蛋白質(zhì)組學(xué)與技術(shù)第二講

1、蛋白質(zhì)組學(xué)與分析技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)與分析技術(shù)邱德文邱德文中國農(nóng)科院植物保護(hù)研究所中國農(nóng)科院植物保護(hù)研究所第一章第一章 蛋白質(zhì)組學(xué)的概念蛋白質(zhì)組學(xué)的概念v 蛋白質(zhì)組學(xué)是研究與基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)組的學(xué)科，蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)組學(xué)是研究與基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)組的學(xué)科，蛋白質(zhì)組（組（proteome）一詞，是指）一詞，是指“一種基因組所表達(dá)的全套蛋一種基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)白質(zhì)”,即包括一種細(xì)胞乃至一種生物所表達(dá)的全部蛋白即包括一種細(xì)胞乃至一種生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。質(zhì)。v 對應(yīng)于基因組的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的整體，不是局限于一個(gè)對應(yīng)于基因組的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的整體，不是局限于一個(gè)或幾個(gè)蛋白質(zhì)；其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)

2、動態(tài)變或幾個(gè)蛋白質(zhì)；其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)化的蛋白質(zhì)組成成分、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動規(guī)律。規(guī)律。978 Cell 136, March 6, 2009蛋白質(zhì)基因互作、蛋白質(zhì)受體、信號傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)基因互作、蛋白質(zhì)受體、信號傳導(dǎo)、調(diào)控代謝網(wǎng)絡(luò)、作用機(jī)理、代謝途徑調(diào)控代謝網(wǎng)絡(luò)、作用機(jī)理、代謝途徑蛋白質(zhì)的分離與純化蛋白質(zhì)的分離與純化蛋白質(zhì)研究流程蛋白質(zhì)研究流程v 蛋白質(zhì)的分離、純化與鑒定v 功能蛋白蛋白分離（硫酸氨、乙醇沉淀、離心、

3、獲得功能粗蛋白制品純化（液相色譜、蛋白質(zhì)分析制備儀、雙向電泳、液質(zhì)聯(lián)儀氨基酸測序基因克隆蛋白質(zhì)藥物作用于植物的蛋白表達(dá)譜藥物于植物的相互作用。 蛋白質(zhì)的分子量蛋白質(zhì)的分子量 一般在一萬至一百萬道爾頓之間一般在一萬至一百萬道爾頓之間 1道爾頓道爾頓1C12絕對質(zhì)量絕對質(zhì)量/12 1.6610-27千克千克蛋白質(zhì)分子的大小 蛋白質(zhì)含有酸蛋白質(zhì)含有酸/ /堿堿AAAA殘基具有兩性殘基具有兩性 堿堿/ /酸越大酸越大pI pI 越大越大vpI通常在通常在 6.0 左右左右蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點(diǎn)蛋白質(zhì)分離純化的一般原則總目標(biāo)：增加制品純度或比活總目標(biāo)：增加制品純度或比活1.1.前處理：因動前處理：因動

4、/ /植物植物/ /細(xì)菌而異細(xì)菌而異2.2.粗分級分離：采用鹽析粗分級分離：采用鹽析/ /等電點(diǎn)沉淀等電點(diǎn)沉淀/ /有有機(jī)溶劑分級分離等方法機(jī)溶劑分級分離等方法3.3.細(xì)分級分離：采用凝膠過濾、離子交換細(xì)分級分離：采用凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等層析、吸附層析以及親和層析等4.4.結(jié)晶結(jié)晶樣品制備原則樣品制備原則v盡可能采用簡單方法進(jìn)行樣品處理，以避免蛋白丟失v細(xì)胞和組織樣品的制備應(yīng)盡可能減少蛋白的降解，低溫和蛋白酶抑制劑可以防止蛋白的降解v樣品裂解液應(yīng)該新鮮制備、并且分裝凍存于-80C,不要反復(fù)凍融已制備好的樣品v通過超速離心清除所有的雜質(zhì)v加入尿素之后加溫不要超過37C,

5、防止氨甲?；揎椀鞍讖纳飿悠烦樘岬鞍踪|(zhì)從生物樣品抽提蛋白質(zhì)v去污裂解：溶解細(xì)胞膜裂解細(xì)胞如SDSv還原劑：用于還原二硫鍵或防止蛋白質(zhì)氧化如巰基乙醇、硫脲v變性劑：用于改變?nèi)芤弘x子強(qiáng)度和PH，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)v酶裂解：用酶來消化細(xì)胞器如溶菌酶、纖維素酶、果膠酶等v滲透裂解：用低滲溶液懸浮細(xì)胞v凍融裂解：用液氮迅速冷凍細(xì)胞，隨后在37C融化，反復(fù)幾次劇烈的蛋白裂解劇烈的蛋白裂解v超聲裂解法：通過超聲波切應(yīng)力來裂解細(xì)胞，在劇烈的攪拌狀態(tài)下會產(chǎn)生剪切效果v弗氏壓碎器：在高壓下迫使細(xì)胞穿過小孔徑產(chǎn)生剪切力裂解細(xì)胞v研磨法：組織和細(xì)胞常凍存于液氮中，研磨成粉狀v機(jī)械勻漿法：將組織切成小片、勻

6、漿、過濾或離心獲得裂解液v玻璃珠勻漿法：劇烈震蕩的玻璃珠可以打破細(xì)胞壁，釋放細(xì)胞內(nèi)容物蛋白酶抑制劑防止蛋白裂解蛋白酶抑制劑防止蛋白裂解v 苯甲基磺酰氟PMSF: 不可逆抑制劑v AEBSF：滅活絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶v 金屬蛋白酶抑制劑乙二 胺四乙酸（EDTA）、乙二醇雙四乙酸(EGTA)v 肽蛋白酶抑制劑：亮以酶肽，抑制絲氨酸、半胱氨酸蛋白酶活性，為蛋白酶抑制劑A抑制酸性蛋白酶活性，抑蛋白酶肽抑制絲氨酸蛋白酶，本丁抑制素抑制氨基蛋白酶。v 甲苯磺酰賴氨酰氯甲酮（TLCK）、甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）: 不可逆抑制絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶。v Benzamidine: 抑制絲氨酸蛋

7、白酶蛋白質(zhì)的分離純化方法蛋白質(zhì)的分離純化方法根據(jù)分子大小不同的純化方法根據(jù)分子大小不同的純化方法 透析和超過濾透析和超過濾v利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜將其利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜將其 v 與小分子物質(zhì)分開與小分子物質(zhì)分開v半透膜為玻璃紙或纖維素材料半透膜為玻璃紙或纖維素材料利用溶解度差別的純化方法利用溶解度差別的純化方法 1. 1.等電點(diǎn)沉淀等電點(diǎn)沉淀 調(diào)整溶液調(diào)整溶液pH 不同蛋白在各自不同蛋白在各自 pI處依次沉淀處依次沉淀 2.2.鹽溶和鹽析鹽溶和鹽析 3.有機(jī)溶劑分級分離法有機(jī)溶劑分級分離法 降低介電常數(shù)降低介電常數(shù) 爭奪水化膜爭奪水化膜蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀（一）膠體性

8、質(zhì)（一）膠體性質(zhì)（colloidal system）膠體溶液的特點(diǎn)：膠體溶液的特點(diǎn)：w分子直徑在分子直徑在1-100 nm1-100 nm內(nèi)內(nèi)w溶于水溶于水w不易聚集沉淀不易聚集沉淀大多數(shù)球狀蛋白能形成穩(wěn)定的親水膠體溶液大多數(shù)球狀蛋白能形成穩(wěn)定的親水膠體溶液蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)的沉淀 蛋白蛋白從膠體溶液中析出從膠體溶液中析出 可逆沉淀：可逆沉淀： 溫和條件，改變?nèi)芤簻睾蜅l件，改變?nèi)芤簆H或或蛋白所蛋白所帶電荷帶電荷 蛋白蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沒有變化結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沒有變化 適當(dāng)條件下可重新溶解適當(dāng)條件下可重新溶解 非變性沉淀非變性沉淀vpI沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等 不

9、可逆沉淀不可逆沉淀v強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件v破壞破壞Pr膠體溶液穩(wěn)定性膠體溶液穩(wěn)定性v也破壞也破壞Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)v沉淀不能再重新溶解沉淀不能再重新溶解變性沉淀變性沉淀v如加熱沉淀、強(qiáng)酸如加熱沉淀、強(qiáng)酸/ /堿沉淀、重金屬鹽堿沉淀、重金屬鹽 和生物堿沉淀等和生物堿沉淀等蛋白質(zhì)分離的常用技術(shù)蛋白質(zhì)分離的常用技術(shù)v 1、沉淀，、沉淀， v 2、電泳：蛋白質(zhì)在高于或低于其等電點(diǎn)的溶液中是帶電的，在電場、電泳：蛋白質(zhì)在高于或低于其等電點(diǎn)的溶液中是帶電的，在電場中能向電場的正極或負(fù)極移動。根據(jù)支撐物不同，有薄膜電泳、凝膠中能向電場的正極或負(fù)極移動。根據(jù)支撐物不同，有薄膜電泳、凝膠電泳等。電泳等

10、。 v 3、透析：利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。、透析：利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。 v 4、層析：、層析： v a.離子交換層析，利用蛋白質(zhì)的兩性游離性質(zhì)，在某一特定離子交換層析，利用蛋白質(zhì)的兩性游離性質(zhì)，在某一特定PH時(shí)，時(shí)，各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同，故可以通過離子交換層析得以分離。各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同，故可以通過離子交換層析得以分離。如陰離子交換層析，含負(fù)電量小的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。如陰離子交換層析，含負(fù)電量小的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。 v b.分子篩，又稱凝膠過濾。小分子蛋白質(zhì)進(jìn)入孔內(nèi)，滯留時(shí)間長，分子篩，又稱凝膠過濾。小分子蛋白質(zhì)進(jìn)入

11、孔內(nèi)，滯留時(shí)間長，大分子蛋白質(zhì)不能同時(shí)入孔內(nèi)而徑直流出。大分子蛋白質(zhì)不能同時(shí)入孔內(nèi)而徑直流出。 v 5、超速離心：既可以用來分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測定蛋白質(zhì)的、超速離心：既可以用來分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測定蛋白質(zhì)的分子量。不同蛋白質(zhì)其密度與形態(tài)各不相同而分開。分子量。不同蛋白質(zhì)其密度與形態(tài)各不相同而分開。 沉淀法沉淀法v 1、鹽析法、鹽析法 v 鹽析法的根據(jù)是蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中，溶解度會隨鹽濃度的增高鹽析法的根據(jù)是蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中，溶解度會隨鹽濃度的增高而上升，但當(dāng)鹽濃度增高到一定數(shù)值時(shí)，使水活度降低，進(jìn)而導(dǎo)致蛋而上升，但當(dāng)鹽濃度增高到一定數(shù)值時(shí)，使水活度降低，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面電荷

12、逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質(zhì)白質(zhì)分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子間互相凝聚并從溶液中析出。分子間互相凝聚并從溶液中析出。 v 2、有機(jī)溶劑沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法 v 有機(jī)溶劑能降低蛋白質(zhì)溶解度的原因有二：其一、與鹽溶液一樣有機(jī)溶劑能降低蛋白質(zhì)溶解度的原因有二：其一、與鹽溶液一樣具有脫水作用；其二、有機(jī)溶劑的介電常數(shù)比水小，導(dǎo)致溶劑的極性具有脫水作用；其二、有機(jī)溶劑的介電常數(shù)比水小，導(dǎo)致溶劑的極性減小。減小。 v 3、蛋白質(zhì)沉淀劑、蛋白質(zhì)沉淀劑 v 蛋白質(zhì)沉淀劑僅對一類或一種蛋白質(zhì)沉淀起作用，常見的有堿性蛋白質(zhì)沉淀劑僅對一類或一種蛋白質(zhì)沉淀起作用，常見

13、的有堿性蛋白質(zhì)、凝集素和重金屬等。蛋白質(zhì)、凝集素和重金屬等。 v 4、聚乙二醇沉淀作用、聚乙二醇沉淀作用 v 聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質(zhì)聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀作用。發(fā)生沉淀作用。 v 5、選擇性沉淀法、選擇性沉淀法 v 根據(jù)各種蛋白質(zhì)在不同物理化學(xué)因子作用下穩(wěn)定性不同的特點(diǎn)，根據(jù)各種蛋白質(zhì)在不同物理化學(xué)因子作用下穩(wěn)定性不同的特點(diǎn)，用適當(dāng)?shù)倪x擇性沉淀法，即可使雜蛋白變性沉淀，而欲分離的有效成用適當(dāng)?shù)倪x擇性沉淀法，即可使雜蛋白變性沉淀，而欲分離的有效成分則存在于溶液中，從而達(dá)到純化有效成分的目的。分則存在于溶液中，從而達(dá)到純化

14、有效成分的目的。 蛋白沉淀步驟蛋白沉淀步驟v硫酸銨沉淀（鹽析）：高鹽溶液中蛋白質(zhì)聚合而沉淀vTCA沉淀（三氯醋酸沉淀）：TCA 10%-20%，蛋白質(zhì)可冰上沉淀，用丙酮和乙酸清洗沉淀。去除TCAv丙酮沉淀：3倍體積的冰丙酮，蛋白在-20度沉淀，離心沉淀蛋白，丙酮通過空氣或凍干去除v在丙酮中用TCA三氯醋酸沉淀：兩者聯(lián)合使用更有效，10%的TCA在丙酮中重懸裂解樣品溶液v用苯酚提取，隨后在甲醇中醋酸銨沉淀：蛋白質(zhì)被提取到飽和酚中，在甲醇中用醋酸銨從酚相中沉淀蛋白，丙酮清洗血液透析血液透析小分子溶出小分子被帶出小分子被帶出透析機(jī)透析機(jī)透析液透析液加加壓壓血液血液透析透析只用于除鹽類和小分子雜質(zhì)只用

15、于除鹽類和小分子雜質(zhì) 完整蛋白質(zhì)的分離完整蛋白質(zhì)的分離v1D-SDS-PAGEv2D-SDS-PAGEvIEF(制備等電聚焦)vHPLCv離子交換或親和層析電泳法電泳法v類型：1、區(qū)帶電泳 紙電泳、醋酸纖維素薄膜電泳、粉末電泳、細(xì)絲電泳、凝膠電泳。 凝膠電泳包括：瓊脂糖凝膠、淀粉凝膠、硅膠凝膠、聚丙烯酰胺凝膠。 聚丙烯酰胺凝膠包括：垂直板電泳、盤狀電泳、等電聚焦電泳、梯度電泳、免疫電泳。 2、自由界面電泳：支持物為溶液，很少用。聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳v通過丙烯酰胺單體和N，N，-甲叉雙丙烯酰胺按一定比率混合，在有引發(fā)劑和增速劑存在下聚合形成交叉網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，丙烯酰胺單體聚合生成長鏈聚

16、合物，甲叉雙丙烯酰胺的雙功能和鏈末端的自由功能基團(tuán)反應(yīng)，發(fā)生交聯(lián)，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)v等電聚焦凝膠，按等電點(diǎn)不同分離蛋白質(zhì)，SDS-PAGE按相對分子質(zhì)量大小分離蛋白質(zhì)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳v蛋白質(zhì)在電場中的遷移率取決于它所帶的凈電荷以及分子大小和形狀等因素。加入SDS（十二烷基磺酸鈉）和少量巰基乙醇，則蛋白質(zhì)分子的遷移率主要取決于它的分子量，而與原來所帶電荷、分子形狀無關(guān)。SDS是變性劑，它能破裂蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和疏水作用。巰基乙醇打開二硫鍵，因此使蛋白質(zhì)分子處于伸展?fàn)顟B(tài)。此時(shí)SDS以其烴鏈與蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈結(jié)合成復(fù)合物，大約每兩個(gè)氨基酸殘基結(jié)合一個(gè)SDS分子。等電聚焦（等電

17、聚焦（Isoelectric focusing） v(1)以不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的差異分離。(2)凝膠中含有蛋白質(zhì)樣品和載體兩性電解質(zhì)。(3)載體兩性電解質(zhì)： 一維等電聚焦電泳一維等電聚焦電泳v蛋白質(zhì)在不同PH值的溶液中帶電荷情況是不同的，在低的PH條件下，蛋白質(zhì)靜電荷為正，在高PH條件下靜電荷為負(fù)，在某一PH的溶液中，蛋白質(zhì)的靜電荷為零，則此PH值為該蛋白的等電點(diǎn)v蛋白質(zhì)等電點(diǎn)取決與氨基酸的組成，是一個(gè)物理化學(xué)常數(shù)v如果外加一個(gè)電場，蛋白質(zhì)會在電場作用下分別向正極和負(fù)極漂移，當(dāng)達(dá)到等電點(diǎn)位置時(shí)，蛋白不帶電，就不在漂移，這就是等電聚焦電泳的基本原理雙向凝膠電泳（雙向凝膠電泳（2-DE）原理原理v

18、Smithies和Poulik(1956 )最早引入二維電泳技術(shù)，OFarrell（1975）根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和相對分子質(zhì)量的特異性將蛋白質(zhì)混合物在第一個(gè)方向上按照等電點(diǎn)高低進(jìn)行分離，在第二個(gè)方向上按照相對分子質(zhì)量大小進(jìn)行分離v二維電泳分離后的蛋白質(zhì)點(diǎn)經(jīng)顯色，通過圖象掃描存檔，最后是呈現(xiàn)出來的是二維方向排列的，呈漫天星狀的小原點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)蛋白質(zhì) 雙向電泳原理簡明雙向電泳原理簡明, ,第一向進(jìn)行等電第一向進(jìn)行等電聚焦聚焦, ,蛋白質(zhì)沿梯度分離至各自的等蛋白質(zhì)沿梯度分離至各自的等電點(diǎn)電點(diǎn), ,隨后隨后, ,再沿垂直的方向進(jìn)行分子量再沿垂直的方向進(jìn)行分子量的分離的分離. . 目前目前, ,隨

19、著技術(shù)的飛速發(fā)展隨著技術(shù)的飛速發(fā)展, ,已已能分離出能分離出1000010000個(gè)斑點(diǎn)個(gè)斑點(diǎn)( () )。 銀染已成為一種檢測銀染已成為一種檢測2- D2- D的流行方法的流行方法, ,可檢測可檢測少到少到2 25 5的蛋白的蛋白, ,因此較考馬斯亮藍(lán)因此較考馬斯亮藍(lán)- 250- 250敏敏感感. . 多數(shù)糖蛋白不能被考馬斯亮藍(lán)染色多數(shù)糖蛋白不能被考馬斯亮藍(lán)染色. . 另有一種改良的另有一種改良的2- 2- ( (差異凝膠電泳差異凝膠電泳),),即應(yīng)即應(yīng)用兩種不同的染料熒光標(biāo)記兩個(gè)樣品用兩種不同的染料熒光標(biāo)記兩個(gè)樣品, ,使在同一凝膠使在同一凝膠上電泳后的凝膠圖象為兩個(gè)上電泳后的凝膠圖象為兩個(gè)

20、, ,避免了幾種避免了幾種2 -2 -的的比較比較, ,可在納克級進(jìn)行檢測可在納克級進(jìn)行檢測. . 等電聚焦電泳等電聚焦電泳雙向電泳雙向電泳1D-SDS-PAGE2D-SDS-PAGE第一向 IEF電泳染色第二向 SDS-PAGE電泳圖像采集和分析蛋白斑點(diǎn)的切取樣品制備實(shí)驗(yàn)樣品的制備原則實(shí)驗(yàn)樣品的制備原則v應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。v防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。v防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。v完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。v盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研

21、究蛋白的可檢測性。圖象分析技術(shù)圖象分析技術(shù)“滿天星滿天星”式的式的2 圖譜分析不能依靠本能的直覺圖譜分析不能依靠本能的直覺,每一每一個(gè)圖象上斑點(diǎn)的上調(diào)、下調(diào)及出現(xiàn)、消失個(gè)圖象上斑點(diǎn)的上調(diào)、下調(diào)及出現(xiàn)、消失,都可能在生理和病都可能在生理和病理狀態(tài)下產(chǎn)生理狀態(tài)下產(chǎn)生,必須依靠計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)處理必須依靠計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)處理,進(jìn)行定量分進(jìn)行定量分析析 在一系列高質(zhì)量的在一系列高質(zhì)量的2 凝膠產(chǎn)生凝膠產(chǎn)生(低背景染色低背景染色,高度的重高度的重復(fù)性復(fù)性)的前提下的前提下,圖象分析包括斑點(diǎn)檢測、背景消減、斑點(diǎn)配比圖象分析包括斑點(diǎn)檢測、背景消減、斑點(diǎn)配比和數(shù)據(jù)庫構(gòu)建。和數(shù)據(jù)庫構(gòu)建。 采集圖象通常所用的

22、系統(tǒng)是電荷耦合采集圖象通常所用的系統(tǒng)是電荷耦合(charge coupled device) 照相機(jī)照相機(jī);激光密度儀激光密度儀(laser densitometers)和和Phospho或或Fluoro-imagers,對圖象進(jìn)行數(shù)字化對圖象進(jìn)行數(shù)字化 并成為以象素并成為以象素(pixels)為基礎(chǔ)的空間和網(wǎng)格為基礎(chǔ)的空間和網(wǎng)格 其次其次,在圖象灰度水平上過濾和變在圖象灰度水平上過濾和變形形,進(jìn)行圖象加工進(jìn)行圖象加工,以進(jìn)行斑點(diǎn)檢測以進(jìn)行斑點(diǎn)檢測. 目前雙向凝膠電泳一般只能分辨到目前雙向凝膠電泳一般只能分辨到1000-30001000-3000個(gè)個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)蛋白質(zhì)點(diǎn)(SPOT),(SPOT),

23、而一個(gè)細(xì)胞系可以表達(dá)上萬個(gè)基因而一個(gè)細(xì)胞系可以表達(dá)上萬個(gè)基因, ,加上蛋白質(zhì)加工修飾的多樣性加上蛋白質(zhì)加工修飾的多樣性, ,一個(gè)樣品中的蛋白種類一個(gè)樣品中的蛋白種類可達(dá)可達(dá)10106 6種。種。 對于一些低拷貝蛋白對于一些低拷貝蛋白, ,通常先將蛋白粗提液通過親通常先將蛋白粗提液通過親和柱純化和柱純化, ,再由一維或二維電泳分離。單向電泳的優(yōu)點(diǎn)再由一維或二維電泳分離。單向電泳的優(yōu)點(diǎn)在于幾乎所有蛋白質(zhì)均溶于在于幾乎所有蛋白質(zhì)均溶于, ,分子量在分子量在10000-10000-300000300000范圍內(nèi)均能有效分離范圍內(nèi)均能有效分離, ,極酸、極堿蛋白極易檢出。極酸、極堿蛋白極易檢出。 雙向凝

24、膠電泳原理簡明雙向凝膠電泳原理簡明, ,第一向進(jìn)行等電聚焦第一向進(jìn)行等電聚焦, ,蛋白蛋白質(zhì)沿梯度分離質(zhì)沿梯度分離, ,至各自的等電點(diǎn)至各自的等電點(diǎn); ;隨后隨后, ,在沿垂直的在沿垂直的方向進(jìn)行分子量的分離。方向進(jìn)行分子量的分離。蛋白質(zhì)電泳圖像分析蛋白質(zhì)電泳圖像分析v電泳凝膠后圖象進(jìn)行備份保存，從而以數(shù)字化圖象形式存儲下來，盡量完整的保留定性和定量信息以進(jìn)一步分析，如總蛋白的點(diǎn)數(shù)，蛋白點(diǎn)的表達(dá)豐度的電量變化，蛋白點(diǎn)的缺失，利用雙向電泳凝膠分析軟件進(jìn)行分析二維凝膠電泳圖像采集二維凝膠電泳圖像采集v圖象分析基本上依賴與各個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的光密度值相對大小v圖象采集質(zhì)量的因素包括系統(tǒng)的分辨率、靈敏度、圖象對比度和明亮度v常見的可見光掃描儀、熒光、化學(xué)發(fā)光和磷屏掃描儀二維凝膠電泳圖像分析二維凝膠電泳圖像分析v蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)的統(tǒng)計(jì)、蛋白質(zhì)點(diǎn)的定位、編號和相對豐度分析v軟件可自動檢測出完整的蛋白質(zhì)點(diǎn)，圖象分析軟件有：melanie II&3、PDQuset 6.0、ImageMaster 2D Elite 3.10、Phoretix 2D 等v蛋白質(zhì)點(diǎn)檢測、背景消減、歸一化處理、蛋白質(zhì)點(diǎn)匹配結(jié)果輸出結(jié)果輸出v雙向電泳圖象分析會產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)，以表格的形式輸出或粘貼到Micro