提取d和r原理方法

1、主講人：唐維（修改）:DNA詛:DNA、-一-口:RNA:RNA核酸是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息，是生物學(xué)研究的主要對(duì)象，因此核酸的提取是生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最重要、最基本的操作。:DNA詛:DNA、-一-口:RNA:RNAT心心W咚1D組DNA的提取>>>CTAB法SDS法其它D組DNA的提取非質(zhì)粒DNA的提取·堿裂解法 煮沸法戶線粒體、葉綠體DNA的提取戶·差速離心結(jié)合SDS裂解法 DCTAB法（植物DNA提取經(jīng)典方法）原理CTABChexadecyltrim ethylammon iu m bromide,十六燒基三甲基淏化物。銑）， 是一種陽(yáng)離

2、子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合>>具有從低離子強(qiáng)度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在這種條件下，蛋白質(zhì)和中性多聚糖仍留在溶液里溶液中 C>0.7mol/L NaCl )該復(fù)合物在是可溶的，通過(guò)抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來(lái)。注：CTAB溶液在低于15°C 時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15°C。CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方DTris-HCICp HS.O)提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防 止核酸被破壞；EDTA贅合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl 提供

3、一個(gè)環(huán)境，使DNP白 ）。CTAB溶解細(xì)胞膜，C脫氧核糖并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；J3-硫基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醒，避免褐變，使酚容易去除組份Tris-HCI C pHS.O)EDTA C pHS.O)NaClCTABP-琉基乙醇終濃度100mM20m M1.4M2%(WN)0.1% CV/V)使用前加入T心心W咚1DCTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方Tris-HCIEDTACpHS.O)P-琉基乙醇NaClCTABPVP40組份CpHS.O)，2 %CV/V )終濃度100mM2 0 m M1.4M3%(W/V)5%(W/V)使用前加入'! PVP( 聚乙烯咄咯燒酮）是酚的

4、絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。PVP(PVP按其平均量大小分為四級(jí)，習(xí)慣上常以K值表示，不同的K值分別代表相應(yīng)的PVP平均分子量范圍。K值實(shí)際上是與PVP水溶液的相對(duì)粘度有關(guān)的特征值，而粘度又是與高聚物量有關(guān)的物理量，因此可以用K值來(lái)表征PVP的平均量。通常K值越大，其粘度越大，粘接性越強(qiáng)。在研磨過(guò)程中加入PY_P,強(qiáng)的 合多酚的能力，從其中的CO-N=基有很l同時(shí)向抽提液中加入還原劑P磕 基乙醇，后者能打斷多酚氧化酶中的二硫鍵，使多酚不易被氧化，隨后經(jīng)抽提而去除。、丿HnNHT心心W咚1DCTAB法流程圖植物材

5、料抽提DNA溶液上層溶液iiiiii液前刀牛裂D>-SDS法原理SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫( 5565°C )條件下能裂解細(xì)胞，使離析，蛋白變性，出核酸；>(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰浴）， 使蛋白質(zhì)及多糖提雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；>上清液中的DNA用酚I 氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。DSDS法DNA提取緩沖液組份Tris-HCI C p H8.0)EDTA( p H 8.0)NaClSDS終濃度1 0 m M20 m M0.4M2%3. 2. 2改良的 SDS 法SDS 提取緩沖液稍有變化，具SDS, Tris- HCl( p

6、H 8秒5) 100、EDTA( pH體配制如下： 2%,8.0) 20、NaCl 100 mmol/ L . 3%PVP ( 聚乙烯毗咯燒酮），0. 1 %偏重亞硫酸鈉，充分混勻。用此改進(jìn)的SDS 法簡(jiǎn)2.65 水浴 60min, 其間緩慢搖動(dòng)幾次。3加 入150ul 的5mol/ LKac, 混勻，冰浴15min 左右DSDS法流程圖（以動(dòng)物組織為例）<_抽>提動(dòng)物組織上層溶液DNA溶液細(xì)胞裂解iiiiii丿D根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有：>>>物理方式：珠法、超聲波法、研磨法、凍融法化學(xué)方式：異硫氧酸呱法、堿裂解法生物方式：酶法它匕D>根據(jù)核酸分離純化方式

7、的不同有：吸附材料結(jié)合法：I硅質(zhì)材料低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫?？旖莞咝А?陰離子交換樹(shù)脂I 低鹽高pH值結(jié)合核酸，適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。低pH值洗脫。 磁珠I 磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的。>濃鹽法：利用RNP和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離>抽提法：作為蛋白變性劑，同時(shí)抑制核酸酶的降解作用>密度梯度離心法：利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物它D堿裂解法原理>DNA比質(zhì)粒DNADNA為線狀分大得多，且子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀；>當(dāng)用堿處理DNA溶液時(shí)，線狀DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中

8、性pH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；DN>變性段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA從而可通過(guò)離心將兩者則以溶解狀態(tài)存在液相中，。T心心W咚1D堿裂解法流程圖/對(duì)數(shù)期菌體上清液沉淀抽提質(zhì)粒DNA溶液離心洗滌、iiiiiiii及作用（鄉(xiāng)一罰“ 四溶液 I50mM 葡萄糖 /1OmM EDTA / 25mM Tris-HCI,pH=8.0 葡萄糖增稠，使懸浮后的大腸桿菌快速沉積到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活 性。這一步溶液中還可以加入RNase, 后續(xù)步驟中被除去不受EDTA影響，并且可以在0.2M NaOH / 1% SOS 破細(xì)胞的主要是堿，而溶液II不是SOS

9、 ,所以才叫堿法抽提。溶液Ill3M 醋酸鉀 / 2M 醋酸這一步的K置換了sos ( 十二燒基磺酸鈉）中的Na,得C十二燒基磺酸鉀）沉淀； sos易與蛋臼質(zhì)結(jié)合，到PDS平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)sos，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)也沉淀了，同組DNA也被PDS共沉淀時(shí)D煮沸法原理DNA比質(zhì)粒DNADNA為線狀分>大得多，且子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀；>當(dāng)加熱處理DNA溶液時(shí)，線狀DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；DN>變性段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA從而可通過(guò)離心將兩者則以溶解狀態(tài)存

10、在液相中，。線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半性細(xì)胞器，自身可編碼蛋臼，它們的比重和大小一定，因而在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也一定，根據(jù)這種組分分級(jí)分離出來(lái)。，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各D差速離心法原理>是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的法。>將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（庶糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，比的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。:DNA詛:DNA、-一-口:RNA:RNAI. 材料準(zhǔn)備!I I. 破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物I I I.核酸分離、純化幾IV. 沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)V. 核酸溶解在適量緩沖液或水中組DNA的提取 質(zhì)粒DNA的提取 >>最好使

11、用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融使用處于對(duì)數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開(kāi)環(huán)質(zhì)粒增加）>>組DNA時(shí)，要提取血液培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入篩選，否則選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）菌體易污染，質(zhì)粒易丟失>>組培細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)造成DNA降解盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒， 如為低拷貝或大質(zhì)粒， 則應(yīng)加大菌體用量>的液體材料DNA含量較含> 少，提取前先富集菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）按照性質(zhì)，可以把質(zhì)粒分為兩類：一類是嚴(yán)緊型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)胞一次時(shí)，2個(gè)質(zhì)粒；停止后仍然一次，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有1質(zhì)粒也另一類是松弛型質(zhì)粒，當(dāng)，每一個(gè)細(xì)胞內(nèi)一般有20個(gè)左右質(zhì)能繼續(xù)粒。一般量較大的質(zhì)粒屬

12、嚴(yán)緊型。鼠較小的質(zhì)粒屬松弛型。質(zhì)粒的有時(shí)和它們的宿主細(xì)胞有關(guān)，某些質(zhì)粒在大腸桿菌內(nèi)的緊型，而在變形桿菌內(nèi)則屬松弛型。屬嚴(yán)T心心W咚1 組DNA的提取 質(zhì)粒DNA的提取 >>>材料應(yīng)適量，過(guò)多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低菌體量適當(dāng)培養(yǎng)基去除干凈， 同時(shí)保證菌體在懸浮液中充分懸浮>不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式： 植物材料液氮研磨>變性的時(shí)間不要過(guò)長(zhǎng)否則質(zhì)粒易被打斷( 5 分鐘），動(dòng)物組織勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞蛋白酶K細(xì)菌溶菌酶破壁>復(fù)性時(shí)間也不宜過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)有組DNA的污染酵母破壁酶或珠>,G 十菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機(jī)械法處理，以破

13、壁>高浴時(shí)， 定時(shí)輕柔振蕩、-質(zhì)粒DNA的提取>采用吸附材料吸附的方式分離DNA時(shí)，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系>采用有機(jī)（酚氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔>離心分離兩， 應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間（稱大提，10000 轉(zhuǎn)20min )>不同材料的特點(diǎn)， 在提取過(guò)程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法、-D 蛋白質(zhì)的去除：>酚氯仿抽提>使用變性劑變性( SDS、異硫氝酸呱等）>洗滌>蛋白酶處理、-D 多糖的去除：法：用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入1/ 2體>積的5M NaCl,可溶解多糖。>用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯

14、(1/ 2體積），氯苯可>以與多糖的脛基作用，從而去除多糖。用PEGsooo代替乙醇沉淀DNA:在500µMNaCl)L,DNA液中加入冰浴20mi n。>200 µ 120%PEG80 (含1. 2、-D 多酚的去除：>在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：(3 - 琉基乙醇、壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等抗加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇），它們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與DNA的結(jié)合>D 鹽離子的去除：70 %的乙醇洗滌 組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取>>當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分沉

15、淀時(shí)加入1/10體積的NaAc充分沉淀( pHS.2,3M ),有利于>>>沉淀后應(yīng)用70%的乙醇洗滌，以除去鹽離子等隙干DNA,讓乙醇充分揮發(fā)（不要過(guò)分干燥）若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能贅和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0,可防止DNA發(fā)生酸解、D問(wèn)題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)重新純化DNA,去除蛋1 .1.臼、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見(jiàn)前）DNA在溶解前，有酒2.重新沉淀DNA,充分揮發(fā)讓精殘留，后續(xù)酶解反應(yīng)抑制2.DNA中殘留有金屬離子增加70 % 乙醇洗滌的3 .3.(

16、2- 3次）次數(shù)D問(wèn)題二：DNA降解。盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融1 .材料不新鮮或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過(guò)程操作過(guò)于劇烈，DNA被機(jī)械打斷外源核酸酶污染反復(fù)凍融1.液氮研磨或勻漿組織后，前加入裂解緩沖液解凍2.2.在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時(shí)，可增加裂解液中贅合劑的含量細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無(wú)菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融3.3.4.5.4.5.6.l對(duì) 策T心心W咚1D問(wèn)題三：DNA提取量少。盡量選用新鮮（料）的材1.G+動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分；2.實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式

17、破壁高溫裂解時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)（對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌可增加PK的用量）低溫沉淀，延長(zhǎng)沉淀時(shí)間加輔助物，促進(jìn)沉淀洗滌時(shí)，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾侄1.破壁或裂解不充分2.3.沉淀全3.洗滌時(shí)DNA丟失4.4.5.6.l對(duì) 策1.CTAB配方如上，配制好備用，65度水浴預(yù)熱。稱葉片或果實(shí)采取后最好立即放到液氮中，避免酚類物質(zhì)氧化2.65°水浴一個(gè)小時(shí)3氯 仿：乙醇：異戊醇=80:16:4的抽提液兩次。10000轉(zhuǎn)分離狀物心20分鐘，盡量把絲狀物壓緊，避免吸取上清時(shí)有絲牽拉 等體積預(yù)冷的異丙醇 ，75%乙醇洗去其他雜質(zhì)。洗兩次。用無(wú)水乙醇5毫升洗一次。隙干5分鐘揮發(fā)掉乙醇后加入3-5mlT

18、E溶解，加入Sul,1mg/ml的RNA酶后保存組DNA稱T心心W咚11- .Ti幣 目玉打).+.:.·免;t,U行下1:令 吐？正亢IL 舅燈9. 對(duì)10. MM-410l臧？8勹rJ6:DNA詛:DNA、-一口:RNA坦:RNAD>異硫氝酸脹苯酚法原理：細(xì)胞在變性劑異硫氮酸肌的作用下被裂解，同時(shí)白體上的蛋白變性，核酸；出來(lái)的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分別位于整系中的中間相和水相，從而得以分離；抽提，沉淀，得到純凈RNA。D>異硫氝酸脹苯酚法步驟：材料準(zhǔn)備：盡量新鮮。裂解變性：異硫氮酸抓（亞硫氫抓，琉基乙醇，N-月桂肌RNA,氨酸等）。使細(xì)胞及白復(fù)合

19、物變性，有效抑制核酸酶。 純化分離：苯酚，氯仿，異戊醇。苯酚氯仿可抽提去除雜物。洗滌： 70 %乙醇。沉淀：異丙醇、無(wú)水乙醇。乙酸鈉 ( pH4.0):維持變性的細(xì)胞裂解液的pH值，沉淀RNA。此外還常用氯化捚選擇沉淀RNA。D>>材料：新鮮，切忌使用反復(fù)凍融的材料如若材料來(lái)源，且實(shí)驗(yàn)需要一定的時(shí)間間隔?？梢韵葘⒉牧腺A存在TRi zol 或樣品貯存液中，70°C或20°C保存>>如要多次提取，請(qǐng)分成多份保存液氮長(zhǎng)期保存，70°C短期保存D>樣品破碎及裂解：根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法：培養(yǎng)細(xì)胞：通?？芍苯蛹恿呀庖毫呀饨湍负图?xì)菌：一般

20、TRi zo l 可直接裂解，對(duì)于一些特殊的材料可先用酶或者機(jī)械方法破壁動(dòng)植物組織：先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。期間動(dòng)作快速，樣品保持冷凍>>樣品量適當(dāng)，保證充解為減少DNA污染，可適當(dāng)加大裂解液的用量D>>純化：在使用氯仿抽提純化時(shí)，一定要充分混勻，且動(dòng)作快速；經(jīng)典的純化方法，如沉淀等，雖然，但操作時(shí)間長(zhǎng)，Li ClRNA降解；易造成>RNA后續(xù)酶反柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去除影響應(yīng)的雜質(zhì)，是目前較為理想的選擇。:DNA詛:DNA、-一-口:RNART-PCR常舊:RNADRNA 的降解I0D280 比值偏低0 D 2 6 0DD電泳帶型異常D

21、下游實(shí)驗(yàn)效果不佳D新鮮細(xì)胞或組織：>裂解液的質(zhì)量>外源RNase的污染裂解液的用量不足>>>組織裂解不充分另外某些富含內(nèi)源酶的樣品（如脾臟，胸腺等），很難避免RNA的降解。建議在液氮條件下將組織輾碎，并且勻漿時(shí)使用更多裂解液。D冷凍樣品：>樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可以移至- 70°C冰箱保存。樣品要相對(duì)小一點(diǎn)；>先用液氮研磨，再加裂解液勻漿；>樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須預(yù)冷，輾磨過(guò)程中及時(shí)補(bǔ)充液氮。D>蛋自質(zhì)污染：不要吸入中間層及有機(jī)相， 加入氯仿后首先混勻， 并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。>>D>減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底解決辦法：重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚殘留：不要吸入中間層及有機(jī)相， 加入氯仿后首先混勻， 并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。>解決辦法：重新抽提一次，再沉淀，溶解。D>>D>抽提試劑殘留：確保洗滌時(shí)要徹底懸浮 RNA,75%乙醇。并且徹底去掉解決辦法：再沉淀一次后，溶解。設(shè)備限制：測(cè)定0D260及0D280數(shù)值時(shí)， 要使0D2600. 10-0. 50讀數(shù)在之間。此范圍線 性最好。D>用水稀釋樣品：測(cè) OD 時(shí)，對(duì)照及樣品稀釋液請(qǐng)使用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值