第三章_環(huán)境毒理學(xué)的基本研究方法

1、 研究方法研究方法 流行病學(xué)研究流行病學(xué)研究 受控的臨床研究受控的臨床研究 毒理學(xué)體內(nèi)試驗(yàn)毒理學(xué)體內(nèi)試驗(yàn) 毒理學(xué)體外試驗(yàn)毒理學(xué)體外試驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 真實(shí)的暴露條件真實(shí)的暴露條件 規(guī)定的限定暴露條規(guī)定的限定暴露條 易于控制暴露條件易于控制暴露條件 影響因素少，影響因素少，易于控易于控 在各化學(xué)物之間發(fā)生相在各化學(xué)物之間發(fā)生相 在人群中測定反應(yīng)在人群中測定反應(yīng) 能測定多種效應(yīng)能測定多種效應(yīng) 制制 互作用互作用 對某組人群對某組人群( (如哮喘如哮喘) ) 能評價(jià)宿主特征的作用能評價(jià)宿主特征的作用 可進(jìn)行某些深入可進(jìn)行某些深入的研的研 測定在人群的作用測定在人群的作用 的研究是有力的的研究是有力的 (

2、(如：性別、年齡、遺如：性別、年齡、遺 究究( (如：機(jī)制，代謝如：機(jī)制，代謝) ) 表示全部的人敏感性表示全部的人敏感性 能測定效應(yīng)的強(qiáng)度能測定效應(yīng)的強(qiáng)度 傳特征等和其他調(diào)控因傳特征等和其他調(diào)控因 人力物力花費(fèi)較人力物力花費(fèi)較少少 素飲食等素飲食等) ) 能評價(jià)機(jī)制能評價(jià)機(jī)制缺點(diǎn)缺點(diǎn) 耗資、耗時(shí)多耗資、耗時(shí)多 耗資多耗資多 動物暴露與人暴露相關(guān)動物暴露與人暴露相關(guān) 不能全面反映不能全面反映毒作用毒作用 多為回顧性，無健康多為回顧性，無健康 較低濃度和較短時(shí)較低濃度和較短時(shí) 的不確定性的不確定性 不能作為毒性評價(jià)不能作為毒性評價(jià)和和 保護(hù)保護(hù) 間的暴露間的暴露 受控的飼養(yǎng)條件與人的受控的飼養(yǎng)條

3、件與人的 危險(xiǎn)性評價(jià)的最后危險(xiǎn)性評價(jià)的最后依依 難以確定暴露，有混雜難以確定暴露，有混雜 限于較少量的人群限于較少量的人群 實(shí)際情況不一致實(shí)際情況不一致 據(jù)據(jù) 暴露問題暴露問題 ( (一般一般50) 50) 暴露的濃度和時(shí)間的模暴露的濃度和時(shí)間的模 難以觀察慢性毒作難以觀察慢性毒作用用 可檢測的危險(xiǎn)性增加必可檢測的危險(xiǎn)性增加必 限于暫時(shí)、微小、限于暫時(shí)、微小、 式顯著地不同于人群的式顯著地不同于人群的 需達(dá)到需達(dá)到2 2倍以上倍以上 可逆的效應(yīng)可逆的效應(yīng) 暴露暴露 測定指標(biāo)較粗測定指標(biāo)較粗( (發(fā)病率，發(fā)病率， 一般不適于研究最一般不適于研究最 死亡率死亡率) ) 敏感的人群敏感的人群 1 1

4、 實(shí)驗(yàn)動物和人對外源化學(xué)物的反應(yīng)敏感實(shí)驗(yàn)動物和人對外源化學(xué)物的反應(yīng)敏感 性不同，有時(shí)甚至存在著質(zhì)的差別性不同，有時(shí)甚至存在著質(zhì)的差別2 2 高劑量向低劑量外推的不確定性高劑量向低劑量外推的不確定性3 3 小數(shù)量實(shí)驗(yàn)動物到大量人群外推的不確小數(shù)量實(shí)驗(yàn)動物到大量人群外推的不確 定性定性4 4 成年健康動物向年老體弱及患病個體外成年健康動物向年老體弱及患病個體外 推的不確定性推的不確定性實(shí)驗(yàn)動物的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)資料外推到實(shí)驗(yàn)動物的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)資料外推到人群接觸的安全性時(shí)的不確定性人群接觸的安全性時(shí)的不確定性1 1 化學(xué)物在實(shí)驗(yàn)動物產(chǎn)生的作用，可以外推化學(xué)物在實(shí)驗(yàn)動物產(chǎn)生的作用，可以外推 于人。基本假設(shè)于人

5、?；炯僭O(shè) 人是最敏感的動物物人是最敏感的動物物 種；種；人和實(shí)驗(yàn)動物的生物學(xué)過程與體重人和實(shí)驗(yàn)動物的生物學(xué)過程與體重 ( (或體表面積或體表面積) )相關(guān)。相關(guān)。2 2 實(shí)驗(yàn)動物必須暴露于高劑量，這是發(fā)現(xiàn)對實(shí)驗(yàn)動物必須暴露于高劑量，這是發(fā)現(xiàn)對 人潛在危害的必需的和可靠的方法。人潛在危害的必需的和可靠的方法。 3 3 成年的健康成年的健康( (雄性和雌性未孕雄性和雌性未孕) )實(shí)驗(yàn)動物和實(shí)驗(yàn)動物和 人可能的暴露途徑是基本的選擇。人可能的暴露途徑是基本的選擇。描述毒理學(xué)試驗(yàn)的基本原則描述毒理學(xué)試驗(yàn)的基本原則1 1 受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì) 2 2 劑量劑量反應(yīng)反應(yīng)( (效

6、應(yīng)效應(yīng)) )研究研究 3 3 確定毒作用的靶器官確定毒作用的靶器官 4 4 確定損害的可逆性確定損害的可逆性 毒理學(xué)毒性評價(jià)試驗(yàn)的基本目的毒理學(xué)毒性評價(jià)試驗(yàn)的基本目的實(shí)驗(yàn)動物（實(shí)驗(yàn)動物（laboratory animallaboratory animal）指經(jīng)人工培育，對其攜帶微生物指經(jīng)人工培育，對其攜帶微生物實(shí)行控制，遺傳背景明確，來源實(shí)行控制，遺傳背景明確，來源清楚，可用于科學(xué)研究的動物。清楚，可用于科學(xué)研究的動物。實(shí)驗(yàn)動物的選擇實(shí)驗(yàn)動物的選擇實(shí)驗(yàn)動物的選擇實(shí)驗(yàn)動物的選擇物種選擇物種選擇 選擇對外液化學(xué)物的毒性反應(yīng)及代謝選擇對外液化學(xué)物的毒性反應(yīng)及代謝特點(diǎn)與人類接近的物種；特點(diǎn)與人類接近的

7、物種；選擇自然壽命不太長的物種；選擇自然壽命不太長的物種；選擇易于飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作的物種；選擇易于飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作的物種；選擇經(jīng)濟(jì)并易于獲得的物種。選擇經(jīng)濟(jì)并易于獲得的物種。 近交系動物近交系動物 連續(xù)連續(xù)2020代以上兄妹交配或親子交配培育代以上兄妹交配或親子交配培育突變系動物突變系動物 突變的基因可世代相傳并保持遺傳基因特性突變的基因可世代相傳并保持遺傳基因特性雜交群動物雜交群動物 兩個不同近交系之間有目的進(jìn)行交配，所產(chǎn)兩個不同近交系之間有目的進(jìn)行交配，所產(chǎn)生的第一代動物，生的第一代動物， 亦稱雜交一代動物。亦稱雜交一代動物。封閉群動物封閉群動物 5 5年以上不從外部引進(jìn)新血緣，僅由同一品系年

8、以上不從外部引進(jìn)新血緣，僅由同一品系的動物在固定場所保存繁殖的動物群的動物在固定場所保存繁殖的動物群 實(shí)驗(yàn)動物的選擇實(shí)驗(yàn)動物的選擇品系選擇品系選擇無菌動物無菌動物 體內(nèi)外均無任何微生物和寄生蟲體內(nèi)外均無任何微生物和寄生蟲無特定病原體動物（無特定病原體動物（SPFSPF）體內(nèi)無特定微生物和寄體內(nèi)無特定微生物和寄生蟲存在的動物生蟲存在的動物( (無傳染病無傳染病) )。飼養(yǎng)于封閉的系統(tǒng)。飼養(yǎng)于封閉的系統(tǒng)。清潔動物清潔動物 與與SPFSPF的不同：抗體檢查常有腦脊髓炎病的不同：抗體檢查常有腦脊髓炎病毒、鼠肝炎病毒等抗體滴度，但不應(yīng)有臨床癥狀、毒、鼠肝炎病毒等抗體滴度，但不應(yīng)有臨床癥狀、病理改變及自然

9、死亡。飼養(yǎng)在半屏蔽系統(tǒng)。病理改變及自然死亡。飼養(yǎng)在半屏蔽系統(tǒng)。微生物控制的選擇微生物控制的選擇實(shí)驗(yàn)動物的選擇實(shí)驗(yàn)動物的選擇個體選擇個體選擇 1 1 年齡年齡2 2 性別性別 3 3 生理狀態(tài)生理狀態(tài) 4 4 健康狀況健康狀況 實(shí)驗(yàn)動物的選擇實(shí)驗(yàn)動物的選擇 品品 系系周齡周齡 WistarWistar SD SD雌性雌性雄性雄性雌性雌性雄性雄性 3 35454565650505252 4 4919197978686101101 5 5134134134134130130150150 6 6166166187187172172206206 7 7209209233233210210262262 8

10、 8214214297297240240318318 9 92322323253252582583653651010246246370370272272399399大鼠體重與周齡的關(guān)系大鼠體重與周齡的關(guān)系 小鼠體重與周齡的關(guān)系小鼠體重與周齡的關(guān)系 品品 系系 周齡周齡 昆明昆明 BALB/cBALB/c C57BL/6 C57BL/6 615 615 雌性雌性 雄性雄性 雌性雌性 雄性雄性 雌性雌性 雄性雄性 雌性雌性 雄性雄性 0 01.951.95 2.10 2.10 1.40 1.40 1.46 1.46 1.40 1.40 1.44 1.44 1.58 1.58 1.58 1.58 1

11、 15.545.54 5.82 5.82 3.35 3.35 3.50 3.50 3.42 3.42 3.50 3.50 4.64 4.64 4.64 4.64 2 27.907.90 8.35 8.35 5.50 5.50 5.60 5.60 5.55 5.55 5.60 5.60 7.96 7.96 7.96 7.96 3 313.5513.55 14.80 14.80 7.32 7.32 7.40 7.40 6.40 6.40 6.90 6.90 9.83 9.83 9.83 9.83 4 421.3521.35 22.60 22.6011.6011.6012.4512.4512.201

12、2.2012.5712.5715.7515.7519.0019.00 5 527.9027.90 33.25 33.2514.7514.7516.1016.1016.9016.9018.1018.1020.7520.7522.5822.58 6 632.8032.80 39.25 39.2515.6015.6017.4017.4018.4018.4020.5020.5021.8821.8825.9625.96 7 734.7034.70 39.90 39.9016.1016.1018.6518.6519.0019.0021.6021.6023.1223.1227.9627.96 8 834.8

13、034.80 40.05 40.0518.1618.1620.2520.2520.2520.2522.4022.4024.1624.1628.8328.831 1 未處理對照組未處理對照組( (空白對照組空白對照組) )：本底值，：本底值， 質(zhì)量控制質(zhì)量控制2 2 陰性陰性( (溶劑賦形劑溶劑賦形劑) )對照：與染毒組比對照：與染毒組比 較的基礎(chǔ)較的基礎(chǔ) 3 3 陽性對照：檢測試驗(yàn)體系的有效性陽性對照：檢測試驗(yàn)體系的有效性4 4 歷史性對照：檢查試驗(yàn)體系的穩(wěn)定性，歷史性對照：檢查試驗(yàn)體系的穩(wěn)定性， 即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和保證即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和保證 毒理學(xué)試驗(yàn)常用對照毒理學(xué)試驗(yàn)常用對照 對各

14、個毒理學(xué)試驗(yàn)應(yīng)該用同一種、同一批號受對各個毒理學(xué)試驗(yàn)應(yīng)該用同一種、同一批號受 試物試物 受試物成分和配方必須固定受試物成分和配方必須固定 如是異構(gòu)體混合物，異構(gòu)體比例必須固定如是異構(gòu)體混合物，異構(gòu)體比例必須固定 活性成分的百分含量和可檢測的雜質(zhì)的濃度也活性成分的百分含量和可檢測的雜質(zhì)的濃度也 應(yīng)固定應(yīng)固定 受試物在貯存期內(nèi)穩(wěn)定性和在飼料中的穩(wěn)定性受試物在貯存期內(nèi)穩(wěn)定性和在飼料中的穩(wěn)定性 必須進(jìn)行研究并報(bào)告必須進(jìn)行研究并報(bào)告 受試物應(yīng)一次備齊全部實(shí)驗(yàn)的用量受試物應(yīng)一次備齊全部實(shí)驗(yàn)的用量受試樣品受試樣品毒理學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求毒理學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求 隨機(jī)、重復(fù)、對照原則隨機(jī)、重復(fù)、對照原則

15、對常規(guī)毒理學(xué)試驗(yàn)資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對常規(guī)毒理學(xué)試驗(yàn)資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料：計(jì)量資料：一般用一般用t t檢驗(yàn)或檢驗(yàn)或ANOVAANOVA 記數(shù)資料：記數(shù)資料：卡方檢驗(yàn)卡方檢驗(yàn)毒理學(xué)試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)毒理學(xué)試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)1 1 處理組與對照組比較差別有無顯著性處理組與對照組比較差別有無顯著性 2 2 有無劑量有無劑量- -反應(yīng)關(guān)系反應(yīng)關(guān)系3 3 是否伴有其他相關(guān)參數(shù)的改變是否伴有其他相關(guān)參數(shù)的改變4 4 是否在是否在 “ “正常正?！敝捣秶捣秶?實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷LD501lglg1090nLDLDi1lglg0100nLDLDi同理可得LC5、 LC10、24SSmppp第二節(jié)第二節(jié) 亞慢

16、性和慢性毒性試驗(yàn)亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)一、蓄積試驗(yàn)及其方法：一、蓄積試驗(yàn)及其方法：（一）蓄積作用：（一）蓄積作用：某些物質(zhì)以較小劑量反復(fù)作用于機(jī)體，可使機(jī)體對該物質(zhì)的反應(yīng)性增強(qiáng)，即一次染毒不引起明顯中毒反應(yīng)或死亡的劑量，經(jīng)分次重復(fù)染毒后，可引起明顯中毒或死亡，此種現(xiàn)象稱為蓄積作用(accumulation)?？煞謨煞N： 物質(zhì)蓄積物質(zhì)蓄積：毒物在體內(nèi)的排出量小于進(jìn)入量，以致毒物在體內(nèi)的貯留量增多為物質(zhì)蓄積； 功能蓄積功能蓄積：毒物進(jìn)入機(jī)體后，并未發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)明顯貯留，但可引起機(jī)體功能改變的逐漸累積，導(dǎo)致對該毒物的反應(yīng)性增強(qiáng)。)1(50)(50EDEDKn)1(50)(50LDLDKn 1固定劑量法固

17、定劑量法 ：固定每天染毒劑量為1/201/5 LD50，連續(xù)染毒，直至實(shí)驗(yàn)動物半數(shù)死亡。如果染毒劑量累計(jì)已達(dá)5個LD50 動物死亡仍末達(dá)半數(shù)，實(shí)驗(yàn)均可告結(jié)束，計(jì)算蓄積系數(shù)，作出評價(jià)。 2遞增劑量法遞增劑量法 ：先測定LD50（1），然后對另一組動物每天染毒，以4天為一期，開始給予0.1LD50。以后每期按1.5倍遞增劑量，直至動物半數(shù)死亡，或?qū)嶒?yàn)已達(dá)28天，可結(jié)束實(shí)驗(yàn)，計(jì)算系數(shù)。 3. 二十天試驗(yàn)法二十天試驗(yàn)法 ：選用大鼠或小鼠每個劑量組雌雄各10只，以1/2、l/5、1/10、1/20 LD50分別對每組進(jìn)行染毒，每日1次，共20天。如l/20LD50組動物有死亡，且有劑量反應(yīng)關(guān)系，則有較強(qiáng)

18、蓄積作用；如1/20 LD50組無死亡，則為弱蓄積。4、劑量選擇與分組、劑量選擇與分組 劑量：劑量：180I50LD50，對于在體內(nèi)不產(chǎn)生蓄積作用而排泄又快的物質(zhì)可適當(dāng)加大劑量，反之則可減少劑量。 設(shè)34個實(shí)驗(yàn)組和1個對照組。 實(shí)驗(yàn)組要求：實(shí)驗(yàn)組要求：在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí) 最低劑量組最低劑量組不產(chǎn)生可觀察到的毒性反應(yīng)； 最高劑量組最高劑量組能引起明顯毒性反應(yīng)，但不引起死亡； 中間劑量組中間劑量組產(chǎn)生輕微毒性反應(yīng)。三、慢性毒性作用及其試驗(yàn)方法三、慢性毒性作用及其試驗(yàn)方法1、目的：、目的：評價(jià)化學(xué)物在長期小劑量作用的條件下對機(jī)體產(chǎn)生的損害及其特點(diǎn)確定閾劑量和最大無作用劑量。2、試驗(yàn)方法：、試驗(yàn)方法：（1）

19、 動物選擇、染毒方法、觀察指標(biāo)等與亞慢性毒性試驗(yàn)相似；（2）染毒期限：1-2年或終身染毒，也有人提出6月。（3）劑量分組： 3個染毒組和一個對照組。 高劑量組：1/51/2亞慢性試驗(yàn)閾值； 中間劑量：1/501/10； 低劑量組：1/100。營養(yǎng)缺陷）突變型微生物（組氨酸回復(fù)突變正向突變野生型沙氏菌環(huán)境流行病學(xué)除了上述一般內(nèi)容，還有它本身的特點(diǎn)。 (1)它不僅研究疾病的分布規(guī)律，而且更經(jīng)常地研究疾病前的狀態(tài)，即包括無異常健康)、微弱的功能改變、疾病的前期(亞臨床狀態(tài))等各種健康狀況，揭示環(huán)境污染或某些微量元素的健康效應(yīng)。 (2)環(huán)境流行病學(xué)研究的暴露因素主要是理化因素。已知暴露因素，研究其對健康的影響；環(huán)境毒理學(xué)工作者所進(jìn)行的大量工作就屬于這種。例如金屬冶煉廠鉛污染大氣對居民健康影響，磷肥廠氟污染大氣對居民健康影響的調(diào)查等。出現(xiàn)健康異常，追究引起異常的暴露因素，這屬于探討病因的研究。例如，近年來我國學(xué)者對于鼻咽癌、食道癌病因的研究，對克山病、大骨節(jié)病病因的研究，均屬于此種類型。日本的水誤病和痛痛病的病因是重金屬污染