酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISAELISA夾心法測定抗原ELISA間接法測定ppt課件

1、酶聯(lián)免疫吸附實驗酶聯(lián)免疫吸附實驗ELISAELISAELISAELISA夾心法測定抗原夾心法測定抗原ELISAELISA間接法測定抗體間接法測定抗體原理及意義原理及意義 酶聯(lián)免疫吸附測定酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA)是以免疫學(xué)反是以免疫學(xué)反響為根底，將抗原、抗體的特異性反響與酶對底響為根底，將抗原、抗體的特異性反響與酶對底物的高效催化作用結(jié)合起來的一種敏感性很高的物的高效催化作用結(jié)合起來的一種敏感性很高的新型免疫檢測技術(shù)。新型免疫檢測技術(shù)。 將知抗原或抗體吸附在固相載體微孔聚苯乙烯將知抗原或抗體吸附在固相載體微孔聚苯乙烯塑料

2、板上，經(jīng)過抗原抗體特異性結(jié)合吸附待測樣塑料板上，經(jīng)過抗原抗體特異性結(jié)合吸附待測樣品中的抗體或抗原后，加酶標(biāo)抗體酶與抗體或品中的抗體或抗原后，加酶標(biāo)抗體酶與抗體或抗原結(jié)合后，既不改動抗體或抗原免疫反響的特抗原結(jié)合后，既不改動抗體或抗原免疫反響的特異性，又不影響酶本身的活性和底物后，在相異性，又不影響酶本身的活性和底物后，在相應(yīng)酶底物的作用下生成有色物質(zhì)，其顏色深淺與應(yīng)酶底物的作用下生成有色物質(zhì)，其顏色深淺與標(biāo)志物中相應(yīng)的抗體或抗原的含量呈正比，由此標(biāo)志物中相應(yīng)的抗體或抗原的含量呈正比，由此可測定抗原或抗體的含量?？蓽y定抗原或抗體的含量。 常用的常用的ELISA法有雙抗體夾心法測定抗原和間法有雙抗

3、體夾心法測定抗原和間接法測定抗體。接法測定抗體。ELISAELISA法雙抗體夾心法測定抗原法雙抗體夾心法測定抗原1.1.原理原理一步法一步法二步法二步法常用試劑盒分一步法和二步法，二者原理完全一樣。常用試劑盒分一步法和二步法，二者原理完全一樣。一步法一步法 將圖中的第將圖中的第2步和第步和第3步同時進展，允許混合參與，其構(gòu)步同時進展，允許混合參與，其構(gòu)成的免疫復(fù)合物，根本不影響目測的結(jié)果，適用于目測結(jié)果。成的免疫復(fù)合物，根本不影響目測的結(jié)果，適用于目測結(jié)果。二步法二步法 如圖中第如圖中第2步和第步和第3步由于分步進展，其結(jié)果較準(zhǔn)確，主步由于分步進展，其結(jié)果較準(zhǔn)確，主要用于需求定量檢測時。要用于

4、需求定量檢測時。2.2.資料以測資料以測HBsAgHBsAg為例為例試劑：試劑：HBsAgHBsAg診斷試劑盒診斷試劑盒器材：酶聯(lián)儀，微量加樣器，吸頭等器材：酶聯(lián)儀，微量加樣器，吸頭等3.3.方法方法加樣：每組加樣：每組7 7微孔，待檢微孔，待檢4 4孔，空白對照孔，空白對照1 1孔，陰、陽性孔，陰、陽性對照各對照各1 1孔。分別加陰、陽性對照孔。分別加陰、陽性對照1 1滴和滴和50ul50ul待測樣本待測樣本于相應(yīng)孔內(nèi)，置于相應(yīng)孔內(nèi)，置3737水浴箱溫育水浴箱溫育3030分鐘。分鐘。加酶：除空白對照孔外，每孔加加酶：除空白對照孔外，每孔加1 1滴酶標(biāo)溶液，混勻后滴酶標(biāo)溶液，混勻后封板，置封板

5、，置3737水浴箱溫育水浴箱溫育3030分鐘。分鐘。洗滌：用洗滌液按闡明配制注滿各孔，靜置洗滌：用洗滌液按闡明配制注滿各孔，靜置2020秒，秒，甩去洗滌液，反復(fù)甩去洗滌液，反復(fù)4 4次，最后一次在吸水紙上拍干。次，最后一次在吸水紙上拍干。顯色：每孔加底物液顯色：每孔加底物液A A 、B B 各各1 1滴滴50ul50ul，輕拍混勻，輕拍混勻，置置3737水浴水浴1515分鐘，肉眼察看。分鐘，肉眼察看。終止：每孔加終止液終止：每孔加終止液1 1滴滴50ul50ul，輕拍混勻。，輕拍混勻。4.4.結(jié)果測定結(jié)果測定 用酶標(biāo)儀用酶標(biāo)儀450nm450nm測定各孔吸光度測定各孔吸光度ODOD值先用空白孔

6、值先用空白孔校零，校零，P/NP/N值值2.12.1者判為者判為HBsAgHBsAg陽性，陽性，2.12.1者判為陰性。者判為陰性。ELISAELISA法間接法測定抗體法間接法測定抗體1.1.原理原理2.2.資料以測結(jié)核抗體為例資料以測結(jié)核抗體為例試劑：結(jié)核抗體診斷試劑盒試劑：結(jié)核抗體診斷試劑盒器材：酶聯(lián)儀，微量加樣器，吸頭等器材：酶聯(lián)儀，微量加樣器，吸頭等3.3.方法方法包被抗原：在聚苯乙烯微量反響板孔中加抗原包被抗原：在聚苯乙烯微量反響板孔中加抗原100l100l，4 124 121818小時。小時。用用1 1BSABSA或正常兔血清或正常兔血清44、12121818小時阻斷，小時阻斷，4

7、4冰冰箱備用。箱備用。洗滌：用前應(yīng)進展漂洗去除雜蛋白，用洗滌液洗洗滌：用前應(yīng)進展漂洗去除雜蛋白，用洗滌液洗3 3次，次，每次每次3 3分鐘。分鐘。加待測樣本：將血清稀釋成加待測樣本：將血清稀釋成1 1：5050，每份標(biāo)本加復(fù)孔，每份標(biāo)本加復(fù)孔，每孔每孔100l100l，3737保溫保溫3030分鐘。設(shè)知的陽性和陰性血分鐘。設(shè)知的陽性和陰性血清對照。清對照。洗滌洗滌3 3次后，加兔抗次后，加兔抗IgGIgG酶結(jié)合物，酶結(jié)合物，3737保溫保溫3030分鐘，分鐘，以一樣的方法洗滌以一樣的方法洗滌3 3次。次。加新穎配制的鄰苯二胺底物溶液和雙氧水溶液各加新穎配制的鄰苯二胺底物溶液和雙氧水溶液各100l100l。靜止。靜止2020分鐘，再參與分鐘，再參與3mol/L3mol/L硫酸每孔硫酸每孔50l50l終終止反響。止反響。4.4.結(jié)果測定結(jié)果測定肉眼察看：白色背景上察看四孔呈現(xiàn)的顏色反響，與知陽性和肉眼察看：白色背景上察看四孔呈現(xiàn)的顏色反響，與知陽性和陰性孔比較。陰性孔比較。酶聯(lián)儀比色：酶聯(lián)儀用酶聯(lián)儀比色：酶聯(lián)儀用492nm492nm測測ODOD值。正常人血清值。正常人血清ODOD0.390.39，結(jié)核患者結(jié)核患者0.40.4。正常人存在著結(jié)核