研究生儀器分析-液相色譜

1、一、色譜的起源一、色譜的起源1903年，俄國(guó)植物學(xué)家Tswett研究植物葉子組成，用碳酸鈣作吸附劑，分離植物干燥葉子的石油醚萃取物，發(fā)現(xiàn)三種顏色六條色帶，他把這種色帶稱為“色譜”。1906年，發(fā)表于德國(guó)植物學(xué)雜志，屬于液固色譜法。色譜的發(fā)展： 1940年，液液分配色譜 1941年，氣相色譜可能性 1944，紙色譜 1949，薄層色譜 1952，氣相色譜 60年代，HPLC二、高效液相色譜法的優(yōu)點(diǎn)二、高效液相色譜法的優(yōu)點(diǎn)（1）分離效能高（2）選擇性高（3）檢測(cè)靈敏度高（4）分析速度快三、高效液相色譜法的分類三、高效液相色譜法的分類 按溶質(zhì)在兩相分離過(guò)程的物理化學(xué)原理分類 吸附色譜 分配色譜 離子

2、色譜 體積排阻色譜 親和色譜按溶質(zhì)在兩相分離過(guò)程的物理化學(xué)原理分類的各種液相色譜法的比較四、高效液相色譜結(jié)構(gòu)及流路介紹四、高效液相色譜結(jié)構(gòu)及流路介紹（一）流動(dòng)相（二）高壓輸液泵及梯度洗脫裝置（三）進(jìn)樣裝置（四）色譜柱（五）檢測(cè)器（一）流動(dòng)相 需過(guò)濾（一般0.45um膜） 膜：水膜/油膜 脫氣： 吹氦脫氣法；加熱回流法；抽真空脫氣法；超聲波脫氣法；在線真空脫氣法 關(guān)于溶劑混溶性，一般根據(jù)相似相溶原則，需要注意，極性相差大的不混溶，比如正己烷與甲醇。多元展開(kāi)劑，主體的兩種溶劑不能混溶，就需要通過(guò)第三種溶劑來(lái)調(diào)和。比如：石油醚、正庚烷、正已烷、戊烷、環(huán)已烷和甲醇、水之類的。 環(huán)已烷 :-0.2、石油

3、醚（類，3060）、石油醚（類，6090）、正已烷:0.0、甲苯:2.4、二甲苯:2.5、苯:2.7、二氯甲烷: 3.1、異丙醇:3.9、正丁醇:3.9、四氫呋喃:4.0、氯仿:4.1、乙醇:4.3、乙酸乙酯:4.4、甲醇:5.1、丙酮:5.1、乙腈: 5.8、乙酸:6.0、水:10.2（二）泵為什么需要泵？（壓力問(wèn)題） 低壓梯度（外梯度） 高壓梯度（內(nèi)梯度）（三）進(jìn)樣裝置： 停流進(jìn)樣裝置（壓力室溫；生物活性的生物分子室溫；二維色譜（五）檢測(cè)器 按檢測(cè)的對(duì)象分： 整體性質(zhì)檢測(cè)器：RID-折射率 ECD -電導(dǎo)率 噪聲大，不適合痕量分析和梯度洗脫噪聲大，不適合痕量分析和梯度洗脫 溶質(zhì)性質(zhì)檢測(cè)器：

4、UVD FLD（熒光檢測(cè)器） 流量和溫度不敏感，但不能使用有紫外吸收的流流量和溫度不敏感，但不能使用有紫外吸收的流動(dòng)相，可用于痕量分析和梯度洗脫動(dòng)相，可用于痕量分析和梯度洗脫按適用性分類：選擇性檢測(cè)器：UVD,FLD,ECD通用型檢測(cè)器： RID非破壞性檢測(cè)器：UVD,FLD,ECD, RID破壞性檢測(cè)器：熒光檢測(cè)器檢測(cè)器的性能指標(biāo) 噪聲 基線漂移 靈敏度（最小檢出濃度或最小檢出量）： 性噪比2時(shí)，單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入檢測(cè)器的溶質(zhì)的濃度或質(zhì)量。 線性范圍1、UVD 固定波長(zhǎng)紫外吸收檢測(cè)器 可變波長(zhǎng)紫外吸收檢測(cè)器 光二極管陣列檢測(cè)器（PDAD） 可變波長(zhǎng)紫外吸收檢測(cè)器，由于可選擇的波長(zhǎng)范圍很大，既提高

5、了檢測(cè)器的選擇性，又可選用組分的最靈敏吸收波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，從而提高了檢測(cè)的靈敏度。 還有停泵掃描的功能，可繪出組分的光吸收譜圖，以進(jìn)行吸收波長(zhǎng)的選擇。2、RID用于糖類測(cè)定等3、ECD電導(dǎo)率的變化是一種選擇性檢測(cè)器，用于檢測(cè)陽(yáng)離子或陰離子，在離子色譜中獲得廣泛應(yīng)用。電導(dǎo)率隨溫度變化，因此測(cè)量時(shí)要保持恒溫。4、熒光檢測(cè)器是利用某些溶質(zhì)在受紫外光激發(fā)后，能發(fā)射可見(jiàn)光（熒光）的性質(zhì)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)的。是一種具有高靈敏度和高選擇性的檢測(cè)器。不產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，可與熒光試劑反應(yīng)，制成可發(fā)生熒光的衍生物再進(jìn)行測(cè)定。用于藥物分析等。5、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器霧化過(guò)程；流動(dòng)相蒸發(fā)過(guò)程；檢測(cè)過(guò)程消除溶劑的干擾和因溫度變化引起的

6、基線漂移，特別適合于梯度洗脫。液相色譜與氣相色譜的比較HPLC使用前的準(zhǔn)備開(kāi)始前應(yīng)知道1 樣品的性質(zhì)樣品的性質(zhì) 所含化合物的數(shù)目 化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)（官能團(tuán)） 化合物的分子量，pKa值 化合物的UV光譜圖 化合物在樣品中的濃度范圍 樣品的溶解度2 分離目的分離目的樣品的性質(zhì)決定選用 HPLC 流動(dòng)相；色譜柱；檢測(cè)器 CE GC SFC TCL 色譜柱的選擇樣品的預(yù)處理與檢測(cè)預(yù)處理：預(yù)處理： 可直接進(jìn)樣的溶液； 需稀釋、pH緩沖、加入內(nèi)標(biāo)或其它定容操作的溶液； 必須首先溶解或提取處理的固體； 樣品需預(yù)處理以除去干擾物和/或保護(hù)色譜柱或儀器不受損害。（一般溶劑成分接近流動(dòng)相） 流動(dòng)相要抽濾、超聲脫氣，進(jìn)樣前樣品需過(guò)膜檢測(cè)檢測(cè)：UV DAD FLD (ECD) RID分離步驟等度分離：流動(dòng)相從強(qiáng)到弱梯度洗脫：分離更好，但基線漂移較大梯度洗脫1 不利使用梯度洗脫的情況不利使用梯度洗脫的情況某些HPLC檢測(cè)器（如RID）不能使用梯度洗脫；每次運(yùn)行梯度洗脫后需重新平衡色譜柱，耗時(shí)較長(zhǎng)；不同設(shè)備的分離結(jié)果可能不同，所以梯度洗脫法移置時(shí)會(huì)出現(xiàn)差異；梯度洗脫中的基線問(wèn)題更為嚴(yán)重，并且必須使用高純?nèi)軇荒承┥V柱/流動(dòng)相的聯(lián)合應(yīng)用不適于梯度洗脫；2 梯度洗脫的應(yīng)用梯度洗脫的應(yīng)用具有較寬