DB53∕T 1064.2-2021 綠孔雀檢疫技術(shù) 第2部分：禽流感病毒實驗室檢測技術(shù)規(guī)范

1、ICS 11.22053CCS B 41云南省地方標(biāo)準(zhǔn)DB53/T 1064.22021綠孔雀檢疫技術(shù) 第 2 部分：禽流感病毒實驗室檢測技術(shù)規(guī)范Quarantine technique for Pavo muticusPart 2: Technical specifications for laboratory examination ofAvian Influenza Virus2021 - 09 - 30 發(fā)布2021 - 10 - 14 實施云南省市場監(jiān)督管理局發(fā) 布學(xué)兔兔 標(biāo)準(zhǔn)下載DB53/T 1064.22021目次前言III引言1 范圍12 規(guī)范性引用文件13 術(shù)語和定義14 縮

2、略語25 總則26 禽流感病毒毒株的毒力劃分和血清亞型27 儀器設(shè)備和試劑37.1 實驗室器材37.2 試劑38 樣品38.1 采樣要求與原則38.2 采樣類型和采樣方法38.3 樣品儲運(yùn)49 試驗步驟49.1 樣品制備49.2 雞胚接種49.3 MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)49.4 病毒血凝（HA）試驗和血凝抑制（HI）試驗59.5 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增檢測59.6 H 蛋白序列分析710 試驗數(shù)據(jù)處理710.1 HA 試驗結(jié)果判定710.2 HI 試驗結(jié)果判定710.3 核酸檢測結(jié)果判定8附錄 A（規(guī)范性）緩沖溶液和 1%雞紅細(xì)胞懸液9附錄 B（資料性）采樣記錄表10IDB53

3、/T 1064.22021前言本文件按照GB/T 1.1-2020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。本文件是DB53/T 1064綠孔雀檢疫技術(shù)的第2部分。DB53/T 1064已經(jīng)發(fā)布了以下部分：第 1 部分：禽副黏病毒實驗室檢測技術(shù)規(guī)范；第 2 部分：禽流感病毒實驗室檢測技術(shù)規(guī)范；第 3 部分：羽虱實驗室檢測技術(shù)規(guī)范；第 4 部分：消化道線蟲實驗室檢測技術(shù)規(guī)范。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。 本文件由云南省林業(yè)與草原局、云南省市場監(jiān)督管理局共同提出。本文件由云南省林業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會（YNTC02）歸口。 本文件主要

4、起草單位：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)、云南省標(biāo)準(zhǔn)化研究院。本文件主要起草人：陳培富、黃艷梅、卓娜、李建春、胡世享、楊俊、錢麗敏、何依蓉、鄒豐才、楊建發(fā)。IIIDB53/T 1064.22021引言綠孔雀（Pavo muticus）在我國僅分布于云南，是國家級重點保護(hù)野生動物，也是全球瀕危物種， 并已列入瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約(CITES)和世界自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄。為切實貫徹中華人民共和國野生動物保護(hù)法和中華人民共和國動物防疫法，編制并發(fā)布DB53/T 1064綠孔雀檢疫技術(shù)地方標(biāo)準(zhǔn)，可讓從事綠孔雀保護(hù)的相關(guān)人員按標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化程序開展綠孔雀病原學(xué)診斷，從而采取必要的防治措施，以提高染疫綠孔雀

5、的成活率，維護(hù)綠孔雀種群健康和地區(qū)生態(tài)平衡， 提升生物多樣性保護(hù)成效。本文件已發(fā)布4個部分：第 1 部分：禽副黏病毒實驗室檢測技術(shù)規(guī)范。本部分從禽副黏病毒實驗室檢測技術(shù)的總則、儀器設(shè)備和試劑、樣品、試驗步驟、試驗數(shù)據(jù)處理等方面制定了規(guī)范；第 2 部分：禽流感病毒實驗室檢測技術(shù)規(guī)范。本部分從禽流感病毒實驗室檢測技術(shù)的總則、禽流感病毒毒株的毒力劃分和血清亞型、儀器設(shè)備和試劑、樣品、試驗步驟、試驗數(shù)據(jù)處理等方 面制定了規(guī)范；第 3 部分：羽虱實驗室檢測技術(shù)規(guī)范。本部分從羽虱實驗室檢測的原理、試驗條件、儀器設(shè)備和試劑、樣品、試驗步驟、試驗數(shù)據(jù)處理等方面制定了規(guī)范；第 4 部分：消化道線蟲實驗室檢測技術(shù)

6、規(guī)范。本部分從消化道線蟲實驗室檢測技術(shù)的試驗原理、常見線蟲形態(tài)特征、試驗條件、儀器設(shè)備和試劑、樣品、試驗步驟、試驗數(shù)據(jù)處理等方面制定了規(guī)范。DB53/T 1064.22021綠孔雀檢疫技術(shù)第 2 部分：禽流感病毒實驗室檢測技術(shù)規(guī)范重要提示：由于禽流感病毒可感染人類，采樣和檢測人員應(yīng)穿戴防護(hù)服及口罩，并采取必要的消毒 措施。涉及禽流感病毒的實驗操作，應(yīng)在相應(yīng)的生物安全級別實驗室（符合GB 19489的要求）進(jìn)行。本檢測技術(shù)規(guī)范中凡接觸病毒樣品的檢驗器材、廢棄物及其包裝物均應(yīng)做消毒或滅菌等無害化處理，以免 污染環(huán)境或擴(kuò)散病毒。1 范圍本文件規(guī)定了綠孔雀（Pavo muticus）檢疫技術(shù)中禽流感病

7、毒實驗室檢測技術(shù)的總則、禽流感病毒毒株的毒力劃分和血清亞型、儀器設(shè)備和試劑、樣品、試驗步驟和試驗數(shù)據(jù)處理。本文件適用于綠孔雀檢疫技術(shù)中禽流感病毒實驗室檢測。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，標(biāo)注日期的引用文 件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不標(biāo)注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適 用于本文件。GB 19489 實驗室 生物安全通用要求NY/T 541 獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1禽流感 avian influenza禽流感是由正粘病毒科（Orthomyxovirida

8、e）甲型流感病毒屬（Influenzavirus A）成員引起禽類的一種急性、全身出血性傳染病。3.2病毒血凝 viral hemagglutination具有血凝活性的病毒（如流感病毒）粒子，憑借其表面的血凝素識別、結(jié)合特定動物紅細(xì)胞表面受 體并使紅細(xì)胞凝集（即紅細(xì)胞不再自然下沉匯集）。3.3病毒血凝抑制 viral hemagglutination inhibition抗體特異性結(jié)合于具有血凝活性的病毒粒子的血凝素（H）抗原位點，干擾病毒H蛋白與紅細(xì)胞受體之間的結(jié)合，從而阻斷或抑制病毒粒子凝集紅細(xì)胞的能力。3.4反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) reverse transcription - pol

9、ymerase chain reaction1DB53/T 1064.22021以RNA（mRNA）為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶催化生成 cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增，常用于獲得目的基因或檢測mRNA表達(dá)。3.5弗林蛋白 furin亦稱作成對堿性氨基酸裂解酶，是動物細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)切蛋白酶，能識別、裂解流感病毒血凝素（H） 蛋白中存在的R-X-X-R位點，產(chǎn)生H1和H2兩個亞基，以形成具有感染活性的流感病毒粒子。4 縮略語下列縮略語適用于本文件。AIV：禽流感病毒 Avian influenza virusAMV：禽成髓細(xì)胞瘤病毒 Avian myeloblastosis v

10、irusDEPC：焦碳酸二乙酯 DiethypyrocarbonatedNTP：脫氧核苷酸 Deoxyribonucleotide triphosphate H：血凝素 HemagglutininHA：血凝 HemagglutinationHAU：血凝單位 Hemagglutination unitHEPES：4-羥乙基哌嗪乙磺酸 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid HI：血凝抑制 Hemagglutination inhibitionHPAI：高致病性禽流感 Highly pathogenic avian influenza

11、M：基質(zhì)蛋白 Matrix proteinMDCK：犬腎傳代細(xì)胞 Madin-Darby kidney cells N：神經(jīng)氨酸酶 NeuraminidasePBS：磷酸緩沖鹽溶液 Phosphate-buffered saline PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) Polymerase chain reaction RBCs：紅細(xì)胞 Red blood cellsRNA：核糖核酸 Ribonucleic acidRT-PCR：反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) Reverse transcription - polymerase chain reaction SPF：無特定病原體 Specific pathoge

12、n free5 總則5.1 雞胚接種和MDCK細(xì)胞培養(yǎng)均是分離禽流感病毒的有效方法，檢測流感病毒時，根據(jù)具體情況選用其一，或同時采用。5.2 取5.1收獲的尿囊液或MDCK細(xì)胞培養(yǎng)物上清做HA試驗和HI試驗，確定分離毒株的種屬及血清型（亞型）。5.3 對5.1或5.2分離毒株采用RT-PCR擴(kuò)增分析其M基因，做出禽流感病毒定性鑒定。5.4 對5.2確定的禽流感病毒H5、H7或H9血清亞型的分離毒株，用血清亞型特異性引物做RT-PCR擴(kuò)增 檢測其H基因，并依據(jù)H基因測序結(jié)果判定分離毒株的致病性程度。6 禽流感病毒毒株的毒力劃分和血清亞型2DB53/T 1064.22021根據(jù)禽流感病毒致病性或毒

13、力的不同，可以將禽流感分為高致病性禽流感、低致病性禽流感和無致病性禽流感。已知流感病毒可分為18個H亞型和11個N亞型。其中，由H5和H7亞型毒株（以H5N1和H7N7 為代表）引起的禽流感通常為HPAI，其傳染性強(qiáng)，死亡率高、危害大。7 儀器設(shè)備和試劑7.1 實驗室器材PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、臺式低溫高速離心機(jī)、電泳儀、電泳槽、冰箱、微量移液器、水浴鍋、照 膠儀、手術(shù)器械、棉拭子、離心管、抗凝管、一次性濾器（濾膜孔徑0.45 m）、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、V形孔血凝反應(yīng)板、微型振蕩器等。7.2 試劑RNA提取試劑或試劑盒、氯仿、異丙醇、75%乙醇、1.0%瓊脂糖凝膠、阿氏液（Alsevers solut

14、ion）（見附錄A.1）、1% 雞紅細(xì)胞懸液（見附錄 A.2）、0.01 mol/L PBS（pH 7.2）、核酸染料、標(biāo)準(zhǔn)禽流感病毒抗原與參考毒株、陽性對照血清、陰性對照血清、MDCK 細(xì)胞、DMEM 培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、HEPES、胰蛋白酶、引物、10×擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液、dNTPs（每種核苷酸2.5 mmol/L）、瓊脂糖、核酸上樣緩沖液、膠回收試劑盒等。8 樣品8.1 采樣要求與原則8.1.1 采樣要求采樣應(yīng)符合 NY/T 541 的要求。8.1.2 采樣原則采集的樣品應(yīng)具有典型性，從瀕死、死亡或處于急性發(fā)病期的綠孔雀采集樣品，對暴發(fā)疫病的群體 宜采集多只發(fā)病或死亡綠孔雀的樣

15、品。采樣過程應(yīng)無菌操作，裝樣品的容器應(yīng)確保密封完好，注意避免 被污染以及污染環(huán)境，并及時填寫采樣記錄表（見附錄 B），確保樣品編號與標(biāo)簽一致。8.2 采樣類型和采樣方法8.2.1 口咽拭子和泄殖腔拭子采樣方法如下：a) 取咽喉拭子時，將拭子深入孔雀喉頭口及上顎裂來回刮 3 次5 次取咽喉分泌液；b) 取泄殖腔拭子時，將拭子深入孔雀泄殖腔轉(zhuǎn)一圈并沾取少量內(nèi)容物；c) 同一個體的咽喉拭子和泄殖腔拭子合并放入預(yù)先盛有 1.0 mL PBS（含 100 IU/mL 青霉素和 100 g/mL 鏈霉素）的離心管中，蓋緊管蓋，并對樣品編號。8.2.2 組織樣品若綠孔雀死亡在 24 h 以內(nèi)，則適合采集組織

16、樣品。每只綠孔雀采集肺（或氣管）、腦、心、肝、脾、胃、腎等組織各 1 份，數(shù)量均宜不少于 3 g。待檢樣品裝入一次性密封袋或其它滅菌容器，確保密封完好，編號，送實驗室。3DB53/T 1064.220218.2.1血清每只孔雀采集靜脈血 2 mL3 mL，盛于無菌器皿中或 10 mL 離心管中，37 靜置 1 h 或 4 靜置 3 h4 h，經(jīng) 2 000 r/min3 000 r/min 離心 15min 分離血清，將血清移、分裝于新的無菌離心管，蓋緊，封好管口，貼上標(biāo)簽。剛死亡的綠孔雀可用無菌注射器從其心臟采血，直接轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，密封，編號，同法分離 血清。8.3 樣品儲運(yùn)8.3.1

17、 口咽及泄殖腔拭子拭子樣品在 4 條件下保存不應(yīng)超過 24 h，若長期保存，應(yīng)置于80 冰箱。8.3.2 組織樣品組織樣品應(yīng)冰凍（20 以下）保存和運(yùn)輸，且不能反復(fù)凍融。8.3.3 血清一周內(nèi)做檢查的血清可置 4 冰箱保存。若長時間保存，應(yīng)將血清放入20 或80 冰箱凍存。9 試驗步驟9.1 樣品制備9.1.1 口咽及泄殖腔拭子用經(jīng)滅菌的鑷子將拭子中的液體充分?jǐn)D出，混勻樣品，直至拭子上沒有肉眼可見的樣品，室溫放置30min，4 3 000 r/min離心15min，轉(zhuǎn)移上清液于1.5 mL無菌離心管內(nèi)，編號備用。9.1.2 組織樣品取適量待檢樣品置于潔凈、滅菌并烘干的研缽中，加入液氮充分研磨。

18、按1 g 組織樣品加10 mL PBS的比例混勻，4 3 000 r/min離心15min，取上清液轉(zhuǎn)入1.5 mL 無菌離心管內(nèi)，編號，備用。9.2 雞胚接種9.2.1 樣品處理取9.1得到的上清液過濾，濾過液作為接種材料。9.2.2 樣品接種取9.2.1樣品，以0.2 mL/胚劑量經(jīng)尿囊腔途徑接種9 d11 d SPF雞胚，每個樣品接種35枚雞胚， 封閉進(jìn)針孔，在37 孵化箱內(nèi)孵育，每隔12 h觀察雞胚死亡情況。無菌收集24 h96 h死亡雞胚及96 h 仍存活雞胚的尿囊液，采用HI試驗測定尿囊液有無HA活性。9.3 MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)具體操作步驟如下：4DB53/T 1064.22021

19、a) 將樣品濾過液接種于長成致密單層的 MDCK 細(xì)胞瓶內(nèi)，置于 35 37 、含 5% CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，使病毒吸附細(xì)胞 2 h；b) 棄掉樣品液，用 DMEM 維持液（含 3%犢牛血清）洗一遍，每瓶加入 5 mL DMEM 維持液， 置于 35 37 、5% CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。維持液成份：DMEM 培養(yǎng)基，青霉素、鏈霉素、HEPES、胰酶終濃度分別為 100 IU/mL、100 g/mL、25 mmol/L 和 2 g/mL，用 NaHCO3 將pH 值調(diào)整為 7.2，過濾除菌，無菌檢驗合格；c) 逐日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，分別取陰性對照、未出現(xiàn)病變的和出現(xiàn)病變的細(xì)胞培養(yǎng)物

20、上清液，用 HA 試驗測定病毒的血凝滴度（效價）；d) 當(dāng) 75%100%細(xì)胞出現(xiàn)病變時收獲病毒，將細(xì)胞瓶放于70冰箱，凍融 12 次以使細(xì)胞破裂及釋放病毒。9.4 病毒血凝（HA）試驗和血凝抑制（HI）試驗9.4.1 病毒血凝（HA）試驗病毒血凝（HA）試驗方法：a) 在 96 孔 V 型微量反應(yīng)板，每孔預(yù)先加 25 L PBS；b) 向第 1 孔加入 25 L 病毒溶液（尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)物上清），反復(fù)吹吸 3 次5 次混勻；c) 從第 1 孔吸取 25 L 病毒溶液加入第 2 孔，混勻后吸取 25 L 加入第 3 孔，如此進(jìn)行 2 倍連續(xù)稀釋至第 11 孔，從第 11 孔吸取 25 L 溶

21、液棄去，但第 12 孔加入 25 L PBS 或正常尿囊液作為陰性對照孔；d) 每孔加入 25 L PBS；e) 每孔加入 25 L 1%雞紅細(xì)胞懸液；f) 輕輕振蕩血凝反應(yīng)板以混勻反應(yīng)體系，室溫（20 25 ）靜置 40min，或 4 靜置 60min， 當(dāng)陰性對照孔的紅細(xì)胞在孔底匯集成原點時判定結(jié)果。9.4.2 病毒血凝抑制（HI）試驗病毒血凝抑制（HI）試驗方法：a) 在 96 孔血凝反應(yīng)板，每孔預(yù)先加入 25 L PBS；b) 向第一孔加入 25 L 血清樣品，混勻；c) 在血凝反應(yīng)板上將血清作橫向的 2 倍連續(xù)稀釋，但第 12 孔、第 13 孔、第 14 孔和第 15 孔分別設(shè)置為加

22、 25 L PBS 的紅細(xì)胞對照孔、加未做任何免疫禽血清的陰性對照孔、加新城疫病毒抗體的對照孔和加禽腺病毒抗體的對照孔（對已確定禽流感病毒血清亞型的分離毒株，還可設(shè)置 陽性對照孔）；d) 每孔加入 25 L 4 HAU 的病毒抗原，室溫（20 25 ）靜置不少于 30min，或 4 靜置不少于 60min；e) 每孔加入 25 L 1 %RBCs，輕輕振蕩混勻，室溫（20 25 ）靜置約 40min，或 4 放置約 60min，當(dāng)紅細(xì)胞對照孔呈顯著鈕扣狀時判定結(jié)果。9.5 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增檢測9.5.1 病毒 RNA 的提取可用商品化RNA提取試劑盒提取待檢樣品（棉拭

23、子、組織或雞胚尿囊液）、陽性對照樣品及陰性對照樣品的病毒RNA。也可用RNA提取試劑（如Trizol）提取，方法如下：a) 將經(jīng)預(yù)處理的 250 L 待檢樣品加入 750 L RNA 提取試劑中，振蕩 2min，室溫放置 5min；5DB53/T 1064.22021b) 加入 250 L 氯仿，在微型振蕩器上振蕩 1min，室溫放置 5min，4 、12 000 r/min（約 14 000×g）離心 15min；c) 轉(zhuǎn)移上層水相至新離心管中，加入等量的異丙醇，充分混勻，室溫放置 15min，4 條件下12 000 r/min（約 14 000×g）離心 15min；d

24、) 小心吸棄上清，加入預(yù)先經(jīng) DEPC 處理的 75%乙醇 750 L，4 、12 000 r/min（約 14 000×g） 離心 5min；e) 小心吸棄上清，將沉淀自然風(fēng)干或于 50 烘干，加適量的經(jīng) DEPC 處理的超純水溶解；f) 取 5 L 提取物與 1 L 6×核酸上樣緩沖液混勻，做 1%瓊脂糖凝膠電泳檢查 RNA 提取效果， 對組織樣品觀測到 28S、18S 及 5.8S rRNA 三個條帶或至少前兩個條帶，提示 RNA 提取合格；g) 提取的 RNA 應(yīng)在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 RT 或 RT-PCR 擴(kuò)增，若需長期保存 RNA，應(yīng)置于80 冰箱或液氮內(nèi)。9.5

25、.2 RT-PCR 擴(kuò)增（一步法）取提取的 RNA 3 L 和每對引物（見表 1）各 1 L，配制 RT-PCR 擴(kuò)增體系（見表 2），蓋緊 PCR反應(yīng)管蓋子，置于 PCR 儀器反應(yīng)孔內(nèi)。擴(kuò)增參數(shù)：45 逆轉(zhuǎn)錄 45min；94 預(yù)變性 2min，94 變性 30s、52 退火 45s、68 延伸 45s，35 個循環(huán)，最后 68 延伸 8min。對擴(kuò)增任何亞型的 H 基因（Hx）中包含 Furin 酶切位點的片段，按模板 RNA 5 L，上、下游引物組合（見表 1）各 1 L 配制 RT-PCR 反應(yīng)體系。擴(kuò)增參數(shù)除退火溫度設(shè)置為 50 ，其余參數(shù)不變。表 1禽流感病毒 PT-PCR 引物目

26、的基因引物名稱引物序列 53擴(kuò)增產(chǎn)物長度（bp）MM-229UTTC TAA CCG AGG TCG AAA C229M-229LAAG CGT CTA CGC TGC AGT CCH5H5-372UGGA ATA TGG TAA CTG CAA CAC CA369H5-372LAAC TGA GTG TTC ATT TTG TCA ATGH7H7-501FAAT GCA CAR GGA GAG GGA ACT501H7-501RTGA YGC CCC GAA GCT AAA CCAH9H9-273FTGT GTC TTA CAG TGG GAC AAG CA273H9-273RTTG ACA

27、 AGA GGC CTT GGT CCT ATHxHA-1057.1-F HA-1057.2-FHA-1057.3-FGGR GAA TGC CCC AAA TAY GT GGR ARA TGC CCC AGR TAT GTGGR GAA TGC CCC AAR TAY AT164176HA-1232.1(555)-RHA-1232.2(555)-RCTG AGT CCG AAC ATT GAG TTG CTA TGV TGR TAW CCA TAC CACTG AGT CCG AAC ATT GAG TTY TGA TGYCTG AAD CCR TAC CA注：R=(A/G)，Y=(C/T)

28、，W=(A/T)；斜體字母表示非病毒序列6DB53/T 1064.22021表 2RT-PCR 擴(kuò)增體系組分體積（L）無 RNA 酶滅菌超凈水14.610×擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液2.5dNTPs（2.5 mmol/L each）2.0RNase 抑制劑（40 U/L）0.5AMV 反轉(zhuǎn)錄酶（5 U/L）0.7Taq DNA 聚合酶(5 U/L)0.7上游引物 P1（20 mol/L)0.5下游引物 P2 (20 mol/L)0.5模板 RNA3.0總計25.09.5.3 電泳取PCR產(chǎn)物按常規(guī)方法用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢查（電壓8 V 10 V/cm凝膠長度，30min 40min）。9.

29、5.4 照膠用凝膠成像系統(tǒng)在紫外光下進(jìn)行拍照凝膠，記錄PCR擴(kuò)增結(jié)果。9.6 H 蛋白序列分析取HA滴度陽性，新城疫病毒抗體和禽腺病毒抗體HI滴度陰性的雞胚尿囊液或MDCK細(xì)胞培養(yǎng)物上清，按9.5提取總RNA做H基因的RT-PCR擴(kuò)增。出現(xiàn)對應(yīng)表1所示擴(kuò)增產(chǎn)物大小的H5亞型369 bp條帶或Hx亞型164 bp176 bp條帶，參照膠回收試劑盒方法回收條帶內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物，做雙向核酸測序；根據(jù)基因序列推導(dǎo)氨基酸序列，對禽流感病毒H蛋白的Furin酶切位點進(jìn)行堿性氨基酸數(shù)量和位置的分析。10 試驗數(shù)據(jù)處理10.1 HA 試驗結(jié)果判定判定如下：a) 將血凝反應(yīng)板傾斜 60 ，觀察紅細(xì)胞有無淚珠樣流淌，

30、完全無淚珠樣流淌（出現(xiàn) 100%凝集） 的病毒最高稀釋倍數(shù)判為該病毒的血凝效價，即代表 1 個 HAU；b) 血凝判定標(biāo)準(zhǔn)：紅細(xì)胞均勻分散在孔內(nèi)、傾斜血凝反應(yīng)板時不流淌判為完全凝集，記作+； 75%凝集記作+；50%凝集記作+；25%凝集記作+；紅細(xì)胞匯集于孔底中央呈圓點、傾斜血凝反應(yīng)板時與對照孔（僅含 25 L RBCs 和 50 L PBS）RBCs 流淌相同的孔判定為不凝集，記作。10.2 HI 試驗結(jié)果判定判定如下：7DB53/T 1064.22021a) 紅細(xì)胞均勻分散在孔底周圍、傾斜血凝反應(yīng)板時不流淌判為完全凝集，記作+，75%凝集記作+，50%凝集記作+，25%凝集記作+，紅細(xì)胞

31、集中在孔底中央呈圓點、傾斜血凝反應(yīng)板時與對照孔（僅含 25 L RBCs 和 50 L PBS）RBCs 流淌相同的孔判定為不凝集或血凝被抑制，記作；b) 完全抑制 4 HAU 病毒抗原的血清最高稀釋倍數(shù)為該血清抗體的 HI 滴度；c) 檢查各種對照：陰性對照血清 HI 滴度不高于 4 (22 或 2 log2)，陽性對照血清 HI 滴度與已知滴度誤差不超過 1 個滴度，紅細(xì)胞對照無自凝現(xiàn)象，結(jié)果有效，試驗成立；d) 如果高于 1:16（24 或 4 log2）稀釋度的血清能完全抑制 4 HAU 的病毒抗原，判定該 HI 滴度為陽性，表明未經(jīng)免疫個體發(fā)生禽流感病毒感染；e) 如果血清 HI 滴度為 16，判為可疑，需重復(fù) HI 試驗，若 HI 滴度仍為 16，可判定血清抗體陽性，若 HI 滴度為 8 則判定為血清抗體陰性；f) 在所有的確診試驗中針對試驗采用的 HAU 應(yīng)設(shè)病毒 HA 滴度的追溯性測