 或更大。大腸菌群在大腸菌群在VRBAVRBA上菌落特征上菌落特征n 不典型菌落：不典型菌落：粉紅色菌落。粉紅色菌落。動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定動(dòng)物性食品大腸菌群測(cè)定3.3.平板菌落數(shù)的選擇平板菌落數(shù)的選擇n 選取菌落數(shù)在選取菌落數(shù)在15CFU15CFU150CFU150CFU之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。動(dòng)物檢疫