專題5課題3血紅蛋白提取分離1

1、2003年年4月月14日宣布人類基因組序列圖完成日宣布人類基因組序列圖完成這標(biāo)志著進入了后基因組時代。這標(biāo)志著進入了后基因組時代。人類基因組：指人類基因組：指DNA分子所攜帶的全部分子所攜帶的全部遺傳信息。遺傳信息。蛋白質(zhì)組：生物個體表達的蛋白質(zhì)分子的蛋白質(zhì)組：生物個體表達的蛋白質(zhì)分子的總和。主要是對蛋白質(zhì)功能的研究總和。主要是對蛋白質(zhì)功能的研究根據(jù)蛋白質(zhì)根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性各種特性的差異，如的差異，如分分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對其他分子的少、溶解度、吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力親和力等等，可以用來分離不同種類的等等，可以用來分

2、離不同種類的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)。 一、基礎(chǔ)知識一、基礎(chǔ)知識 大多數(shù)凝膠是由大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物多糖類化合物（如（如葡聚糖葡聚糖或或瓊脂糖瓊脂糖）構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫）構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道。穿的通道。 根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量相對分子質(zhì)量的大小，利用具有的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，來進行的凝膠，來進行分離。分離。相對分子量較小的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部相對分子量較小的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動速度較慢的通道，路程較長，移動速度較慢; ;相對分子量較大的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部相對分子量較大的蛋白質(zhì)無法進入凝膠

3、內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。動速度較快。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。進行體外實驗時，如何保證蛋白質(zhì)不進行體外實驗時，如何保證蛋白質(zhì)不會發(fā)生變性呢？會發(fā)生變性呢？ 能夠抵制能夠抵制外界的酸和堿外界的酸和堿對溶液對溶液PHPH值值的影響，的影響，維持維持PHPH基本不變。基本不變。 通常由通常由1 12 2 種緩沖劑種緩沖劑溶解于水溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不不同同PHPH范圍內(nèi)范圍內(nèi)使用的緩沖液。使用的緩

4、沖液。磷酸緩沖液磷酸緩沖液, ,成分：磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉成分：磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉 如何證明凝膠色譜法獲得的蛋白質(zhì)是目的蛋白？如何證明凝膠色譜法獲得的蛋白質(zhì)是目的蛋白？帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。 許多重要的生物大分子，如多肽、許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的核酸等都具有可解離的基團，在一定的PHPH下，下，這些基團會帶上正電或負電。這些基團會帶上正電或負電。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。所帶電荷相反的電極移動。電泳利用了待分離樣品中各種分子帶

5、電性質(zhì)電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離中各種分子的分離。瓊脂糖瓊脂糖凝膠電泳、凝膠電泳、聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠電泳。凝膠電泳。 在測定蛋白質(zhì)分子量時常用在測定蛋白質(zhì)分子量時常用十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉（SDSSDS）聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,NN,N- -亞甲基雙丙烯亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成

6、的具酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（形成交聯(lián)）亞甲基雙丙烯酰胺（形成交聯(lián)）丙烯酰胺和交聯(lián)劑丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚反應(yīng)亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚反應(yīng) 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。 。由幾條肽鏈組成。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDSSDS的作用下會的作用下會，因此測定的結(jié)果只是因此測定的結(jié)果只是。SDSSDS能與各能與各種蛋白質(zhì)形成種蛋白質(zhì)形成，SDSSDS所帶負電荷所帶負電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子的量大大超過了蛋白質(zhì)分子。因而掩。因而掩蓋了蓋了，使電泳遷移率完，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。全取決于分子的大小。用用SDS SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量的方法分子量的方法樣品處理樣品處理粗分離粗分離純化純化純度鑒定純度鑒定蛋白質(zhì)提取和分離步驟蛋白質(zhì)提取和分離步驟（一）血紅蛋白（一）血紅蛋