實(shí)驗(yàn)一：線粒體和細(xì)胞核的制備與觀察

1、實(shí)驗(yàn)一 線粒體和細(xì)胞核的制備與觀察細(xì)胞內(nèi)線粒體的超活染色與觀察細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^動物肝細(xì)胞核、線粒體的分離，了通過動物肝細(xì)胞核、線粒體的分離，了解解細(xì)胞器分離的一般原理和方法細(xì)胞器分離的一般原理和方法。掌握用掌握用差速離心差速離心法分離動物細(xì)胞核及線法分離動物細(xì)胞核及線粒體的技術(shù)粒體的技術(shù).了解分級分離細(xì)胞核與線粒體的純度檢了解分級分離細(xì)胞核與線粒體的純度檢測方法測方法學(xué)習(xí)線粒體學(xué)習(xí)線粒體活性染色活性染色技術(shù)技術(shù), 觀察活細(xì)胞內(nèi)觀察活細(xì)胞內(nèi)線粒體的形態(tài)、數(shù)量與分布線粒體的形態(tài)、數(shù)量與分布實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 制備線粒體及細(xì)胞核

2、采用組織勻漿在懸浮介質(zhì)中進(jìn)行制備線粒體及細(xì)胞核采用組織勻漿在懸浮介質(zhì)中進(jìn)行差速離心差速離心的方法。的方法。 懸浮介質(zhì)通常采用懸浮介質(zhì)通常采用一定一定pHpH的緩沖蔗糖溶液的緩沖蔗糖溶液，它較接近細(xì)胞質(zhì)的分散相，它較接近細(xì)胞質(zhì)的分散相，在一定程度上能保持細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性在一定程度上能保持細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性。 線粒體內(nèi)膜上分布有細(xì)胞色素氧化酶線粒體內(nèi)膜上分布有細(xì)胞色素氧化酶, ,該酶能使脂溶性的詹納斯綠該酶能使脂溶性的詹納斯綠B B染料染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍(lán)綠色，從而使線粒體顯色，而胞質(zhì)中的染料被還保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍(lán)綠色，從而使線粒體顯色，而胞質(zhì)中的染料被還原成無色原成無色. . 線

3、粒體線粒體能在詹納斯綠能在詹納斯綠B B染液中維持活性數(shù)小時，通過染色，可以在高倍顯染液中維持活性數(shù)小時，通過染色，可以在高倍顯微鏡下觀察到生活狀態(tài)的線粒體的形態(tài)和分布；微鏡下觀察到生活狀態(tài)的線粒體的形態(tài)和分布； 詹納斯綠詹納斯綠B B是一種是毒性較小的是一種是毒性較小的堿性染料，能對動植物的細(xì)胞或組織在堿性染料，能對動植物的細(xì)胞或組織在活活體狀態(tài)下體狀態(tài)下進(jìn)行無毒害的染色，其原理主要是堿性染料的膠粒表面帶有陽進(jìn)行無毒害的染色，其原理主要是堿性染料的膠粒表面帶有陽離子，而被染部分本身具有陰離子，這樣，離子，而被染部分本身具有陰離子，這樣，它們彼此之間發(fā)生吸引作用，它們彼此之間發(fā)生吸引作用，染料

4、就被堆積下來。染料就被堆積下來。 細(xì)胞核細(xì)胞核DNADNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，兩條鏈上的磷酸基向外，帶負(fù)電荷，呈酸的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，兩條鏈上的磷酸基向外，帶負(fù)電荷，呈酸性，很容易與性，很容易與帶正電荷的堿性染料帶正電荷的堿性染料以離子或氫鍵結(jié)合而被染色，此外，以離子或氫鍵結(jié)合而被染色，此外，由于核蛋白中還有少量的弱酸性物質(zhì)，因此，由于核蛋白中還有少量的弱酸性物質(zhì)，因此，詹納斯綠詹納斯綠B B也能被堆積下來也能被堆積下來而使細(xì)胞核呈現(xiàn)而使細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色。藍(lán)色。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)活體染色活體染色活體染色是指對生活有機(jī)體的細(xì)胞或組織能著活體染色是指對生活有機(jī)體的細(xì)胞或

5、組織能著色但又無毒害的一種染色方法。色但又無毒害的一種染色方法。它的目的是顯示生活細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，而不它的目的是顯示生活細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，而不影響細(xì)胞的生命活動和產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變影響細(xì)胞的生命活動和產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變化以致引起細(xì)胞的死亡?；灾乱鸺?xì)胞的死亡?；钊炯夹g(shù)可用來研究生活狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)結(jié)活染技術(shù)可用來研究生活狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、病理狀態(tài)。構(gòu)和生理、病理狀態(tài)。 活體染色活體染色 根據(jù)所用染色劑的性質(zhì)和染色方法不同，根據(jù)所用染色劑的性質(zhì)和染色方法不同，通常把活體通常把活體染色分為染色分為體內(nèi)活染體內(nèi)活染和和體外活染體外活染兩類。兩類。 體內(nèi)活體染色：體內(nèi)活體染色：是以膠

6、體狀的染料溶液注入動、植物體內(nèi)，是以膠體狀的染料溶液注入動、植物體內(nèi)，染料的膠粒固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊結(jié)構(gòu)里，達(dá)到易于染料的膠粒固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊結(jié)構(gòu)里，達(dá)到易于識別的目的。識別的目的。 體外活體染色體外活體染色( (超活染色超活染色) )：它是由活的動、植物分離出部分它是由活的動、植物分離出部分細(xì)胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活細(xì)細(xì)胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活細(xì)胞的某種結(jié)構(gòu)上而顯色。胞的某種結(jié)構(gòu)上而顯色。 作為活體染色劑作為活體染色劑：對細(xì)胞無毒性或毒性極小的染料，對細(xì)胞無毒性或毒性極小的染料，而且總要配成稀淡的溶液來使用。而且總要配成稀淡的溶

7、液來使用。 活體染料多為堿性染料活體染料多為堿性染料, ,如中性紅如中性紅, ,詹納斯綠詹納斯綠B,B,次甲基藍(lán)等次甲基藍(lán)等 對某種細(xì)胞器的染色具有專一性對某種細(xì)胞器的染色具有專一性, ,如中性紅染液泡如中性紅染液泡, Janus , Janus green Bgreen B染線粒體。染線粒體。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用品實(shí)驗(yàn)用品 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料小白鼠肝臟小白鼠肝臟人口腔粘膜上皮細(xì)胞人口腔粘膜上皮細(xì)胞用頸椎脫臼法處死小鼠，置于解剖盤中剪開腹腔，取小白鼠用頸椎脫臼法處死小鼠，置于解剖盤中剪開腹腔，取小白鼠肝剪成小塊放入小燒杯內(nèi)用吸管吸取生理鹽水，反復(fù)浸泡沖肝

8、剪成小塊放入小燒杯內(nèi)用吸管吸取生理鹽水，反復(fù)浸泡沖洗肝臟，洗去血液。洗肝臟，洗去血液。 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)用品實(shí)驗(yàn)用品實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑0.25mol/L0.25mol/L蔗糖蔗糖+0.01mol/L+0.01mol/L三羥甲基氨基甲烷三羥甲基氨基甲烷(Tris)-(Tris)-鹽酸緩沖液鹽酸緩沖液(pH7.4) (pH7.4) 0.2%0.2%和和0.02%0.02%詹納斯綠詹納斯綠B(Janus green B)B(Janus green B)染液染液 生理鹽水生理鹽水 儀器、用具：儀器、用具：顯微鏡，高速冷凍離心機(jī)顯微鏡，高速冷凍離心機(jī), ,玻璃

9、勻玻璃勻漿器漿器, ,解剖器具，剪刀，漏斗，尼龍解剖器具，剪刀，漏斗，尼龍網(wǎng)網(wǎng)，刻度離心，刻度離心管管等等細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.1.小鼠細(xì)胞器小鼠細(xì)胞器( (細(xì)胞核細(xì)胞核, ,線粒體線粒體) )的分離提取的分離提取2.2.分離提取物分離提取物( (細(xì)胞核細(xì)胞核, ,線粒體線粒體) )鑒定鑒定3.3.人口腔粘膜上皮細(xì)胞線粒體超活染色人口腔粘膜上皮細(xì)胞線粒體超活染色1.1.細(xì)胞器細(xì)胞器( (細(xì)胞核細(xì)胞核, ,線粒體線粒體) )的分離提取的分離提取(1(1）獲取肝臟：獲取肝臟：用頸椎脫臼法處死小鼠用頸椎脫臼法處死小鼠, ,置于解剖盤中剪開置于解剖

10、盤中剪開腹腔腹腔, ,迅速取出小鼠肝迅速取出小鼠肝, ,稱重稱重1 1克克放入小燒杯內(nèi)用吸管吸取放入小燒杯內(nèi)用吸管吸取預(yù)冷預(yù)冷的生理鹽水洗凈血液。的生理鹽水洗凈血液。(2(2）勻漿：勻漿：將鼠肝將鼠肝剪碎剪碎置于置于預(yù)冷預(yù)冷的的0.25mol/L0.25mol/L蔗糖緩沖液中蔗糖緩沖液中洗滌數(shù)次至鼠肝洗滌數(shù)次至鼠肝發(fā)白發(fā)白。然后置于玻璃勻漿器中，加入。然后置于玻璃勻漿器中，加入1010mlml預(yù)冷預(yù)冷的的0.25mol/L0.25mol/L蔗糖緩沖液勻漿至肝組織基本碎裂蔗糖緩沖液勻漿至肝組織基本碎裂( (分次加入分次加入緩沖緩沖液液) )。（。（注：整過程在冰浴上進(jìn)行注：整過程在冰浴上進(jìn)行）(

11、3(3）過濾：過濾：雙層尼龍布將勻漿液過濾到雙層尼龍布將勻漿液過濾到預(yù)冷預(yù)冷的小燒杯中。的小燒杯中。實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟（4）細(xì)胞核與線粒體分離：細(xì)胞核與線粒體分離：勻漿濾液勻漿濾液8mL，1000g離心離心10min 沉淀沉淀1 1（細(xì)胞核及碎片細(xì)胞核及碎片）涂片涂片A上清液上清液 1 1( (涂片涂片B, ,鑒定細(xì)胞核、線粒體鑒定細(xì)胞核、線粒體) )重懸沉淀并洗滌重懸沉淀并洗滌1次次（8mL預(yù)冷的預(yù)冷的0.25mol/L蔗糖緩蔗糖緩沖液，沖液，1000g 離心離心10min）沉淀沉淀2 2（細(xì)胞核及碎片細(xì)胞核及碎片）涂片涂片D11000g離心離心10 min沉淀沉淀3 3（線粒體線粒體）涂片涂

12、片E上清液上清液 3 3涂片涂片F(xiàn) F上清液上清液 2 2（涂片涂片C）注意：沉淀與上清液從離心機(jī)取出后均要置于冰浴上注意：沉淀與上清液從離心機(jī)取出后均要置于冰浴上細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 取懸液取懸液1 滴，置載玻片滴，置載玻片一端，取另一邊緣光滑一端，取另一邊緣光滑的載片，放在懸液滴前的載片，放在懸液滴前面慢慢向另一端推動力面慢慢向另一端推動力移，保持推片與載片移，保持推片與載片30 45角，液滴即沿角，液滴即沿推片散開，推片散開，注意用力平注意用力平穩(wěn)均勻，穩(wěn)均勻，載片上便留下載片上便留下一層薄膜。一層薄膜。 涂片示意圖涂片示意圖2.2.分離提取物分離提取

13、物( (細(xì)胞核細(xì)胞核, ,線粒體線粒體) )鑒定鑒定將共將共6 6張張涂片涂片，不待干即滴加，不待干即滴加0.2%Janus greenB0.2%Janus greenB染色染色15-20min15-20min后后, ,蓋上蓋玻片，鏡檢蓋上蓋玻片，鏡檢l線粒體線粒體呈藍(lán)綠色呈藍(lán)綠色, ,圓形、橢圓或圓形、橢圓或短棒狀短棒狀顆粒顆粒。如如果線粒體聚集成堆則被染成深藍(lán)色絮狀，難以辨果線粒體聚集成堆則被染成深藍(lán)色絮狀，難以辨認(rèn)認(rèn)。l細(xì)胞核呈細(xì)胞核呈深藍(lán)色。深藍(lán)色。l血細(xì)胞血細(xì)胞不著色。不著色。注意：注意：得到的沉淀物須得到的沉淀物須加加預(yù)冷預(yù)冷0.25mol/L0.25mol/L蔗糖緩沖液將蔗糖緩沖

14、液將其懸浮后再裝片其懸浮后再裝片，制線粒體裝片時，懸浮液只需一小，制線粒體裝片時，懸浮液只需一小滴，量太多線粒體易聚集成堆，不便觀察。滴，量太多線粒體易聚集成堆，不便觀察。 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟3.3.人口腔粘膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色觀察人口腔粘膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色觀察將載玻片將載玻片( (必須十分清潔必須十分清潔) )平放在桌面上，滴平放在桌面上，滴2 2滴滴0.02%0.02%詹納詹納斯綠斯綠B B染液于載玻片中央；染液于載玻片中央； 用消毒牙簽的鈍端在自己口腔頰粘膜處稍用力刮取口腔上用消毒牙簽的鈍端在自己口腔頰粘

15、膜處稍用力刮取口腔上皮細(xì)胞皮細(xì)胞( (粘液狀物粘液狀物) )，均勻地涂布在載玻片上的染液中，染，均勻地涂布在載玻片上的染液中，染色色5-15min (5-15min (注意不可使染液干燥，必要時可再加滴染液注意不可使染液干燥，必要時可再加滴染液) )，蓋上玻片，四周溢出的染液用吸水紙吸干；蓋上玻片，四周溢出的染液用吸水紙吸干； 低倍鏡下，選擇平展的口腔上皮細(xì)胞，換高倍鏡或油鏡觀低倍鏡下，選擇平展的口腔上皮細(xì)胞，換高倍鏡或油鏡觀察。可見扁平狀上皮細(xì)胞的核周圍胞質(zhì)中分布著一些被染察?？梢姳馄綘钌掀ぜ?xì)胞的核周圍胞質(zhì)中分布著一些被染成成藍(lán)綠色的顆粒狀或短棒狀藍(lán)綠色的顆粒狀或短棒狀的結(jié)構(gòu)，即為線粒體的結(jié)

16、構(gòu)，即為線粒體 。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖圖2：人口腔粘膜上皮細(xì)胞：人口腔粘膜上皮細(xì)胞(示線粒體示線粒體)圖圖1：小鼠肝細(xì)胞核：小鼠肝細(xì)胞核在光學(xué)顯微鏡油鏡下進(jìn)行觀察：在光學(xué)顯微鏡油鏡下進(jìn)行觀察：功能功能完整的線粒體呈現(xiàn)藍(lán)綠色圓形或棒狀完整的線粒體呈現(xiàn)藍(lán)綠色圓形或棒狀顆粒（顆粒（綠色箭頭所指）綠色箭頭所指）（注意：注意：可見藍(lán)綠色漸漸變淡現(xiàn)象，可見藍(lán)綠色漸漸變淡現(xiàn)象，藍(lán)綠色強(qiáng)度顯著減弱或呈現(xiàn)無色，表藍(lán)綠色強(qiáng)度顯著減弱或呈現(xiàn)無色，表明線粒體細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)功能不明線粒體細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)功能不全或功能喪失全或功能喪失 ）注：注：紅色箭頭所指為細(xì)

17、胞核紅色箭頭所指為細(xì)胞核細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)圖圖3：在顯微鏡下觀察到的鼠肝臟離體線粒體在顯微鏡下觀察到的鼠肝臟離體線粒體細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 勻漿緩沖液預(yù)冷(4 ) 冰浴上研磨，勻漿搗桿垂直揷入勻漿管中，上下轉(zhuǎn)動研磨3-5次，盡可能充分破碎細(xì)胞 (適度研磨)，縮短勻漿時間。 試驗(yàn)全過程要在04進(jìn)行,離心機(jī)溫度設(shè)為 4 整個分離過程不宜過長,要盡快。 離心機(jī)使用：離心管要平衡 g為離心力(RCF)RCF(g)=1.11810-5 r (rpm)2r:有效半徑(cm), rpm:轉(zhuǎn)速(轉(zhuǎn)/分)注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)只有只有3臺可用的

18、冷凍離心機(jī)，每一次的離心時間較長，因臺可用的冷凍離心機(jī)，每一次的離心時間較長，因此，全班同學(xué)要配合好，每次運(yùn)轉(zhuǎn)務(wù)必滿負(fù)荷此，全班同學(xué)要配合好，每次運(yùn)轉(zhuǎn)務(wù)必滿負(fù)荷.細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)1.1.分別描述六張裝片的結(jié)果分別描述六張裝片的結(jié)果( (如如逐級分離中看到哪逐級分離中看到哪些細(xì)胞組些細(xì)胞組分，分，平均每個視野中所見完整的細(xì)胞核平均每個視野中所見完整的細(xì)胞核數(shù)量數(shù)量, ,完整的細(xì)胞或帶有殘留細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞核的約完整的細(xì)胞或帶有殘留細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞核的約占多少，占多少，等等) )2.2.根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和你所獲得的知識根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和你所獲得的知識, ,你認(rèn)為用你

19、認(rèn)為用此分離方法所分離的線粒體的純度如何此分離方法所分離的線粒體的純度如何? ?有什么改有什么改進(jìn)方法？進(jìn)方法？3.3.繪出人口腔繪出人口腔粘膜粘膜上皮細(xì)胞圖上皮細(xì)胞圖( (示線粒體的形態(tài)與示線粒體的形態(tài)與分布分布) )實(shí)驗(yàn)報告實(shí)驗(yàn)報告細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞器分離的過程包括兩個主要階段：細(xì)胞器分離的過程包括兩個主要階段：破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞細(xì)胞組分的分離細(xì)胞組分的分離常用的細(xì)胞破碎方法常用的細(xì)胞破碎方法方方法法技術(shù)技術(shù) 原理原理效效果果成本成本舉例舉例機(jī)機(jī)械械法法勻漿法勻漿法細(xì)胞被攪拌器劈碎或細(xì)胞被攪拌器劈碎或受剪切力而破碎受剪切力而破碎適中適中適中適中動植物

20、組織或細(xì)胞動植物組織或細(xì)胞研磨法研磨法細(xì)胞被研磨物磨碎細(xì)胞被研磨物磨碎適中適中便宜便宜植物組織植物組織超聲波法超聲波法用超聲波的空穴作用用超聲波的空穴作用使細(xì)胞破碎使細(xì)胞破碎劇烈劇烈昂貴昂貴細(xì)胞懸浮液小規(guī)模處理細(xì)胞懸浮液小規(guī)模處理珠磨破碎法珠磨破碎法細(xì)胞被玻璃珠或鐵珠細(xì)胞被玻璃珠或鐵珠搗碎搗碎劇烈劇烈便宜便宜細(xì)胞懸浮液和植物細(xì)胞細(xì)胞懸浮液和植物細(xì)胞大規(guī)模處理大規(guī)模處理化化學(xué)學(xué)法法滲透沖擊滲透沖擊滲透壓破壞細(xì)胞滲透壓破壞細(xì)胞溫和溫和便宜便宜血紅細(xì)胞的破壞血紅細(xì)胞的破壞酶消化法酶消化法細(xì)胞壁或細(xì)胞膜被消細(xì)胞壁或細(xì)胞膜被消化，使細(xì)胞破碎化，使細(xì)胞破碎溫和溫和昂貴昂貴動植物細(xì)胞動植物細(xì)胞增溶法增溶法表

21、面活性劑溶解細(xì)胞表面活性劑溶解細(xì)胞膜膜溫和溫和適中適中破碎大腸桿菌破碎大腸桿菌脂溶法脂溶法有機(jī)溶劑溶解細(xì)胞壁有機(jī)溶劑溶解細(xì)胞壁適中適中便宜便宜甲苯破碎酵母細(xì)胞甲苯破碎酵母細(xì)胞堿處理法堿處理法堿的皂化作用使細(xì)胞堿的皂化作用使細(xì)胞壁溶解壁溶解劇烈劇烈便宜便宜破碎大腸桿菌破碎大腸桿菌細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)離心分離技術(shù)離心分離技術(shù)離心是分離細(xì)胞組分和生物大分子最常用的分離心是分離細(xì)胞組分和生物大分子最常用的分離方法，因?yàn)椴煌募?xì)胞器和分子有不同的體離方法，因?yàn)椴煌募?xì)胞器和分子有不同的體積和密度，可在不同離心力不同介質(zhì)沉降分離。積和密度，可在不同離心力不同介質(zhì)沉降分離

22、。分離各種細(xì)胞組分的方法主要有：分離各種細(xì)胞組分的方法主要有：差速離心差速離心 密度梯度離心密度梯度離心 l速率速率-區(qū)帶梯度離心區(qū)帶梯度離心 l等密度離心等密度離心細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)差速離心差速離心 主要是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的主要是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細(xì)胞器細(xì)胞器。起始的離心速度較低，讓較大的顆粒沉降到管底，小的顆粒起始的離心速度較低，讓較大的顆粒沉降到管底，小的顆粒仍然懸浮在上清液中。收集沉淀，改用較高的離心速度離心懸浮液，將仍然懸浮在上清液中。收集沉淀，改用較高的離心速度離心懸浮液，將較小的顆粒沉降，以此類推，

23、達(dá)到分離不同大小顆粒的目的。較小的顆粒沉降，以此類推，達(dá)到分離不同大小顆粒的目的。 差速離心的分辨率不高，沉降系數(shù)在同一個數(shù)量級內(nèi)差速離心的分辨率不高，沉降系數(shù)在同一個數(shù)量級內(nèi)的各種粒子不容易分開的各種粒子不容易分開，常用于其他分離手段之前的粗制品提取常用于其他分離手段之前的粗制品提取 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)密度梯度離心密度梯度離心用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞勻漿液混懸或置于介質(zhì)的的密度梯度，將細(xì)胞勻漿液混懸或置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細(xì)胞器分頂部，通過重力或離心力場的作用使

24、細(xì)胞器分層、分離的方法。這類分離又可分為層、分離的方法。這類分離又可分為速率速率- -區(qū)區(qū)帶梯度離心帶梯度離心和和等等密度梯度離心密度梯度離心兩種。兩種。優(yōu)點(diǎn)是一次離心可分離提純樣品中幾種組份，優(yōu)點(diǎn)是一次離心可分離提純樣品中幾種組份，用于較精細(xì)的分離。用于較精細(xì)的分離。細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)速率速率- -區(qū)帶梯度離心區(qū)帶梯度離心和和等密度梯度離心等密度梯度離心原理：原理：根據(jù)分離的粒子在梯度根據(jù)分離的粒子在梯度液中液中，通過離通過離心力場的作用，使不同的顆粒心力場的作用，使不同的顆粒在密度梯度層內(nèi)形成一系列區(qū)在密度梯度層內(nèi)形成一系列區(qū)帶，從而達(dá)到彼此分離的方法

25、。帶，從而達(dá)到彼此分離的方法。A、速率、速率-區(qū)帶梯度離心流程圖區(qū)帶梯度離心流程圖B、等密度梯度離心流程圖、等密度梯度離心流程圖原理：原理：根據(jù)不同顆粒在密度梯度介質(zhì)根據(jù)不同顆粒在密度梯度介質(zhì)中存在著中存在著，在離，在離心力場作心力場作用下，顆?；蛳蛳鲁两?，或向上浮起，用下，顆粒或向下沉降，或向上浮起，一直移動到與它們各自的密度恰好相一直移動到與它們各自的密度恰好相等的位置上形成區(qū)帶，從而使不同浮等的位置上形成區(qū)帶，從而使不同浮力密度的顆粒得到分離的方法。力密度的顆粒得到分離的方法。兩種密度梯度離心方法的異同兩種密度梯度離心方法的異同 特特 點(diǎn)點(diǎn)速率速率- -區(qū)帶梯度離心區(qū)帶梯度離心等密度離心

26、等密度離心分離方法的主要依據(jù)分離方法的主要依據(jù)主要依賴主要依賴分離的粒子在梯分離的粒子在梯度液中度液中依賴于樣品顆粒的不同密度來進(jìn)行依賴于樣品顆粒的不同密度來進(jìn)行離心分離的離心分離的 介質(zhì)密度梯度選擇介質(zhì)密度梯度選擇 最大密度必須小于樣品中最大密度必須小于樣品中粒子的最小密度；梯度平粒子的最小密度；梯度平緩緩覆蓋了待分離物質(zhì)的密度；梯度陡覆蓋了待分離物質(zhì)的密度；梯度陡度較高度較高 離心介質(zhì)的主要作用離心介質(zhì)的主要作用減緩顆粒擴(kuò)散速度減緩顆粒擴(kuò)散速度阻止顆粒移動；篩選與分離顆粒阻止顆粒移動；篩選與分離顆粒分辨率范圍分辨率范圍沉降系數(shù)相差沉降系數(shù)相差20%20%的物的物質(zhì)質(zhì) 顆粒密度差異大于顆粒密

27、度差異大于1% 1% 離心后區(qū)帶形成位置離心后區(qū)帶形成位置易變易變( (樣品易擴(kuò)散）樣品易擴(kuò)散）不變（樣品不擴(kuò)散）不變（樣品不擴(kuò)散）影響樣品區(qū)帶形成的主要因素影響樣品區(qū)帶形成的主要因素離心時間（過長或過短都離心時間（過長或過短都不利）不利）顆粒樣品密度顆粒樣品密度一般操作方法一般操作方法介質(zhì)梯度應(yīng)預(yù)先形成介質(zhì)梯度應(yīng)預(yù)先形成 ，離心前將樣品小心鋪放在離心前將樣品小心鋪放在密度梯度溶液表面，離心密度梯度溶液表面，離心后形成區(qū)帶。后形成區(qū)帶。 介質(zhì)梯度不需預(yù)先制備介質(zhì)梯度不需預(yù)先制備，離心時把，離心時把密度均一的介質(zhì)液和樣品混合后裝密度均一的介質(zhì)液和樣品混合后裝入離心管，入離心管，通過離心自形成梯度通過離心自形成梯度，讓顆粒在梯度中進(jìn)行再分配。讓顆粒在梯度中進(jìn)行再分配。常用介質(zhì)常用介質(zhì)蔗糖蔗糖、甘油、甘油蔗糖蔗糖 、甘油、甘油、 CsClCsCl、硫酸銫、溴、硫酸銫、溴化銫、三碘苯衍生物等?；C、三碘苯衍生物等。 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表表1:各種亞細(xì)胞構(gòu)造在各種亞細(xì)胞構(gòu)造在不同的離心介質(zhì)不同的離心介質(zhì)中分離所需的中分離所需的離心