電鏡酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)-七年制

1、 Electron microscopic cytochemistry technique生物電鏡技術(shù)生物電鏡技術(shù) 電鏡放射自顯影法電鏡放射自顯影法 電鏡免疫組織和細(xì)胞化學(xué)電鏡免疫組織和細(xì)胞化學(xué) 電鏡電鏡X X線微區(qū)分析線微區(qū)分析 糖類、脂類和糖類、脂類和酶類電鏡細(xì)胞化學(xué)酶類電鏡細(xì)胞化學(xué) 電鏡酶細(xì)胞化學(xué)電鏡酶細(xì)胞化學(xué) ( electron microscopic enzyme cytochemistry ) 在電鏡下通過(guò)酶的特異細(xì)胞化在電鏡下通過(guò)酶的特異細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)，顯示酶在細(xì)胞內(nèi)定位的方學(xué)反應(yīng)，顯示酶在細(xì)胞內(nèi)定位的方法。法。 * *一、電鏡酶細(xì)胞化學(xué)的基本步驟一、電鏡酶細(xì)胞化學(xué)的基本步驟1.

2、 1.取材和固定：取材和固定：n取材取材: :以以1mm1mm1mm1mm2mm2mm大小為宜。取材要大小為宜。取材要快。最好采用全身灌流或單一器官灌流的方快。最好采用全身灌流或單一器官灌流的方法，能較好地保存酶的活性及定位準(zhǔn)確。法，能較好地保存酶的活性及定位準(zhǔn)確。n固定固定: :固定劑要做到既保持酶活性，又保持細(xì)固定劑要做到既保持酶活性，又保持細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。胞的超微結(jié)構(gòu)。 4%4%多聚甲醛多聚甲醛0.5%0.5%戊二醛混合液戊二醛混合液 ( (用二甲砷酸鈉緩沖液配制）用二甲砷酸鈉緩沖液配制） 根據(jù)酶反應(yīng)的特性來(lái)選擇固定液。根據(jù)酶反應(yīng)的特性來(lái)選擇固定液。 固定時(shí)間因酶的種類而異，幾固定時(shí)間因

3、酶的種類而異，幾minmin至幾十至幾十h h。2.2.固定后漂洗：固定后漂洗：目的是去除醛類固定液。目的是去除醛類固定液。0.1mmol/L0.1mmol/L二甲砷酸鈉緩沖液二甲砷酸鈉緩沖液(pH7.4)(pH7.4)， ，2h2h或過(guò)夜?；蜻^(guò)夜。3.3.預(yù)切片預(yù)切片：采用恒冷箱切片或采用恒冷箱切片或振蕩切片振蕩切片，厚度，厚度為為404070m70m。4.4.預(yù)孵育預(yù)孵育: :目的是置換緩沖液。目的是置換緩沖液。將預(yù)切片置于無(wú)底物的孵育液內(nèi)，將預(yù)切片置于無(wú)底物的孵育液內(nèi)，2020,30min;,30min;用配制孵育液的緩沖液沖洗，用配制孵育液的緩沖液沖洗，44，次，次， 5 510min

4、/10min/次。次。5.5.孵育：孵育： 原理：原理： 酶分解酶分解 捕捉劑捕捉劑 底物底物初級(jí)產(chǎn)物初級(jí)產(chǎn)物 不溶性終產(chǎn)物不溶性終產(chǎn)物 在在振蕩式恒溫（振蕩式恒溫（3737）水浴箱）水浴箱中進(jìn)行。中進(jìn)行。 孵育時(shí)間長(zhǎng)短因不同實(shí)驗(yàn)而定孵育時(shí)間長(zhǎng)短因不同實(shí)驗(yàn)而定( (應(yīng)邊孵育邊應(yīng)邊孵育邊在光鏡下檢查在光鏡下檢查) ) 。6.6.孵育后漂洗：孵育后漂洗：目的是去除殘留物，尤其是鉛離子。目的是去除殘留物，尤其是鉛離子。 * *先用配孵育液的緩沖液漂洗，先用配孵育液的緩沖液漂洗， 44，次，次，min/min/次；次； * *再用再用0.1mmol/L0.1mmol/L二甲砷酸鈉緩沖液漂洗，二甲砷酸鈉

5、緩沖液漂洗，44，次，次; ; min/min/次。次。7.7.后固定：后固定：1%1%鋨酸，鋨酸，44，h h。8.8.脫水及包埋脫水及包埋：乙醇、丙酮系列脫水；環(huán)氧乙醇、丙酮系列脫水；環(huán)氧樹(shù)脂包埋。樹(shù)脂包埋。9.9.超薄切片：超薄切片：取厚切片表面酶反應(yīng)充分的部取厚切片表面酶反應(yīng)充分的部分，切片厚度為分，切片厚度為707090nm90nm，用，用鎳網(wǎng)或金網(wǎng)鎳網(wǎng)或金網(wǎng)撈片。撈片。10.10.電子染色：電子染色：注意注意要排除染色對(duì)細(xì)胞化學(xué)反要排除染色對(duì)細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物的干擾后，再進(jìn)行染色應(yīng)產(chǎn)物的干擾后，再進(jìn)行染色( (可單染或不可單染或不染色染色) ) 。 二、常見(jiàn)的酶及其在細(xì)胞中的定位二、

6、常見(jiàn)的酶及其在細(xì)胞中的定位 酸性磷酸酸性磷酸酶酶溶酶體溶酶體 堿性磷酸酶堿性磷酸酶細(xì)胞膜細(xì)胞膜 ATPATP酶酶細(xì)胞膜細(xì)胞膜 葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸酶磷酸酶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 琥珀酸脫氫酶琥珀酸脫氫酶線粒體內(nèi)膜、嵴線粒體內(nèi)膜、嵴 單胺氧化酶單胺氧化酶線粒體外膜、嵴線粒體外膜、嵴 細(xì)胞色素氧化酶細(xì)胞色素氧化酶線粒體線粒體 過(guò)氧化氫酶過(guò)氧化氫酶微體微體 焦磷酸硫胺素酶焦磷酸硫胺素酶高爾基體高爾基體 髓過(guò)氧化物酶髓過(guò)氧化物酶粒細(xì)胞及單核細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、粒細(xì)胞及單核細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、 核膜、高爾基體核膜、高爾基體 乙酰膽堿酯酶乙酰膽堿酯酶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核膜、突觸間隙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核膜、突觸間隙 5-5-核苷酸酶核苷酸酶質(zhì)膜質(zhì)

7、膜三、電鏡酶細(xì)胞化學(xué)的注意事項(xiàng)三、電鏡酶細(xì)胞化學(xué)的注意事項(xiàng)n固定液的純度：戊二醛需用活性碳處固定液的純度：戊二醛需用活性碳處理純化理純化2 23 3次，次，44保存。保存。 n孵育液：孵育液的成份比例要嚴(yán)格。孵育液：孵育液的成份比例要嚴(yán)格。配制的試劑要用化學(xué)純配制的試劑要用化學(xué)純(GR)(GR)或分析純或分析純(AR)(AR)。最好是進(jìn)口試劑最好是進(jìn)口試劑。要現(xiàn)用現(xiàn)配，。要現(xiàn)用現(xiàn)配，按配方順序加入各試劑，并隨時(shí)攪拌；按配方順序加入各試劑，并隨時(shí)攪拌；用新鮮雙蒸水配制；使用前經(jīng)雙層濾用新鮮雙蒸水配制；使用前經(jīng)雙層濾紙過(guò)濾紙過(guò)濾, , 配好后調(diào)整配好后調(diào)整pHpH值。值。n孵育對(duì)照孵育對(duì)照：1.

8、1. 孵育液中去除底物孵育液中去除底物。 2. 2. 孵育液中加入底物抑制劑。孵育液中加入底物抑制劑。 3. 3. 使酶失活或加入酶活性抑制劑。使酶失活或加入酶活性抑制劑。 4. 4. 用酶活性激動(dòng)劑。用酶活性激動(dòng)劑。n孵育后標(biāo)本處理：孵育后標(biāo)本處理： 后固定時(shí)間要小于后固定時(shí)間要小于1h1h，以免組織變，以免組織變脆；脫水時(shí)間要縮短；電子染色前脆；脫水時(shí)間要縮短；電子染色前要先觀察未染色的切片，確定有無(wú)要先觀察未染色的切片，確定有無(wú)干擾。干擾。n 所用器皿要清潔干凈，避免和金所用器皿要清潔干凈，避免和金屬接觸。屬接觸。電鏡線顯微分析技術(shù)電鏡線顯微分析技術(shù) electron microscop

9、ic X-ray microanalysis 利用電鏡中具有一定能量的細(xì)聚焦電利用電鏡中具有一定能量的細(xì)聚焦電子束轟擊生物樣品的某一微小區(qū)域，使其子束轟擊生物樣品的某一微小區(qū)域，使其內(nèi)部各元素分別激發(fā)出不同波長(zhǎng)或不同能內(nèi)部各元素分別激發(fā)出不同波長(zhǎng)或不同能量的特征量的特征X X線。線。 通過(guò)檢測(cè)特殊通過(guò)檢測(cè)特殊X X線的能量和波長(zhǎng)來(lái)確線的能量和波長(zhǎng)來(lái)確定微區(qū)中元素的性質(zhì)，進(jìn)行定性分析；通定微區(qū)中元素的性質(zhì)，進(jìn)行定性分析；通過(guò)檢測(cè)特征過(guò)檢測(cè)特征X X線的強(qiáng)度來(lái)確定微區(qū)中各元線的強(qiáng)度來(lái)確定微區(qū)中各元素的含量，進(jìn)行定量分析的技術(shù)素的含量，進(jìn)行定量分析的技術(shù)。一、基本原理一、基本原理 ( (一一)X)X

10、線的產(chǎn)生：線的產(chǎn)生： X X線是線是18951895年倫琴發(fā)現(xiàn)的波長(zhǎng)范圍年倫琴發(fā)現(xiàn)的波長(zhǎng)范圍0.10.1100100 的的電磁輻射，分為特征電磁輻射，分為特征X X線和連續(xù)線和連續(xù)X X線。線。1. 1.特征特征X X線線 入射電子轟擊樣品，使其原子內(nèi)殼層發(fā)生電離入射電子轟擊樣品，使其原子內(nèi)殼層發(fā)生電離產(chǎn)生空位，由外殼層電子填補(bǔ)空位時(shí)，以輻射產(chǎn)生空位，由外殼層電子填補(bǔ)空位時(shí)，以輻射的形式釋放出來(lái)的能量稱為特征的形式釋放出來(lái)的能量稱為特征X X線。線。 原子由原子核原子由原子核(質(zhì)子、中子質(zhì)子、中子)和核外電子組成。和核外電子組成。 * * 核外電子位于殼層上（核外電子位于殼層上（K K、L L

11、、MM、NN等殼層）；等殼層）； * * 每個(gè)殼層還可分為若干亞殼層；每個(gè)殼層還可分為若干亞殼層； * * 靠近原子核的殼層能量最低?？拷雍说臍幽芰孔畹?。特征特征X X線產(chǎn)生過(guò)程與條件線產(chǎn)生過(guò)程與條件n基態(tài)基態(tài): :在正常情況下核外電子首先占據(jù)低能在正常情況下核外電子首先占據(jù)低能級(jí)的殼層，這時(shí)原子的能量最低，處于穩(wěn)定級(jí)的殼層，這時(shí)原子的能量最低，處于穩(wěn)定狀態(tài)稱為基態(tài)。狀態(tài)稱為基態(tài)。n電離電離: :當(dāng)入射電子轟擊樣品時(shí)，原子內(nèi)殼層當(dāng)入射電子轟擊樣品時(shí)，原子內(nèi)殼層失去電子出現(xiàn)電子空位，這個(gè)現(xiàn)象稱為電離。失去電子出現(xiàn)電子空位，這個(gè)現(xiàn)象稱為電離。n激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài): :發(fā)生電離時(shí)，原子因吸收了外界的

12、發(fā)生電離時(shí)，原子因吸收了外界的能量而使總能量上升，處于不穩(wěn)定狀態(tài)，這能量而使總能量上升，處于不穩(wěn)定狀態(tài)，這時(shí)稱為激發(fā)態(tài)。時(shí)稱為激發(fā)態(tài)。n臨界激發(fā)能臨界激發(fā)能: :指將原子殼層電子轟出軌道的指將原子殼層電子轟出軌道的最低能量稱為臨界激發(fā)能。最低能量稱為臨界激發(fā)能。u原子內(nèi)殼層失去電子，產(chǎn)生電子空位（電離）。原子內(nèi)殼層失去電子，產(chǎn)生電子空位（電離）。u外殼層電子填補(bǔ)電子空位，釋放特征外殼層電子填補(bǔ)電子空位，釋放特征X X線。線。基態(tài)原子基態(tài)原子入射入射電子電子原子內(nèi)殼原子內(nèi)殼層電離層電離電子躍遷電子躍遷特征特征X線線激發(fā)態(tài)原子激發(fā)態(tài)原子填補(bǔ)電子空位填補(bǔ)電子空位n2.2.連續(xù)連續(xù)X X線線 指從某一

13、極短波長(zhǎng)開(kāi)始，包括連續(xù)不斷的指從某一極短波長(zhǎng)開(kāi)始，包括連續(xù)不斷的各種波長(zhǎng)在內(nèi)的各種波長(zhǎng)在內(nèi)的X X線。線。產(chǎn)生過(guò)程：連續(xù)產(chǎn)生過(guò)程：連續(xù)X X線是由入射電子與原子核相線是由入射電子與原子核相 互作用而產(chǎn)生的。互作用而產(chǎn)生的。特點(diǎn)及意義特點(diǎn)及意義v連續(xù)連續(xù)X X線有極短波長(zhǎng)。線有極短波長(zhǎng)。v連續(xù)連續(xù)X X線強(qiáng)度具有極大值。線強(qiáng)度具有極大值。v連續(xù)連續(xù)X X線是樣品中全部元素的原子共同產(chǎn)生的。線是樣品中全部元素的原子共同產(chǎn)生的。v連續(xù)連續(xù)X X線構(gòu)成特征線構(gòu)成特征X X線的背景。線的背景。v連續(xù)連續(xù)X X線決定峰背比線決定峰背比。( (二二)X)X線的檢測(cè)線的檢測(cè)1. 1.波長(zhǎng)色散型波長(zhǎng)色散型X X

14、線線顯微分析法顯微分析法 （wave length dispersive X-ray microanalysis,WDXwave length dispersive X-ray microanalysis,WDX） 原理：原理： 特征特征X X線經(jīng)某種晶體衍射后進(jìn)入檢測(cè)器，根線經(jīng)某種晶體衍射后進(jìn)入檢測(cè)器，根據(jù)出現(xiàn)據(jù)出現(xiàn) 波峰時(shí)衍射角的大小來(lái)確定波峰時(shí)衍射角的大小來(lái)確定X X線的波線的波長(zhǎng)。從而確定樣品所含元素的性質(zhì)；波峰上長(zhǎng)。從而確定樣品所含元素的性質(zhì)；波峰上的峰值反映特征的峰值反映特征X X線的強(qiáng)度，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定線的強(qiáng)度，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定或元素純樣品校正后，來(lái)確定元素的含量。或元素純樣品校正后，

15、來(lái)確定元素的含量。n優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) * *適用于適用于4Be92U4Be92U之間原子序數(shù)元素的檢測(cè)。之間原子序數(shù)元素的檢測(cè)。 * *能量分辨率達(dá)能量分辨率達(dá)510keV510keV。 * *分析區(qū)域分析區(qū)域1m31m3以上。以上。 * *檢出敏感度達(dá)檢出敏感度達(dá)1010-15-15g g 。n缺點(diǎn)缺點(diǎn) * *需配置多種晶體。需配置多種晶體。 * *晶體轉(zhuǎn)換費(fèi)時(shí)，故分析速度慢（晶體轉(zhuǎn)換費(fèi)時(shí)，故分析速度慢（2030min2030min）。）。 * *不能同時(shí)進(jìn)行全元素分析。不能同時(shí)進(jìn)行全元素分析。2.2.能量分散型能量分散型X X線顯微分析法線顯微分析法（Energy dispersive X-ray

16、 microanalysis,EDXEnergy dispersive X-ray microanalysis,EDX） 原理：原理： 特征特征X X射線經(jīng)鈹窗進(jìn)入鋰漂移硅檢測(cè)器，使其射線經(jīng)鈹窗進(jìn)入鋰漂移硅檢測(cè)器，使其內(nèi)硅原子發(fā)生電離，產(chǎn)生電荷（與內(nèi)硅原子發(fā)生電離，產(chǎn)生電荷（與X X線能量成線能量成正比）形成電脈沖信號(hào)經(jīng)過(guò)放大后轉(zhuǎn)變?yōu)殡妷赫龋┬纬呻娒}沖信號(hào)經(jīng)過(guò)放大后轉(zhuǎn)變?yōu)殡妷好}沖，再輸送到多道分析儀上進(jìn)行脈沖幅度分脈沖，再輸送到多道分析儀上進(jìn)行脈沖幅度分析，積分后顯示在熒光屏或計(jì)算機(jī)記錄儀上。析，積分后顯示在熒光屏或計(jì)算機(jī)記錄儀上。譜線的位置代表元素的性質(zhì)；脈沖的高度代表譜線的位置代表元素的

17、性質(zhì)；脈沖的高度代表元素的相對(duì)含量。元素的相對(duì)含量。n優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) * *各種元素的峰值同時(shí)出現(xiàn)各種元素的峰值同時(shí)出現(xiàn)(23min),(23min),故檢測(cè)效故檢測(cè)效率高。率高。 * *測(cè)量元素范圍測(cè)量元素范圍11Na92U11Na92U。 * *檢出敏感度達(dá)檢出敏感度達(dá)1010-18-18g g以下，分析區(qū)域以下，分析區(qū)域30nm30nm。n 缺點(diǎn)缺點(diǎn) * *能量分辨率在能量分辨率在100150KeV100150KeV。 二二. .電鏡電鏡X X線顯微分析生物樣品制備線顯微分析生物樣品制備 原則原則 * * 很好地保存生物樣品的超微結(jié)構(gòu)。很好地保存生物樣品的超微結(jié)構(gòu)。 * * 維持樣品化學(xué)組成的

18、原有狀態(tài)，避免引起維持樣品化學(xué)組成的原有狀態(tài)，避免引起 元素分布的移位和不必要的外來(lái)元素的沉積。元素分布的移位和不必要的外來(lái)元素的沉積。 * * 制樣所用的化學(xué)物質(zhì)不能干擾被分析的元素。制樣所用的化學(xué)物質(zhì)不能干擾被分析的元素。 * * 要同時(shí)制備生物標(biāo)準(zhǔn)樣品。要同時(shí)制備生物標(biāo)準(zhǔn)樣品。（1 1）冰凍切片法：）冰凍切片法： 樣品用樣品用0.1-1%0.1-1%戊二醛與戊二醛與2 2 4%4%甲醛固定，入甲醛固定，入0.60.6 2.3mol/L2.3mol/L蔗糖液浸透后在液氮中冷凍。用蔗糖液浸透后在液氮中冷凍。用冷凍超薄切片機(jī)切片，溫度為冷凍超薄切片機(jī)切片，溫度為9090 110110，厚度厚度

19、200nm200nm 2m 2m。切片置于銅網(wǎng)上，冷凍干。切片置于銅網(wǎng)上，冷凍干燥后噴碳，再進(jìn)行微區(qū)元素分析。燥后噴碳，再進(jìn)行微區(qū)元素分析。（2 2）離子沉淀法：）離子沉淀法：( (焦銻酸鉀沉淀鈣離子的方法焦銻酸鉀沉淀鈣離子的方法) ) 前固定采用前固定采用2%2%焦銻酸鉀焦銻酸鉀3%3%多聚甲醛多聚甲醛1.25%1.25%戊二醛戊二醛. . 后固定采用后固定采用2%2%焦銻酸鉀焦銻酸鉀+1%+1%鋨鋨酸酸. .其余步驟同常規(guī)電鏡樣品制備方法。其余步驟同常規(guī)電鏡樣品制備方法。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) * * 固定液內(nèi)要避免含有重金屬元素；用固定液內(nèi)要避免含有重金屬元素；用 0.010.01 0.02N

20、0.02N冰醋酸配制；冰醋酸配制； * * 戊二醛與多聚鉀醛混合后，倒入焦銻酸鉀戊二醛與多聚鉀醛混合后，倒入焦銻酸鉀 中，以免發(fā)生沉淀；中，以免發(fā)生沉淀； * * 一般不用電子染色。一般不用電子染色。 電鏡核酸原位雜交技術(shù)電鏡核酸原位雜交技術(shù)Electron microscopic nucleic acid in situ hybridization technique 指在電鏡下應(yīng)用已知堿基序列并帶有標(biāo)記指在電鏡下應(yīng)用已知堿基序列并帶有標(biāo)記物的核苷酸探針與組織細(xì)胞中待測(cè)的核酸分子按物的核苷酸探針與組織細(xì)胞中待測(cè)的核酸分子按堿基配對(duì)的原則進(jìn)行特異性結(jié)合，形成雜交體。堿基配對(duì)的原則進(jìn)行特異性結(jié)合

21、，形成雜交體。然后應(yīng)用與標(biāo)記物相應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)免疫細(xì)然后應(yīng)用與標(biāo)記物相應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)或親合細(xì)胞化學(xué)的方法在核酸原有位置上胞化學(xué)或親合細(xì)胞化學(xué)的方法在核酸原有位置上進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位的技術(shù)。進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位的技術(shù)。n1971年年 出現(xiàn)放射性同位素出現(xiàn)放射性同位素(3H)標(biāo)記探針。標(biāo)記探針。n1986年年 應(yīng)用生物素化核苷酸探針，并以免疫應(yīng)用生物素化核苷酸探針，并以免疫細(xì)胞化學(xué)或親合細(xì)胞化學(xué)法作為顯色系統(tǒng)。細(xì)胞化學(xué)或親合細(xì)胞化學(xué)法作為顯色系統(tǒng)。n1993年年 出現(xiàn)了地高辛標(biāo)記的核苷酸探針。出現(xiàn)了地高辛標(biāo)記的核苷酸探針。*一. .探針的標(biāo)記物探針的標(biāo)記物 ( (一一) )放射性同位素放

22、射性同位素 32P 35S 125I 3H優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，可檢測(cè)拷貝數(shù)少的基因組。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，可檢測(cè)拷貝數(shù)少的基因組。 特異性高。特異性高。缺點(diǎn)：對(duì)人體有輻射危害。缺點(diǎn)：對(duì)人體有輻射危害。 半衰期較長(zhǎng)半衰期較長(zhǎng) （ 32P 14.3天天, 35S87.1天天,125I60天天, 3H12.3年年）。）。 費(fèi)用高。費(fèi)用高。 操作復(fù)雜。操作復(fù)雜。(二二)非同位素非同位素 金屬金屬(Hg) 熒光素?zé)晒馑?FITC) 半抗原（地高辛）生物素半抗原（地高辛）生物素 酶酶(HRP、AKP)優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): 價(jià)格便宜、操作簡(jiǎn)單、無(wú)半衰期、價(jià)格便宜、操作簡(jiǎn)單、無(wú)半衰期、 短期出結(jié)果。短期出結(jié)果。缺點(diǎn)：靈敏度低。

23、缺點(diǎn)：靈敏度低。二二. .電鏡原位核酸雜交的步驟電鏡原位核酸雜交的步驟（電鏡下多選用非放射性生物素化的核酸（電鏡下多選用非放射性生物素化的核酸探針，常以探針，常以膠體金膠體金作為顯示系統(tǒng)）作為顯示系統(tǒng)）雜交原則雜交原則 * * 使靶核酸保持天然位置與生化活性。使靶核酸保持天然位置與生化活性。 * * 使細(xì)胞和組織的超微結(jié)構(gòu)保存良好。使細(xì)胞和組織的超微結(jié)構(gòu)保存良好。 * * 保證低本底及高雜交率。保證低本底及高雜交率。(一一)雜交前準(zhǔn)備雜交前準(zhǔn)備1.固定固定 要選擇能保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并能最大限要選擇能保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并能最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或或RNA水平，使探針?biāo)?，使探針易于進(jìn)

24、入細(xì)胞的固定液易于進(jìn)入細(xì)胞的固定液。 常用固定液常用固定液: 4%多聚甲醛多聚甲醛 4%多聚甲醛多聚甲醛+0.13%戊二醛戊二醛 固定時(shí)間固定時(shí)間: 15min至至18h、42.雜交用器皿及組織樣品的處理雜交用器皿及組織樣品的處理(1)雜交用器皿及試劑的處理雜交用器皿及試劑的處理 注意要抑制注意要抑制RNA酶活性酶活性玻璃器皿：玻璃器皿： 過(guò)酸過(guò)酸0.04%二乙基焦磷酸鹽二乙基焦磷酸鹽(DEPC)沖洗沖洗用前應(yīng)高壓消毒過(guò)酸用前應(yīng)高壓消毒過(guò)酸清洗烘干清洗烘干95%AIC浸泡浸泡24hrddH2O清洗清洗高溫高溫150烘干過(guò)夜。烘干過(guò)夜。金屬器械：沖洗、高溫烘烤金屬器械：沖洗、高溫烘烤試劑：加入試

25、劑：加入0.04%DEPC載網(wǎng)載網(wǎng): 鎳網(wǎng)，上面覆有噴碳的鎳網(wǎng)，上面覆有噴碳的formvar膜膜操作操作: 戴乳膠手套和口罩戴乳膠手套和口罩(2)組織樣品的處理組織樣品的處理 目的是增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性目的是增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性 0.03%TritonX-100/PBS 210min 蛋白酶蛋白酶K/PBS 37 10min 檢測(cè)檢測(cè)DNA用用0.33mg蛋白酶蛋白酶K/PBS 37 10min 檢測(cè)檢測(cè)RNA用用210g蛋白酶蛋白酶K/PBS 37 10min (蛋白酶蛋白酶K可消化蛋白質(zhì)，使核酸序列從結(jié)合的蛋可消化蛋白質(zhì)，使核酸序列從結(jié)合的蛋白中釋放出來(lái)；還可以

26、使細(xì)胞易被探針與金粒子穿透，白中釋放出來(lái)；還可以使細(xì)胞易被探針與金粒子穿透，提高雜交信號(hào)。提高雜交信號(hào)。) 用用0.1mol/L甘氨酸甘氨酸/PBS清洗可中止反應(yīng)。清洗可中止反應(yīng)。(二二)雜交雜交1.包埋前雜交包埋前雜交 標(biāo)本固定后先進(jìn)行核酸雜交及雜交顯示標(biāo)本固定后先進(jìn)行核酸雜交及雜交顯示, 然后再進(jìn)行常規(guī)電鏡樣品的制備過(guò)程。然后再進(jìn)行常規(guī)電鏡樣品的制備過(guò)程。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): : 可避免包埋過(guò)程中造成的可避免包埋過(guò)程中造成的RNA丟失。丟失。 避免包埋劑對(duì)探針的屏障作用。避免包埋劑對(duì)探針的屏障作用。 多用于培養(yǎng)細(xì)胞或懸浮細(xì)胞。多用于培養(yǎng)細(xì)胞或懸浮細(xì)胞。缺點(diǎn)缺點(diǎn): : 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行增強(qiáng)穿透性與蛋白酶消化處理，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行增強(qiáng)穿透性與蛋白酶消化處理，使某些細(xì)胞成分被提取，造成人為損傷。使某些細(xì)胞成分被提取，造成人為損傷。