表達(dá)譜及小RNA

1、數(shù)字基因表達(dá)譜升級版RNA-Seq(Quantification)或稱為 Tag-seq實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)流程Total RNAEnrich mRNA by Oligo （dT）Remove rRNARandom hexamer primed cDNA synthesisSize selection and PCR amplificationIllumina sequencingRNA fragment( 200 nt)EukaryotesProkaryotes分析內(nèi)容差異表達(dá)基因篩選差異表達(dá)基因篩選PathwayPathway顯著性富集分析顯著性富集分析Clean TagClean Tag數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)

2、GOGO功能顯著性富集分析功能顯著性富集分析測序飽和度分析測序飽和度分析表達(dá)模式聚類分析表達(dá)模式聚類分析基因注釋、標(biāo)準(zhǔn)化基因注釋、標(biāo)準(zhǔn)化反義鏈的轉(zhuǎn)錄分析反義鏈的轉(zhuǎn)錄分析原始序列數(shù)據(jù)原始序列數(shù)據(jù)共有、特有共有、特有TagTag分析分析表達(dá)量及分布分析表達(dá)量及分布分析實(shí)驗(yàn)重復(fù)性分析實(shí)驗(yàn)重復(fù)性分析新轉(zhuǎn)錄本檢測新轉(zhuǎn)錄本檢測蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析Tag-Seq與基因芯片優(yōu)缺點(diǎn)比較與基因芯片優(yōu)缺點(diǎn)比較技術(shù)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)RNA-seq1）檢測基因數(shù)比基因芯片多檢測基因數(shù)比基因芯片多2）定量準(zhǔn)，可重復(fù)性高（重復(fù)相關(guān)系定量準(zhǔn)，可重復(fù)性高（重復(fù)相關(guān)系數(shù)數(shù)0.99）3）數(shù)字化信號，背景噪音數(shù)字化信號，背景噪音低

3、低，無交叉，無交叉雜交雜交4）高、低豐度基因高、低豐度基因均均可檢測可檢測5）不受研究物種限制，模式生物和非不受研究物種限制，模式生物和非模式生物均可檢測模式生物均可檢測6）數(shù)據(jù)可與時(shí)俱進(jìn)，即隨數(shù)據(jù)庫更新數(shù)據(jù)可與時(shí)俱進(jìn)，即隨數(shù)據(jù)庫更新而更新而更新7）具有較好的分析兼容性，數(shù)據(jù)格式具有較好的分析兼容性，數(shù)據(jù)格式與芯片相同，可與芯片的分析軟件兼與芯片相同，可與芯片的分析軟件兼容容1）樣本要求量比基因芯片多）樣本要求量比基因芯片多2）數(shù)據(jù)量大，需要具備一定的生物信息分）數(shù)據(jù)量大，需要具備一定的生物信息分析基礎(chǔ)，才能更好的挖掘數(shù)據(jù)蘊(yùn)含的豐富析基礎(chǔ)，才能更好的挖掘數(shù)據(jù)蘊(yùn)含的豐富信息信息基因基因芯片芯片1

4、）平臺應(yīng)用較早）平臺應(yīng)用較早2）信息分析軟件較多）信息分析軟件較多3）有些平臺要求樣品量少）有些平臺要求樣品量少1）檢測靈敏度較低、重復(fù)性差、檢測閾值）檢測靈敏度較低、重復(fù)性差、檢測閾值較狹窄較狹窄2）有背景噪音，假陽性率）有背景噪音，假陽性率1%3）受物種限制，只能檢測部分模式生物）受物種限制，只能檢測部分模式生物4）受基因拷貝數(shù)限制，無法檢測出低豐度）受基因拷貝數(shù)限制，無法檢測出低豐度基因基因5）只能檢測已知轉(zhuǎn)錄本，無法檢測出新轉(zhuǎn)）只能檢測已知轉(zhuǎn)錄本，無法檢測出新轉(zhuǎn)錄本錄本6）受數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)所限，因探針依靠現(xiàn)有數(shù)）受數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)所限，因探針依靠現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫或比較舊的版本的數(shù)據(jù)庫來設(shè)計(jì)的，據(jù)庫或比

5、較舊的版本的數(shù)據(jù)庫來設(shè)計(jì)的，可能出現(xiàn)注釋不準(zhǔn)確的情況可能出現(xiàn)注釋不準(zhǔn)確的情況BGI 實(shí)驗(yàn)p實(shí)驗(yàn)材料 (MAQC標(biāo)準(zhǔn)品) Universal Human Reference RNA (UHRR) from Stratagene. Human Brain Reference RNA (HBRR) from Ambion.p比對數(shù)據(jù) RNA-Seq for UHRR and HBRR by BGI. Microarray for UHRR and HBRR by a major company Affimetrix (GEO: GSM122774GSM122783). qPCR quantifica

6、tion for UHRR and HBRR (GEO 數(shù)據(jù)庫中有這兩個(gè)樣品約1000 個(gè)基因的qPCR 定量結(jié)果）* The purpose of the MAQC project is to provide quality control tools to the microarray community in order to avoid procedural failures and to develop guidelines for microarray data analysis by providing the public with large reference datase

7、ts along with readily accessible reference RNA samples. See at FDA /ScienceResearch/BioinformaticsTools/MicroarrayQualityControlProject/default.htm Tag-Seq和 qPCR的相關(guān)性n=903 genesn=903 genesPearson r=0.9117Pearson r=0.9117Spearman rank r=0.8603Spearman rank r=0.8603Pearson r=0.8575Pear

8、son r=0.8575Spearman rank r=0.8321Spearman rank r=0.8321n=851 genesn=851 genes0 200 400 600 800 1000 1200 Tag-Seq_gene expression (RPKM)3020100403020100qPCR_gene expression 0 200 400 600 800 1000 1200 1400Tag-Seq_gene expression (RPKM)n=872 genesn=872 genes兩種樣品兩種樣品的的Tag-Seq 和和qPCR 都具有較好的相關(guān)性都具有較好的相關(guān)性

9、qPCR_gene expression qPCR: Log2(HBRR/UHRR)50-5-10-10-10 -5 0 5Tag-Seq: Log2(HBRR/UHRR)Affymetrix: Log2(HBRR/UHRR)n=474 genesn=767 genes50-5-10-6 -4 -2 0 2 4 6 Pearson r=0.9176Spearman rank r=0.8966Pearson r=0.891Spearman rank r=0.868Tag-Seq比比Affymetrix芯片具有更高的相關(guān)性芯片具有更高的相關(guān)性Tag-Seq、Affymetrix 芯片分別與qPCR

10、的相關(guān)性比較（HBRR/UHRR）Tag-Seq & qPCRAffy & qPCR東北農(nóng)大Tag-seq文章l研究對象：黃瓜的雄雌同株材料，和它的突變體材料（全雌研究對象：黃瓜的雄雌同株材料，和它的突變體材料（全雌株）。株）。l平行培養(yǎng)兩類材料，在平行培養(yǎng)兩類材料，在 2 2葉葉1 1心期，取莖尖組織提前心期，取莖尖組織提前RNARNA，進(jìn)，進(jìn)行行Tag-seqTag-seq分析分析, ,每個(gè)材料取了每個(gè)材料取了1515株進(jìn)行混合抽提株進(jìn)行混合抽提RNA.RNA.l文章的內(nèi)容是文章的內(nèi)容是DEGDEG的結(jié)果與分析。的結(jié)果與分析。l用用RT-PCRRT-PCR和和qRT-PCRqRT-PCR對

11、對Tag-seqTag-seq得到的差異表達(dá)基因做了驗(yàn)證得到的差異表達(dá)基因做了驗(yàn)證分析。分析。 本文的亮點(diǎn)是，針對一些通過Tag-seq找出來的差異基因，且是以前有過報(bào)道參與花發(fā)育進(jìn)程的基因，利用RT-PCR方法分別對它們在子房和花上部做了不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式分析。 該部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果成為了他們討論部分的主要內(nèi)容。 這一個(gè)思路值得借鑒，有了Tag-seq數(shù)據(jù)后，找自己關(guān)注的而且有些研究背景的基因進(jìn)行RT-PCR分析，以便于撰寫文章的討論部分。10豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是一種全世界范圍內(nèi)影響家豬生產(chǎn)的重要疾病，每年都會(huì)造成很多的經(jīng)濟(jì)損失。PRRS病毒感染分子機(jī)制目前了解甚少。本研究第一次應(yīng)

12、用了illumina的數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)在全基因組水平研究了宿主在感染N-PRRSV（經(jīng)典北美型PRRSV）CH1a株病毒后的轉(zhuǎn)錄水平作出的響應(yīng)。中山大學(xué)Tag-seqTag-seq文章文章11研究思路如下：共取9頭6周大的健康小豬：3頭豬為對照；在感染實(shí)驗(yàn)前一天，犧牲掉取肺；6頭豬感染病毒，分別在感染后第3天和第7天，各犧牲3頭豬取肺。每3頭豬混合提取RNA，進(jìn)行Tag-seq 實(shí)驗(yàn)，對比數(shù)據(jù)庫為 sus scrofa UniGene （/UniGene/UGOrg.cgi?TAXID=9823, UniGene Build #35 Sus

13、 scrofa, Nov, 7th, 2008)共做3個(gè)Tag-seqTag-seq 。qPCR對Tag-seqTag-seq結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證：選取了6個(gè)上調(diào)基因和2個(gè)下調(diào)表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證Tag-seqTag-seq結(jié)果，兩種技術(shù)的相關(guān)系數(shù) r 值為：0.781-0.997。12 利用高通量測序?yàn)榛A(chǔ)的數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)系統(tǒng)地分析了N-PRRSV感染后的肺和感染引發(fā)病理發(fā)生的肺中基因表達(dá)譜之間的關(guān)系。 研究發(fā)現(xiàn)N-PRRSV在被感染的家豬中呈現(xiàn)出多種復(fù)制策略，包括破壞宿主的先天免疫反應(yīng)、抗凋亡和抗發(fā)炎狀態(tài)、并發(fā)展為ADE。受病毒誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)的早期炎性相關(guān)細(xì)胞因子、趨化因子、粘附分子、發(fā)炎相關(guān)酶蛋

14、白、發(fā)炎細(xì)胞、抗體以及補(bǔ)體激活等等很可能導(dǎo)致了N-PRRSV感染過程中發(fā)炎響應(yīng)的發(fā)展發(fā)生。而N-PRRSV誘導(dǎo)的免疫抑制則可能媒介了感染細(xì)胞的凋亡，這是導(dǎo)致了免疫細(xì)胞的損耗，也誘導(dǎo)了抗炎細(xì)胞因子反應(yīng)從而不能有效消除初期病毒感染。 本研究可有益于很好地去理解N-PRRSV感染的分子機(jī)制，發(fā)展新的抗病毒療法和鑒定出家豬對PRRS病毒resistance/ susceptibility 的遺傳基礎(chǔ)。13南京農(nóng)大Tag-seq文章高地棉栽培種 Xuzhou 142 和它的突變體 fl M （fuzzless/lintless），在江蘇農(nóng)科院種植。在開花期當(dāng)天對花做標(biāo)記，收獲-2 到8 DPA（開花期后

15、天數(shù)）的棉花胚珠，剝離的棉花胚珠液氮速凍后-80C保存。從-2、-1、0、1、2、3、5 和8 DPA的野生型和突變體的棉花胚珠中提取總RNA。-2、-1、0和1 DPA的總RNA混合作為stageI（纖維啟始）的樣品，野生型和突變體的分別標(biāo)記為 WT1 和 M1；2、3、5和8 DPA的總RNA混合作為stageII（纖維伸長）的樣品，野生型和突變體分別標(biāo)記為 WT2 和 M2。14 對每個(gè)文庫（WT1、WT2、M1和M2）測得3.5-3.8M的tags可以代表0.7-1.0M的一致轉(zhuǎn)錄本（unique transcripts）。 去除低質(zhì)量的tags后，我們分別從WT1、WT2、M1和M2

16、的文庫測得2973104、3139306、2943654和3392103條clean序列，分別相對應(yīng)了這4個(gè)文庫的357852、280787、372954和382503種不同的標(biāo)簽（distinct tags）。 所有的clean tags對比棉花公共的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫 TIGR,。約15%的distinct tags具有唯一的參考基因?qū)Ρ冉Y(jié)果，而公共數(shù)據(jù)庫中有34.4%的基因被tags對比上。 Tag對比參考數(shù)據(jù)庫的結(jié)果為WT1、WT2、M1和M2這4個(gè)文庫分別找出了23854、24442、23497和19957個(gè)注釋基因。 對差異表達(dá)基因的分析顯示野生型和突

17、變體棉花文庫之間基因的類型和表達(dá)豐度有了根本的或說有了質(zhì)的變化。 在WT1/M1和WT2/M2之間表達(dá)差異水平最大的20個(gè)基因是纖維素合成酶基因、磷酸（脂）酶基因和脫氫酶基因，這些基因都參與了纖維細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)程。15總的來說，本研究的深度測序分析證實(shí)了纖維早期發(fā)育中基因轉(zhuǎn)錄的高度復(fù)雜性，同時(shí)結(jié)果也表明與利用基因芯片技術(shù)分析轉(zhuǎn)錄組相比，深度測序技術(shù)可以在一個(gè)更大更廣的范圍去探測基因表達(dá)譜。Fig. Quantitative RTPCR validation of tag-mapped genes from cotton ovules and developing fibers. (A)(E),

18、genes have been identified or reported before, including FDH (TA21337) (A), SCP (TA22298) (B), CesA-5 (TA21774) (C), ACT (TA20417) (D), and WBC1 (TA24519) (E). The other tag-mapped genes included DT046968 (F, predicted flavonoid 3,5-hydroxylase), TA20379 (G, predicted peroxidase), and TA21004 (H, st

19、erol-Cmethyltransferase).TPM, transcripts per million mapped reads.qRT-PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：選取了9個(gè)基因，其中8個(gè)基因的qPCR結(jié)果與Tag-seq結(jié)果相一致。16Small RNA 測序Small RNA 的作用 21-24 nt miRNAs and siRNAsLin He and Gregory J.Hannon. MicroRNAs: Small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics 5, 522531 (2004)S

20、mall RNA 測序?qū)嶒?yàn)流程測序?qū)嶒?yàn)流程生物信息分析生物信息分析分析內(nèi)容 sRNA 與參考序列比對； sRNA 與rRNA etc 的比對 包括rRNA,tRNA,snRNA,snoRNA 等non-coding RNA； sRNA 與repeat 的比較 ； sRNA 與mRNA/exon/intron 的比較； 與miRNA數(shù)據(jù)庫比對，鑒定miRNA； 預(yù)測新的miRNA； miRNA差異表達(dá)分析 ； 靶基因預(yù)測。Genome Biology 2009案例案例1 1散居型飛蝗散居型飛蝗群居型飛蝗群居型飛蝗飛蝗small RNA測序Small RNA長度分布長度分布Small RNA類型類

21、型預(yù)測185個(gè)特有的miRNAs保守的保守的 miRNA特有的特有的miRNA兩類飛蝗的miRNA表達(dá)差異miRNA靶基因預(yù)測南京農(nóng)大 miRNA 文章采用采用solexa深度測序方法研究了棉花纖維發(fā)生和發(fā)育過程中深度測序方法研究了棉花纖維發(fā)生和發(fā)育過程中small RNAs 的全局表達(dá)情況。的全局表達(dá)情況。 分別構(gòu)建野生和fl突變體的棉花胚珠的小RNA文庫，每個(gè)文庫單獨(dú)測序分析。22多個(gè)保守的候選miRNA家族（含有111個(gè)成員）被鑒定出來，此外，還在棉花胚珠中鑒定了2個(gè)新的細(xì)胞特異性的候選miRNAs。該研究證實(shí)了野生與突變體中miRNAs的表達(dá)豐度存在顯示差異，暗示這些差異表達(dá)的miRN

22、As在棉花纖維發(fā)育過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的作用。第一次將深度測序的方法用于分析棉花纖維發(fā)生和發(fā)育的胚珠中miRNAs群體。For the first time we discovered, through high throughput Solexa sequencing, 14 novel miRNA families and 75 conserved miRNAs, belonging to 22 families, in peanut.山東農(nóng)科院花生micRNA文章 Cell Research 2010通過通過SolexaSolexa測序，確定牛乳中含有大量測序，確定牛乳中含有大量miRNA

23、miRNA取樣取樣40只產(chǎn)后9個(gè)月的乳牛共收集100 ml 成乳（2.5ml/只）40只產(chǎn)后7天的乳牛共收集100 ml 初乳（2.5ml/只）40只乳牛共收集約200ml血清（5ml/只）Trizol LS Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)別提t(yī)otal RNA 測序測序數(shù)據(jù)量：數(shù)據(jù)量： 每個(gè)樣本不低于2.4M clean reads，reads長18-30 nt 南京大學(xué)miRNA文章Q PCR 相關(guān)系數(shù)相關(guān)系數(shù)(R-square) = 0.99 高度準(zhǔn)確高度準(zhǔn)確7種乳特異性種乳特異性miRNA作為牛乳作為牛乳的質(zhì)控標(biāo)記的質(zhì)控標(biāo)記7 7種乳特異

24、性種乳特異性miRNA的表達(dá)作為辨別天然乳和不合格的表達(dá)作為辨別天然乳和不合格或造假乳的理想生物標(biāo)記！或造假乳的理想生物標(biāo)記！32BMC Genomics. 2010 Jul 13;11:431.Deep sequencing discovery of novel and conserved microRNAs in trifoliate orange (Citrus trifoliata). Song C, Wang C, Zhang C, Korir NK, Yu H, Ma Z, Fang J.Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095

25、, China.BMC Plant Biol. 2010 Jun 24;10:123.Diverse set of microRNAs are responsive to powdery mildew infection and heat stress in wheat (Triticum aestivum L.). Xin M, Wang Y, Yao Y, Xie C, Peng H, Ni Z, Sun Q.China Agricultural University, Beijing, 100094, China.Cell Res. 2010 Jun 15. Epub ahead of

26、printIdentification and characterisation of microRNAs in raw milk during different periods of lactation, commercial fluid, and powdered milk products.Chen X, Gao C, Li H, Huang L, Sun Q, Dong Y, Tian C, Gao S, Dong H, GuaZhao S, Li L, Zhu L, Yan Q, Zhang J, Zen K, Zhang CY.Nanjing University, Nanjing, Jiangsu 210093, China.n D, Hu X, PLoS One. 2010 May 19;5(5):e10698.