IgG抗體的提取及鑒定總結(jié)

1、醫(yī)學免疫學與免疫學技術(shù)實驗醫(yī)學免疫學與免疫學技術(shù)實驗貴陽醫(yī)學院免疫學教研室貴陽醫(yī)學院免疫學教研室人血清人血清IgG的提取及鑒定的提取及鑒定2014-04-22人血清人血清IgG的提取及鑒定的提取及鑒定離子交換層析法提取人離子交換層析法提取人IgG血清血清IgG鑒定鑒定人血清人血清IgG的提取及鑒定的提取及鑒定離子交換層析法提取人離子交換層析法提取人IgG流程：流程：u DEAE-纖維素預處理、采集樣品（血清）纖維素預處理、采集樣品（血清）u 裝柱、平衡裝柱、平衡u 上樣和洗脫上樣和洗脫u DEAE-纖維素再生纖維素再生人血清人血清IgG鑒定鑒定 ：u 洗脫液抗原性鑒定洗脫液抗原性鑒定瓊脂雙擴散

2、瓊脂雙擴散u 純度鑒定純度鑒定免疫電泳免疫電泳u 回收率的測定回收率的測定分光光度法分光光度法u IgG回收量的測定回收量的測定-直接直接ELISA離子交換層析的基本原理離子交換層析的基本原理 離子交換層析（離子交換層析（Ion Exchange Chromatography, IEC）是以離子交換劑為固定）是以離子交換劑為固定相，特定的離子溶液為流動相，依據(jù)各種離子或相，特定的離子溶液為流動相，依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同結(jié)合力不同進行分離進行分離純化的層析方式。純化的層析方式。 離子交換層析的基本過程離子交換層析的基本過程 帶電荷量少，親和力小的

3、先被洗脫下來，帶電荷量多，帶電荷量少，親和力小的先被洗脫下來，帶電荷量多，親和力大的后被洗脫下來。親和力大的后被洗脫下來。離子交換劑離子交換劑 在惰性載體上引入帶有電荷的活性基團即在惰性載體上引入帶有電荷的活性基團即離子交換劑離子交換劑。纖維素纖維素OCH2COO-Na 基質(zhì)基質(zhì) 電荷基團電荷基團 反離子反離子陰離子交換劑陰離子交換劑二乙氨乙基纖維素，弱堿性二乙氨乙基纖維素，弱堿性DEAE-纖維素（纖維素（陰離子交換纖維素陰離子交換纖維素）在）在 pH8.6以下分離中性或酸性物質(zhì)。以下分離中性或酸性物質(zhì)。人人IgG的主要理化性質(zhì)及的主要理化性質(zhì)及DEAE-纖維素提取原理纖維素提取原理人人IgG

4、特性特性: 血清含量：血清含量：9.5-12.5 mg/ml ；血清中的血清中的IgG屬屬于中性蛋白（于中性蛋白（pI:6.85-7.5），其余均屬酸性蛋白），其余均屬酸性蛋白（pI:4-5 ）。）。DEAE-纖維素提取纖維素提取IgG原理：原理： 在在pH7.27.4的環(huán)境中，酸性蛋白被的環(huán)境中，酸性蛋白被DEAE-纖維素吸附，纖維素吸附， IgG不被吸附而最早從柱中流出，不被吸附而最早從柱中流出，而得以純化。而得以純化。實驗步驟1、DEAE-纖維素預處理：纖維素預處理： 強堿處理強堿處理 0.5N NaOH 抽濾、洗滌、抽濾（抽濾、洗滌、抽濾（pH8.0） 強酸處理強酸處理 0.5N HC

5、l 抽濾、洗滌、抽濾（抽濾、洗滌、抽濾（pH8.0） 強堿處理強堿處理 0.5N NaOH 抽濾、洗滌、抽濾（抽濾、洗滌、抽濾（pH8.0） PH7.4 0.01M PB液浸泡液浸泡抽濾、浸泡抽濾、浸泡2、裝柱、平衡固定層析柱、裝柱、平衡固定層析柱 裝裝 柱：柱高度、無分層、無氣泡柱：柱高度、無分層、無氣泡3、樣本（人血清）準備、樣本（人血清）準備 抽靜脈血抽靜脈血分離血清分離血清透析（透析（PH7.4 0.01M PB液液 4度過夜）度過夜）4、研磨蔗糖備用（純化、研磨蔗糖備用（純化IgG濃縮用）濃縮用）實驗步驟5、上樣、洗脫、收集洗脫液、上樣、洗脫、收集洗脫液 上樣上樣 流速流速3ml/1

6、0min（記錄上樣總體積，保留部分血清）（記錄上樣總體積，保留部分血清） 洗脫洗脫 流速流速30-40ml/cm2/h 收集收集 5ml/管管 （20%三氯醋酸滴定、分光光度法檢測）三氯醋酸滴定、分光光度法檢測）6、DEAE-纖維素再生纖維素再生 2M NaCl 洗脫其他血清蛋白洗脫其他血清蛋白 拆柱、拆柱、 浸泡浸泡 PH7.4 0.01M PB液液洗脫液抗原性鑒定洗脫液抗原性鑒定雙向瓊脂擴散實驗原理：雙向瓊脂擴散實驗原理： 可溶性可溶性Ag和和Ab分別在瓊脂凝膠內(nèi)擴散。分別在瓊脂凝膠內(nèi)擴散。相應的相應的Ag和和Ab相遇后，在比例合適時可形成相遇后，在比例合適時可形成白色沉淀線。白色沉淀線。

7、7、洗脫液抗原性鑒定（雙擴散法）、洗脫液抗原性鑒定（雙擴散法）實驗步驟實驗步驟抗體抗體抗原抗原IgG回收率的測定回收率的測定分光光度法分光光度法 蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸酪氨酸、色氨色氨酸酸等芳香族氨基酸。它們具有吸收紫外光的性質(zhì)，等芳香族氨基酸。它們具有吸收紫外光的性質(zhì)，其吸收高峰在其吸收高峰在280nm波長處，且在此波長內(nèi)吸收波長處，且在此波長內(nèi)吸收峰的峰的光密度值光密度值與其與其 濃度濃度成正比關(guān)系成正比關(guān)系，故可作為蛋，故可作為蛋白質(zhì)定量測定的依據(jù)。白質(zhì)定量測定的依據(jù)。實驗步驟實驗步驟9、合并含、合并含IgG的洗脫液，通過蔗糖包埋法進行濃縮。的洗脫液，

8、通過蔗糖包埋法進行濃縮。10、通過分光光度法對濃縮后的、通過分光光度法對濃縮后的IgG進行回收率的測定。進行回收率的測定。回收率回收率= = 提取提取 IgG（mg）12（mg/ml）上樣血清體積上樣血清體積 OD280 1.43 回收體積回收體積12（mg/ml）上樣血清體積上樣血清體積回收回收IgG純度鑒定純度鑒定免疫電泳原理：免疫電泳原理：（immune electrophoresis） 先將先將抗原抗原加到瓊脂板的小孔內(nèi)進行電泳，加到瓊脂板的小孔內(nèi)進行電泳，將將樣品中不同分子量和不同電荷的組分分離成若干樣品中不同分子量和不同電荷的組分分離成若干區(qū)帶；然后分離的各抗原成分與電泳方向平區(qū)帶

9、；然后分離的各抗原成分與電泳方向平行行槽槽中中含含相應抗體相應抗體的免疫血清在瓊脂中作雙向免疫擴的免疫血清在瓊脂中作雙向免疫擴散。各區(qū)帶蛋白在相應位置與抗體形成弧形沉淀散。各區(qū)帶蛋白在相應位置與抗體形成弧形沉淀線。線。根據(jù)沉淀弧的位置、數(shù)量和形態(tài)，可分析樣品中所含抗原成分及其性質(zhì)。實驗步驟實驗步驟人血清提純物兔抗人血清雙擴散雙擴散電泳電泳+-19酶聯(lián)免疫吸附試驗（酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISAELISA）測定）測定IgGIgG20酶聯(lián)免疫吸附試驗原理酶聯(lián)免疫吸附試驗原理 利用標記技術(shù)將利用標記技術(shù)將酶酶標記到標記到抗體（抗原）抗體（抗原）上上，使待檢物中相應的抗原（抗體）與酶標記抗，使待檢物中相

10、應的抗原（抗體）與酶標記抗體（抗原）發(fā)生特異性反應。在遇到相應的酶體（抗原）發(fā)生特異性反應。在遇到相應的酶底物時，酶分解底物，生成有顏色的產(chǎn)物。根底物時，酶分解底物，生成有顏色的產(chǎn)物。根據(jù)顏色的深淺據(jù)顏色的深淺, ,可以判斷待檢物中有無特異的抗可以判斷待檢物中有無特異的抗原（抗體）以及量的多少。檢測方法有直接法原（抗體）以及量的多少。檢測方法有直接法、間接法、雙抗體法和抗原競爭法。、間接法、雙抗體法和抗原競爭法。 21 直接直接ELISA 間接間接ELISA 雙抗體夾心法雙抗體夾心法包被包被(未知抗原）未知抗原） 加入酶標抗體加入酶標抗體洗板洗板 加底物加底物加終止液加終止液包被包被(已知抗原

11、）已知抗原）加入待檢標本加入待檢標本（未知抗體）（未知抗體）加入酶標第二抗體加入酶標第二抗體抗抗體抗抗體洗板洗板加底物加底物加終止液加終止液包被包被(已知抗體）已知抗體）加入待檢標本加入待檢標本（未知抗原）（未知抗原）加入酶標抗體加入酶標抗體洗板洗板加底物加底物加終止液加終止液原理示意圖原理示意圖23人血清人血清IgG抗體的檢測抗體的檢測 直接直接ELISA法法測定原理：測定原理： 將待檢標本包被反應板，再加入酶標羊抗人將待檢標本包被反應板，再加入酶標羊抗人IgG抗體。當標本中存在抗體。當標本中存在IgG時，該抗體與包被時，該抗體與包被IgG結(jié)合，最后形成結(jié)合，最后形成IgG-酶標羊抗人酶標羊抗人IgG抗體復合物，抗體復合物，加入底物產(chǎn)生顯色反應。加入底物產(chǎn)生顯色反應。24包被：包被：用包被緩沖液將純化抗體稀釋至用包被緩沖液將純化抗體稀釋至0、2、4、6、8、10mg/L。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml稀釋液，稀釋液，4過夜。過夜。加酶標抗體：加酶標抗體：每孔加入稀釋至工作濃度的酶每孔加入稀釋至工作濃度的酶標抗體標抗體100l，37孵育孵育1h。洗滌：洗滌：用洗滌液洗滌用洗滌液