PCR鑒定乳酸菌

1、 應(yīng)用特異應(yīng)用特異PCR快速鑒定微生快速鑒定微生物肥料中物肥料中4種乳酸菌種乳酸菌微生物學(xué)通報(bào)微生物學(xué)通報(bào) Microbiology China Apr. 20, 2014, 41(4): 674680 2014 by Institute of Microbiology, CAS摘要摘要 目的目的:植物乳桿菌植物乳桿菌 、鼠李糖乳桿菌、鼠李糖乳桿菌 、嗜酸乳、嗜酸乳桿菌和德氏乳桿菌是微生物肥料生產(chǎn)中常用的乳桿菌和德氏乳桿菌是微生物肥料生產(chǎn)中常用的乳酸菌，它們表型特征相似，若采用傳統(tǒng)方法鑒定酸菌，它們表型特征相似，若采用傳統(tǒng)方法鑒定則費(fèi)時(shí)費(fèi)力，為準(zhǔn)確、快速地鑒定這些菌種，建則費(fèi)時(shí)費(fèi)力，為準(zhǔn)確、快

2、速地鑒定這些菌種，建立種特異立種特異PCR方法。方法。 方法方法:利用利用 NCBI 中中 Primer-BLAST (引物設(shè)引物設(shè)計(jì)和特異性檢驗(yàn)工具計(jì)和特異性檢驗(yàn)工具)，以，以 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中上數(shù)據(jù)庫(kù)中上述菌種的述菌種的 recA 和和 gyrB 為靶基因，設(shè)計(jì)和篩選種為靶基因，設(shè)計(jì)和篩選種特異性引物從而建立相應(yīng)特異特異性引物從而建立相應(yīng)特異 PCR 鑒定方法。鑒定方法。 摘要摘要 結(jié)果：經(jīng)過(guò)乳桿菌屬、結(jié)果：經(jīng)過(guò)乳桿菌屬、 乳球菌屬、乳球菌屬、 片球菌屬、片球菌屬、芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬、短芽孢桿菌屬和假芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬、短芽孢桿菌屬和假單胞菌屬單胞菌屬7 個(gè)屬個(gè)屬 24

3、 個(gè)種共個(gè)種共 40 株標(biāo)準(zhǔn)菌株的實(shí)驗(yàn)株標(biāo)準(zhǔn)菌株的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，驗(yàn)證， 4 個(gè)目標(biāo)種分別擴(kuò)增出唯一的目的產(chǎn)物，個(gè)目標(biāo)種分別擴(kuò)增出唯一的目的產(chǎn)物，而其他種均無(wú)目的擴(kuò)增產(chǎn)物。采用建立的而其他種均無(wú)目的擴(kuò)增產(chǎn)物。采用建立的 4 種特種特異異 PCR 方法對(duì)產(chǎn)品中分離的方法對(duì)產(chǎn)品中分離的 16株乳桿菌進(jìn)行鑒株乳桿菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果與定，結(jié)果與 16S rDNA 序列分析、序列分析、 Biolog 鑒定結(jié)鑒定結(jié)果一致。果一致。 結(jié)論：建立的特異結(jié)論：建立的特異PCR 鑒定方法均具鑒定方法均具有較高的種內(nèi)通用性和種間特異性，可快有較高的種內(nèi)通用性和種間特異性，可快速、準(zhǔn)確的用于微生物制劑中植物乳桿菌、速、準(zhǔn)確的

4、用于微生物制劑中植物乳桿菌、德氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌德氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌的檢測(cè)和鑒定，具有較好的應(yīng)用前景。的檢測(cè)和鑒定，具有較好的應(yīng)用前景。引言引言 乳酸菌是指能發(fā)酵糖類且主要產(chǎn)物為乳酸的乳酸菌是指能發(fā)酵糖類且主要產(chǎn)物為乳酸的一類無(wú)芽孢、革蘭氏染色陽(yáng)性細(xì)菌的總稱。具有一類無(wú)芽孢、革蘭氏染色陽(yáng)性細(xì)菌的總稱。具有多種重要的生理功能，是食品和藥品行業(yè)中的重多種重要的生理功能，是食品和藥品行業(yè)中的重要菌種。在微生物肥料行業(yè)，以乳酸菌要菌種。在微生物肥料行業(yè)，以乳酸菌(主要是乳主要是乳桿菌桿菌)作為有效菌的產(chǎn)品越來(lái)越多，準(zhǔn)確的識(shí)別和作為有效菌的產(chǎn)品越來(lái)越多，準(zhǔn)確的識(shí)別和鑒定微

5、生物制劑中的各種菌是產(chǎn)品質(zhì)量判定的重鑒定微生物制劑中的各種菌是產(chǎn)品質(zhì)量判定的重要依據(jù)，要依據(jù)， 而選擇一種快速而準(zhǔn)確的鑒定方法尤為而選擇一種快速而準(zhǔn)確的鑒定方法尤為重要。重要。引言引言 乳桿菌屬的許多種其菌體、菌落形態(tài)特征乳桿菌屬的許多種其菌體、菌落形態(tài)特征相似難辨，生理生化特性也存在許多相似之處。相似難辨，生理生化特性也存在許多相似之處。傳統(tǒng)的生理生化試驗(yàn)耗時(shí)費(fèi)力，傳統(tǒng)的生理生化試驗(yàn)耗時(shí)費(fèi)力，Biolog 快速鑒快速鑒定系統(tǒng)、脂肪酸分析等測(cè)定繁瑣、成本高，不定系統(tǒng)、脂肪酸分析等測(cè)定繁瑣、成本高，不能滿足微生物肥料檢測(cè)中的快速、準(zhǔn)確的需要。能滿足微生物肥料檢測(cè)中的快速、準(zhǔn)確的需要。至今已有許多

6、分子鑒定技術(shù)和分類方法被用于至今已有許多分子鑒定技術(shù)和分類方法被用于乳酸菌的分類和鑒定。其中，特異乳酸菌的分類和鑒定。其中，特異( (引物引物)PCR)PCR技技術(shù)簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確及成本低。術(shù)簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確及成本低。引言引言 本實(shí)驗(yàn)以微生物肥料中常見(jiàn)的植物乳桿本實(shí)驗(yàn)以微生物肥料中常見(jiàn)的植物乳桿 菌、德氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和嗜酸乳桿 菌為材料，用菌為材料，用NCBI中中Primer-BLAST (引物設(shè)引物設(shè)計(jì)和特異性檢驗(yàn)工具計(jì)和特異性檢驗(yàn)工具)設(shè)計(jì)種特異性引物，而設(shè)計(jì)種特異性引物，而后通過(guò)優(yōu)化后通過(guò)優(yōu)化 PCR 反應(yīng)的退火溫度、引物濃度、反應(yīng)的退火溫度

7、、引物濃度、Mg2+等關(guān)鍵因子，建立等關(guān)鍵因子，建立 4 種菌的快速鑒定特種菌的快速鑒定特異異 PCR 方法，應(yīng)用于微生物肥料產(chǎn)品檢測(cè)過(guò)方法，應(yīng)用于微生物肥料產(chǎn)品檢測(cè)過(guò)程中的菌種識(shí)別與鑒定，以提高質(zhì)檢效率。程中的菌種識(shí)別與鑒定，以提高質(zhì)檢效率。材料與方法材料與方法 1.2.1 基因組基因組 DNA 模板的制備模板的制備：乳酸菌接種：乳酸菌接種MRS 瓊脂培養(yǎng)基，瓊脂培養(yǎng)基，37 C 厭氧培養(yǎng)厭氧培養(yǎng) 1624 h，膠凍樣，膠凍樣類芽孢桿菌接種于硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基，其他菌株類芽孢桿菌接種于硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基，其他菌株接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂， 30 C 培養(yǎng)培養(yǎng) 1624 h，用無(wú)菌，用無(wú)菌水

8、收集培養(yǎng)物，參照水收集培養(yǎng)物，參照 Bead-beater 法并作一定改法并作一定改進(jìn)快速提取各菌株的基因組進(jìn)快速提取各菌株的基因組 DNA。材料與方法材料與方法 1.2.2 種特異性種特異性PCR引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)：通過(guò)分析比較：通過(guò)分析比較GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中上述菌種及其相近種的數(shù)據(jù)庫(kù)中上述菌種及其相近種的16SrRNA、gyrB、recA、hsp60、16S-23S ITS、 lacZ 等基因序等基因序列的差異，列的差異， 確定植物乳桿菌和德氏乳桿菌引物設(shè)計(jì)確定植物乳桿菌和德氏乳桿菌引物設(shè)計(jì)的靶基因?yàn)榈陌谢驗(yàn)?recA (重組蛋白基因重組蛋白基因)， 鼠李糖乳桿菌和鼠李糖乳桿菌和嗜酸

9、乳桿菌為嗜酸乳桿菌為 gyrB (促旋酶基因促旋酶基因 )。利用。利用NCBI中中 Primer-BLAST (引物設(shè)計(jì)和特異性檢驗(yàn)工具引物設(shè)計(jì)和特異性檢驗(yàn)工具)設(shè)計(jì)引設(shè)計(jì)引物并同時(shí)在物并同時(shí)在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行引物特異性驗(yàn)證，數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行引物特異性驗(yàn)證，最終篩選出上述特異性引物各最終篩選出上述特異性引物各1對(duì)，分別為對(duì)，分別為 planF/planR(植物乳桿菌特異引物植物乳桿菌特異引物) 、aciF/aciR (嗜酸嗜酸乳桿菌特異引物乳桿菌特異引物)、 delF/delR (德氏乳桿菌特異引物德氏乳桿菌特異引物)和和 rhaF/rhaR (鼠李糖乳桿菌特異引物鼠李糖乳桿菌特異引物

10、)。表。表 2 為各引為各引物序列物序列。材料與方法材料與方法 1.2.3 特異特異 PCR 反應(yīng)體系及程序：反應(yīng)體系及程序：以參考菌株的以參考菌株的基因組基因組 DNA 為模板，利用設(shè)計(jì)好的特異性引物為模板，利用設(shè)計(jì)好的特異性引物進(jìn)行進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)總體系為反應(yīng)總體系為20 L，包括，包括10PCR Buffer (不含不含Mg2+ ) 2.0L，MgCl2 (25 mmol/L) 1.6L，dNTP mixture (各各2.5 mmol/L)1.6L，引物，引物 F (20mol/L)、引物、引物 R (20 mol/L)各各0.5L， Taq DNA聚合酶聚合酶(

11、5 U/L) 0.2L，模板模板 DNA50 ng，加無(wú)菌重蒸水補(bǔ)足至，加無(wú)菌重蒸水補(bǔ)足至 20L。PCR 擴(kuò)增程序：擴(kuò)增程序：94 C 3 min；94 C 60 s， 67 C 45 s，72 C 60 s，共，共 30 個(gè)循環(huán)；個(gè)循環(huán)；72 C 10 min，4 C 保存。產(chǎn)物經(jīng)保存。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。測(cè)。材料與方法材料與方法 1.2.4 PCR 特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：用：用 4 對(duì)引物分別對(duì)對(duì)引物分別對(duì)40 株參考株參考菌株進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)菌株進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。 1.2.5 特異特異 PCR 產(chǎn)物測(cè)序產(chǎn)物測(cè)

12、序：對(duì)菌株：對(duì)菌株 L. plantarum CGMCC1.2437T ， L. rhamnosus ACCC10534T ， L. acidophilus CGMCC1.1878T ， L. delbrueckii subsp. delbruekii CGMCC1.2624T 的的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。 1.2.6 生產(chǎn)菌株的檢測(cè)生產(chǎn)菌株的檢測(cè)：采用：采用 Biolog 方法和方法和 16SrDNA 序列序列分析方法對(duì)分析方法對(duì) 16 株從微生物肥料產(chǎn)品中分離的乳桿菌進(jìn)行株從微生物肥料產(chǎn)品中分離的

13、乳桿菌進(jìn)行鑒定，然后分別用鑒定，然后分別用 4 對(duì)引物采用特異對(duì)引物采用特異 PCR 方法對(duì)其進(jìn)行方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，檢驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)建立的特異鑒定，檢驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)建立的特異 PCR 方法與其他方法鑒定方法與其他方法鑒定結(jié)果是否一致。結(jié)果是否一致。材料與方法材料與方法 1.2.7 16S rDNA 序列分析方法：序列分析方法：以生產(chǎn)菌株基因以生產(chǎn)菌株基因組組 DNA 為模板，采用通用引物為模板，采用通用引物 27F 和和 1492R進(jìn)進(jìn)行行 16S rDNA 擴(kuò)增，擴(kuò)增， PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后測(cè)序，所產(chǎn)物經(jīng)純化后測(cè)序，所測(cè)測(cè) 16S rDNA 序列經(jīng)校對(duì)、拼接后與序列經(jīng)校對(duì)、拼接后與 GenBank 數(shù)數(shù)

14、據(jù)庫(kù)中相關(guān)種屬的序列進(jìn)行據(jù)庫(kù)中相關(guān)種屬的序列進(jìn)行 BLAST 比較。反應(yīng)比較。反應(yīng)體系體系 (50L) ：10PCR buffer 5.0L， MgCl2 (25 mmol/L) 4L，dNTP mixture (各各 2.5 mmol/L) 5L，引物，引物 27F 和和 1492R (10mol/L)各各 1L， TaqDNA聚合酶聚合酶(5U/L)0.5L，模板，模板DNA 100ng，加無(wú)菌重蒸水補(bǔ)足至加無(wú)菌重蒸水補(bǔ)足至 50L。擴(kuò)增程序：。擴(kuò)增程序： 95 C 5 min；93 C 60 s，50 C 60 s，72 C 70 s，共共 30個(gè)循環(huán)；個(gè)循環(huán)；72 C 10 min；

15、4 C 保存。保存。結(jié)果結(jié)果 2.1 乳桿菌乳桿菌 PCR 方法的特異性檢測(cè)方法的特異性檢測(cè)：使用：使用 4 對(duì)特對(duì)特異引物分別對(duì)異引物分別對(duì) 31 株乳桿菌屬參考菌株株乳桿菌屬參考菌株(表表 1)進(jìn)行進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示，所有目標(biāo)菌株中擴(kuò)增，結(jié)果顯示，所有目標(biāo)菌株中 1 株嗜酸株嗜酸乳桿菌乳桿菌 CGMCC1.2467 除外，均產(chǎn)生唯一目的條除外，均產(chǎn)生唯一目的條帶，非目標(biāo)菌株均沒(méi)有擴(kuò)增出目的條帶。圖帶，非目標(biāo)菌株均沒(méi)有擴(kuò)增出目的條帶。圖 1A、 B、C、D 顯示的是各個(gè)目標(biāo)種所有菌株及非目標(biāo)顯示的是各個(gè)目標(biāo)種所有菌株及非目標(biāo)種代表菌株的種代表菌株的 PCR 結(jié)果。將嗜酸乳桿菌結(jié)果。

16、將嗜酸乳桿菌 CGMCC1.2467 基因進(jìn)行基因進(jìn)行 16S rDNA 擴(kuò)增，擴(kuò)增， 測(cè)序測(cè)序后與后與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)和數(shù)據(jù)庫(kù)和 RDP 數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)種屬數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)種屬的序列進(jìn)行比較，結(jié)果均顯示與鼠李糖乳桿菌的的序列進(jìn)行比較，結(jié)果均顯示與鼠李糖乳桿菌的序列一致性最高，達(dá)到序列一致性最高，達(dá)到 100%；采用；采用 Biolog 對(duì)該對(duì)該菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果也是鼠李糖乳桿菌。利用鼠李菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果也是鼠李糖乳桿菌。利用鼠李糖乳桿菌特異引物對(duì)該菌進(jìn)行特異糖乳桿菌特異引物對(duì)該菌進(jìn)行特異 PCR，擴(kuò)增結(jié)，擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性果為陽(yáng)性(圖圖 1D)。結(jié)果結(jié)果 使用使用 4 對(duì)特異引物分別對(duì)對(duì)特異引物分

17、別對(duì) 9 株非乳桿株非乳桿菌屬參考菌株菌屬參考菌株(表表 1)進(jìn)行進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，且分?jǐn)U增，且分別以一株目標(biāo)菌株為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果除陽(yáng)別以一株目標(biāo)菌株為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果除陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)目標(biāo)條帶外，其余均沒(méi)有目的性對(duì)照出現(xiàn)目標(biāo)條帶外，其余均沒(méi)有目的擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物。 以上結(jié)果表明，建立的以上結(jié)果表明，建立的 4 種特異種特異 PCR 鑒定方法均具有較高的種內(nèi)通用性和種間鑒定方法均具有較高的種內(nèi)通用性和種間特異性。特異性。結(jié)果結(jié)果 2.2 PCR 產(chǎn)物序列分析：產(chǎn)物序列分析：對(duì)對(duì) 模模 式式 菌菌 株株 L.plantarum 1.2437T 、 L.rhamnosus 10534T、 L. ac

18、idophilus 1.1878T 和和 L.delbrueckii subsp. delbruekii 1.2624T 的特異的特異 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果通過(guò)果通過(guò) GenBank 中中 BLAST 比對(duì)，與數(shù)據(jù)庫(kù)中的比對(duì)，與數(shù)據(jù)庫(kù)中的同一區(qū)段核酸序列的一致性均達(dá)到同一區(qū)段核酸序列的一致性均達(dá)到99%或或100%，結(jié)果說(shuō)明各特異性引物具有很強(qiáng)的忠實(shí)性、特異結(jié)果說(shuō)明各特異性引物具有很強(qiáng)的忠實(shí)性、特異性和保守性。性和保守性。結(jié)果結(jié)果 2.3 生產(chǎn)菌株的檢測(cè)生產(chǎn)菌株的檢測(cè)：16 株生產(chǎn)菌株的株生產(chǎn)菌株的 4 次特異次特異 PCR 結(jié)結(jié)果、果、 16S rDNA 序列在序列在

19、GenBank 和和 RDP 兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中的兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中的綜合分析結(jié)果和綜合分析結(jié)果和 Biolog 鑒定結(jié)果見(jiàn)表鑒定結(jié)果見(jiàn)表 3。其中。其中 11 株菌產(chǎn)株菌產(chǎn)生了唯一擴(kuò)增條帶，生了唯一擴(kuò)增條帶， 根據(jù)片段大小分屬于嗜酸乳桿菌、根據(jù)片段大小分屬于嗜酸乳桿菌、 鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌，其鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌，其 16S rDNA序列分析結(jié)果序列分析結(jié)果和和 Biolog 鑒定結(jié)果均與其一致，另外鑒定結(jié)果均與其一致，另外 5 株菌無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，株菌無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，序列分析和序列分析和 Biolog 鑒定的結(jié)果顯示是布氏乳桿菌、類布鑒定的結(jié)果顯示是布氏乳桿菌、類布氏乳桿菌、干酪乳桿菌和類干酪乳桿菌

20、。以上結(jié)果表明特氏乳桿菌、干酪乳桿菌和類干酪乳桿菌。以上結(jié)果表明特異異 PCR 方法可用于微生物肥料中這方法可用于微生物肥料中這 4 種菌的快速檢測(cè)鑒種菌的快速檢測(cè)鑒定，定， 并且乳桿菌屬其它種的特異并且乳桿菌屬其它種的特異 PCR 方法還有待建立。方法還有待建立。另外，因另外，因 L-13 和和 L-16 的的 16S rDNA 序列分別與序列分別與 2 種菌的種菌的序列一致性達(dá)到序列一致性達(dá)到 99%以上，不能確定到某個(gè)種，故表中以上，不能確定到某個(gè)種，故表中給出給出 2 個(gè)菌名，這也證實(shí)了個(gè)菌名，這也證實(shí)了 16SrDNA 序列分析不適合乳序列分析不適合乳桿菌相近種的鑒定。桿菌相近種的鑒

21、定。討論討論 16S rDNA 序列同源性分析作為細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)序列同源性分析作為細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育和親緣關(guān)系的研究已被普遍接受和廣泛應(yīng)用，育和親緣關(guān)系的研究已被普遍接受和廣泛應(yīng)用，并且已作為細(xì)菌分類鑒定的有力佐證。但是乳桿并且已作為細(xì)菌分類鑒定的有力佐證。但是乳桿菌屬內(nèi)許多種的菌屬內(nèi)許多種的 16S rRNA 基因序列具有較高同基因序列具有較高同源性，利用該方法無(wú)法準(zhǔn)確鑒定到種源性，利用該方法無(wú)法準(zhǔn)確鑒定到種 ，本實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)2 株生產(chǎn)菌株的株生產(chǎn)菌株的 16S rDNA 序列分析結(jié)果也證實(shí)了序列分析結(jié)果也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。研究表明，這一觀點(diǎn)。研究表明，gyrB、recA、rpoD、hsp60等基因序列更適合細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析，用等基因序列更適合細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析，用作引物設(shè)計(jì)的靶基因，作引物設(shè)計(jì)的靶基因， 較較 16S rDNA 序列更好地序列更好地區(qū)分相似種區(qū)分相似種 。討論討論 本實(shí)驗(yàn)以本實(shí)驗(yàn)以 gyrB、 recA 為靶基因設(shè)計(jì)了為靶基因設(shè)計(jì)了 4種種乳桿菌的特異性引物，經(jīng)乳桿菌屬多個(gè)種、目標(biāo)乳桿菌的特異性引物，經(jīng)乳桿菌屬多個(gè)種、目標(biāo)種的相近種以及微生物肥料產(chǎn)品中非乳桿菌屬代