轉(zhuǎn)基因成分熒光定性PCR檢測

1、轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時熒光定性PCR檢測實(shí)驗(yàn)室設(shè)計目錄目錄PCR實(shí)驗(yàn)室各區(qū)域規(guī)劃實(shí)驗(yàn)室各區(qū)域規(guī)劃各區(qū)域功能性及要求各區(qū)域功能性及要求人員及環(huán)境注意事項人員及環(huán)境注意事項轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因食品、實(shí)時熒光食品、實(shí)時熒光PCR技術(shù)技術(shù)轉(zhuǎn)基因食品及熒光轉(zhuǎn)基因食品及熒光定性定性PCR技術(shù)技術(shù)轉(zhuǎn)基因食品：轉(zhuǎn)基因生物是指通過轉(zhuǎn)基因食品：轉(zhuǎn)基因生物是指通過轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因技術(shù)改變基因組構(gòu)技術(shù)改變基因組構(gòu)成的生物，轉(zhuǎn)基因食品即是以轉(zhuǎn)基因生物為原料制作加工而成的生物，轉(zhuǎn)基因食品即是以轉(zhuǎn)基因生物為原料制作加工而成的食品。成的食品。轉(zhuǎn)基因檢測 技 術(shù)實(shí)時熒光PCR靈敏度低、易被污染、耗時長、試劑毒性大靈敏度高、抗污染能力強(qiáng)、耗時短、試

2、劑毒性小傳統(tǒng)熒光PCRPCR實(shí)驗(yàn)室各區(qū)域規(guī)劃實(shí)驗(yàn)室各區(qū)域規(guī)劃實(shí)驗(yàn)室設(shè)計依據(jù)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計依據(jù)在由中華人民共和國衛(wèi)生部辦公廳于2002年1月14日下發(fā)的臨床基因擴(kuò)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法衛(wèi)醫(yī)發(fā)200210號文)附件臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)要求：要求：PCR擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室原則上分為四個單獨(dú)的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。為避免交叉污染，進(jìn)入各個工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向進(jìn)行，即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。實(shí)驗(yàn)室設(shè)計實(shí)驗(yàn)室設(shè)計標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)擴(kuò)增反應(yīng)混

3、合物配制和擴(kuò)增區(qū)試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)實(shí)驗(yàn)室平面圖工作流向?qū)Ｓ米呃犬a(chǎn)物分析區(qū)擴(kuò)增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)緩沖區(qū)物品傳遞窗各實(shí)驗(yàn)區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應(yīng)通過傳遞窗進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室采用三十萬級條件建設(shè)（條件允許）氣 壓負(fù) 壓氣 壓正 壓氣 壓負(fù) 壓氣 壓正 壓各區(qū)域功能性及要求各區(qū)域功能性及要求試劑準(zhǔn)備區(qū)該實(shí)驗(yàn)區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。試劑和用于樣品制作的材料應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。對與氣流壓力的控制，本區(qū)并沒有嚴(yán)格的要求。標(biāo)本制備區(qū)該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為樣本的保存、核酸(RNA、DNA)

4、提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測定DNA的合成。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域?yàn)檎龎海员苊鈴泥徑鼌^(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動。擴(kuò)增區(qū)該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為DNA擴(kuò)增。此外，已制備的DNA模板 (來自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動。個別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺內(nèi)進(jìn)行。產(chǎn)物分析區(qū)該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為擴(kuò)增片段的測定。 本區(qū)是最主要的

5、擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此對本區(qū)的壓力梯度的要求為：相對于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至其它區(qū)域。各區(qū)域功能性及要求各區(qū)域功能性及要求試劑準(zhǔn)備試劑準(zhǔn)備區(qū)配置設(shè)備區(qū)配置設(shè)備超凈工作臺或試劑配置箱試劑冰箱 可調(diào)移液器一套（四支）， 配有帶濾芯（防止氣溶膠）及無RNase酶的吸嘴 無粉的乳膠手套 渦旋器 無菌離心管 微量加樣器 天平 專用工作服標(biāo)本制備標(biāo)本制備區(qū)配置設(shè)備區(qū)配置設(shè)備 生物安全柜 樣本冰箱 可調(diào)移液器一套（四支）， 帶濾芯（防止氣溶膠）及無RNase酶的吸嘴 高速冷凍離心機(jī) 臺式高速離心機(jī) 渦旋器 恒溫設(shè)備 DNA提取試劑盒 無菌離心管 試管架 無粉的乳膠手套 專用工作服標(biāo)本標(biāo)本

6、制備制備區(qū)區(qū)設(shè)備設(shè)備配置配置(供供參考）參考）擴(kuò)增擴(kuò)增區(qū)配置設(shè)備區(qū)配置設(shè)備 熒光定量PCR儀 PCR擴(kuò)增儀 二級生物安全柜（可根據(jù)需要） 微量加樣器 專用工作服擴(kuò)增區(qū)設(shè)備配置擴(kuò)增區(qū)設(shè)備配置(供參考供參考)產(chǎn)物分析產(chǎn)物分析區(qū)配置設(shè)備區(qū)配置設(shè)備 孵箱 洗板機(jī) 酶標(biāo)儀 電腦及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 專用工作服產(chǎn)物產(chǎn)物分析分析區(qū)區(qū)設(shè)備設(shè)備配置配置(供參考供參考)人員、環(huán)境及其他注人員、環(huán)境及其他注意意事項事項規(guī)范的規(guī)范的操作操作（人員）（人員）（1 1）擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員必須是分子生物學(xué)專業(yè)或從事過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的技術(shù)人員；（2）在實(shí)驗(yàn)操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換，穿防護(hù)服。此外，操作中使用一次性帽子有效地防止污染；（3）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)，應(yīng)特別注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。ABC工作區(qū)域的嚴(yán)格劃分工作區(qū)域的嚴(yán)格劃分（1）各個實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)置合理；（2）各個實(shí)驗(yàn)區(qū)域要有明顯的標(biāo)記（如醒目的門牌或不同的地面顏色等）以避免各個不同實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)備物品、試劑等發(fā)生混淆。合理的系統(tǒng)設(shè)置合理的系統(tǒng)設(shè)置（1）合理的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)置，盡量采用全送全排的空調(diào)系統(tǒng)；（2）嚴(yán)格的氣流壓力控制，保證不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不同的壓力要求。注意事項注意事項D