高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒說明書

1、精品文檔1 .柱平衡步驟：向吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）加入500壯的平衡液BL,12000rpm（13400g）離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（請(qǐng)使用當(dāng)天處理過的柱子）2 .取5-15ml過夜培養(yǎng)的菌液加入離心管中，12000rpm（13400g）離心1min，盡量吸除上清。注意：菌液較多時(shí)可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中，菌體量以能夠充分裂解為佳，過多的菌體裂解不充分會(huì)降低質(zhì)粒的提取效率。3 .向留有菌體沉淀的離心管中加入500山溶液Pl（請(qǐng)先檢查是否已加入RNaseA）,使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀。注意：請(qǐng)務(wù)必徹底懸浮細(xì)菌

2、沉淀，如果有未徹底混勻的菌塊會(huì)影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。質(zhì)粒4 .向離心管中加入500人溶液P2,溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。注意：溫和地混合不要?jiǎng)×艺鹗?，以免污染基因組DNA。此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠，所用時(shí)間不應(yīng)超過5min，以免質(zhì)粒受到破壞。如果未變得清亮，可能由于菌體過多，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。5 .向離心管中加入700山溶液P3,立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm（13400g）離心10min，此時(shí)在離心管底部形成沉淀。注意：P3加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。6 .將上

3、一步收集的上清液分次加入過濾柱Cs（過濾柱放入收集管中）,12000rpm（13400g）離心2min，小心地將離心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）,（如果過濾柱中有殘余的液體說明步驟5吸取的上清中雜質(zhì)過多，可以延長(zhǎng)離心的時(shí)間；如果離心后收集管底部有少量的沉淀盡量地吸取上清）。7 .12000rpm（13400g）離心lmin,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP4放入收集管中。8 .向吸附柱CP4中加入500人去蛋白液PQ12000rpm（13400g）離心lmin,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP4放入收集管中。9 .向吸附柱CP4中加入6005漂洗液PW（請(qǐng)先

4、檢查是否已加入無水乙醇），12000rpm（13400g）離心1min,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP4放入收集管中。注意：加入漂洗液PW后，如果室溫靜置2-5min,有助于更好地去除雜質(zhì)。10 .向吸附柱CP4中加入600dL漂洗液PW,12000rpm（13400g）離心lmin,倒掉收集管中的廢液。11 .將吸附柱CP4重新放回收集管中置于12000rpm（13400g）離心2min,目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。注意：漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實(shí)驗(yàn)。為確保下游實(shí)驗(yàn)不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱CP4開蓋，置于室溫放置數(shù)min，以徹底晾干吸附材料中殘余

5、的漂洗液。12 .將吸附柱自科置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100-300L洗脫緩沖液TB，室溫放置2min，12000rpm（13400g）離心lmin將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。注意：為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中重復(fù)步驟12。洗脫液的pH值對(duì)于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液，應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)（可以用NaOH將水的pH值調(diào)到此范圍），pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率。洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于100山，體積過小影響回收效率。且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20，以防DNA降解。質(zhì)粒DNA濃度及純度檢測(cè)：得到的質(zhì)粒DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度。電泳可能為單一條帶，也可能為2到3條DNA條帶，這主要與提取物培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短、提取時(shí)操作劇烈程度等有關(guān)。OD260值為l相當(dāng)于大約50闖/ml雙鏈DNA。OD260/0D28。比值應(yīng)為1.7-1.9，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會(huì)偏低，但并不表示純度低