病毒的分類及微生物檢驗(yàn)

1、二、病毒分類系統(tǒng)和命名 （一）病毒分類一般系統(tǒng) 病毒分類系統(tǒng)將病毒分類為 科(families)、屬(genera)、種(species)等三級，或科、亞科、屬、種等四級。 根據(jù)病毒體的形態(tài)、基因結(jié)構(gòu)和復(fù)制模式等特征將病毒分為科和亞科； 在科或亞科中又根據(jù)理化特性和血清學(xué)特性等分病毒屬，屬名后綴為virus，屬下分為不同的病毒種。 分類 可將病毒分為科、亞科和屬 常用核酸類型分類 1 DNA virus (DNA病毒中有9科 ) 2 RNA virus ( ssRNA 7 科. ssRNA 7 科. dsRNA 2科 ) 3 反轉(zhuǎn)錄病毒 (DNA和RNA反轉(zhuǎn)錄病毒中有2科) 依傳播方式和感染部

2、位分類 1 蟲媒病毒 2 腸道病毒 3 呼吸道病毒 4 肝炎病毒 5 性傳播病毒（二）非尋常病毒的分類 1 衛(wèi)星病毒（satellites） 2 類病毒（viroids） 3 朊粒（prion） 第三節(jié) 病毒學(xué)診斷 自身免疫病和腫瘤密切相關(guān)。病毒性疾病在人類疾病中占有十分重要的地位。 由于病毒感染的防治原則不同于細(xì)菌等其他微生物，盡早判定病人感染或某傳染病的流行是由病毒所致，是醫(yī)生和微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的責(zé)任和任務(wù)。 病毒的分離與鑒定當(dāng)然是病毒病原學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但因病毒是嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生，病毒分離必須有活的細(xì)胞支持，故病毒的分離鑒定較困難。 一、標(biāo)本的采集、運(yùn)送和處理 1. 應(yīng)在感染早期（發(fā)病12天

3、內(nèi)）采集。 2. 必須無菌操作，對用于病毒分離培養(yǎng)的污染標(biāo)本用 高濃度抗生素處理過夜，必要時(shí)需加抗真菌藥物等 3. 及時(shí)送檢，送檢的組織等可放入含有抗生素的50% 甘油緩沖鹽水或二甲基亞砜中低溫冷藏。 4. 血清學(xué)檢查的標(biāo)本，尤其檢測抗病原體的IgG型抗 體，應(yīng)分別在發(fā)病初期和恢復(fù)期采集雙份血清，只 有當(dāng)恢復(fù)期血清抗體效價(jià)比初期升高4倍或以上， 才具有確診意義。分離培養(yǎng)鑒定分離培養(yǎng)鑒定( (污染標(biāo)本用抗生素處理過夜污染標(biāo)本用抗生素處理過夜) )快速診斷快速診斷雞胚雞胚紅細(xì)胞凝紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)集試驗(yàn)紅細(xì)胞凝紅細(xì)胞凝集抑制試集抑制試驗(yàn)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)CPECPE電鏡檢測電鏡檢測中和試驗(yàn)中和試驗(yàn)TC

4、ID50TCID50pfupfu測定測定MOIMOI測定測定動(dòng)物接種動(dòng)物接種觀 察 發(fā) 病觀 察 發(fā) 病情況情況中和試驗(yàn)中和試驗(yàn)免 疫 學(xué) 檢免 疫 學(xué) 檢測測ID50ID50測定測定LD50LD50測定測定形態(tài)學(xué)形態(tài)學(xué)電鏡觀察電鏡觀察病毒顆粒病毒顆粒（大小、（大小、形態(tài)）形態(tài)）光學(xué)顯微鏡光學(xué)顯微鏡觀察觀察包涵體包涵體抗原抗原檢測檢測ELISAELISAIFIFRIARIAWBWB核酸檢測核酸檢測核酸電泳核酸電泳核酸雜交核酸雜交PCRPCR基因芯片基因芯片基因測序基因測序抗體抗體檢測檢測ELISAELISARIARIAIFIFWBWB病毒成分檢測病毒成分檢測 標(biāo)本采集標(biāo)本采集 二、病毒的分離與

5、鑒定 以下情況需考慮進(jìn)行病毒分離與鑒定： 1. 病程長且診斷困難的病人。 2. 懷疑為新現(xiàn)病毒（emergent virusemergent virus）感染或已被消滅 的病毒性疾病懷疑“死灰復(fù)燃”。 3. 為鑒別臨床上具有相同癥狀的疾病。 4. 監(jiān)測所用減毒活疫苗。 5. 用于病毒生物學(xué)性狀的研究或流行病學(xué)調(diào)查等。 （一）病毒的分離培養(yǎng)1細(xì)胞培養(yǎng)：原代培養(yǎng)細(xì)胞、 二倍體細(xì)胞株、傳代細(xì)胞 系或株 標(biāo)本接種后溶細(xì)胞型感染病毒可致細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病毒效應(yīng)（CPE），穩(wěn)定感染病毒細(xì)胞并不出現(xiàn)明顯病變，但被感染的細(xì)胞膜表面會表達(dá)病毒蛋白等標(biāo)志物，如血凝素、神經(jīng)氨酸酶、病毒特異性抗原等。2雞胚培養(yǎng)和動(dòng)物接種

6、： 流感病毒的分離培養(yǎng)雖可用犬腎傳代細(xì)胞（MDCK）,但雞胚接種仍是最常用的敏感而特異的方法。 動(dòng)物接種是最原始的分離病毒的方法，但目前少用。 （二）病毒的鑒定1病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖的鑒定指標(biāo)（1）細(xì)胞病變（ cytopathic effect, CPE ） 大多數(shù)病毒屬溶細(xì)胞型感染，在敏感細(xì)胞內(nèi)增殖會出現(xiàn)CPE。CPE表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)顆粒增多、圓縮、聚集、融合，有的可形成包涵體，出現(xiàn)細(xì)胞溶解、脫落、死亡等。 不同病毒的CPE特征不同。因此，觀察病毒所致CPE的特點(diǎn)，根據(jù)細(xì)胞類型，細(xì)胞病變種類可對標(biāo)本中感染的病毒進(jìn)行判定。脊髓灰質(zhì)炎病毒感染所致CPEa. 未感染的vero細(xì)胞（一種非洲綠猴腎細(xì)胞系

7、）b. 脊髓灰質(zhì)炎病毒感染的vero細(xì)胞（顯示細(xì)胞圓縮、分散 、 壞死、脫落）。 （2）紅細(xì)胞吸附（hemadsorption） 包膜上帶有血凝素的病毒感染敏感細(xì)胞后， 血凝素會出現(xiàn)于細(xì)胞膜表面，使感染細(xì)胞能與加入的紅細(xì)胞結(jié)合出現(xiàn)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象，這是檢測正粘病毒和副粘病毒的間接指標(biāo)。 （3）中和試驗(yàn)（neutralization test, NT） 用抗某病毒血清先與待測病毒懸液混合，經(jīng)作用一定時(shí)間后接種敏感細(xì)胞，培養(yǎng)后觀察CPE或 紅細(xì)胞吸附現(xiàn)是否消失，即特異性抗體是否能 中和相應(yīng)病毒的感染。如用不同濃度的抗血清 進(jìn)行中和試驗(yàn)，還可根據(jù)抗體的效價(jià)對待測病毒 液進(jìn)行半定量檢測。 （1）空斑形成

8、試驗(yàn)（plaque formation） （2）50%組織細(xì)胞感染量 （3 3）感染復(fù)數(shù) （Multiplicity of infection, Multiplicity of infection, MOIMOI）2病毒感染性測定及病毒數(shù)量測定 三、病毒感染的快速診斷 病毒的分離與鑒定是病毒診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用困難，而且費(fèi)時(shí)，對臨床病毒感染癥的診治幫助不大。快速診斷主要指臨床標(biāo)本繞過分離培養(yǎng)復(fù)雜而較長的過程，直接在電鏡下觀察病毒顆粒，或直接檢測標(biāo)本中的病毒成分和IgM抗體等，以作出快速和早期診斷。 （一）形態(tài)學(xué)檢查1電鏡和免疫電鏡檢查 含有高濃度病毒顆粒（107顆粒/ml）的樣品，可

9、直接應(yīng)用電鏡技術(shù)觀察。對含低濃度病毒的樣本可用免疫電鏡技術(shù)，或用超速離心機(jī)將標(biāo)本離心進(jìn)行電鏡觀察，以提高檢出率和特異性。電鏡下不僅能觀察病毒的形態(tài)學(xué)特征，還可測量病毒的大小。2光學(xué)顯微鏡檢查 病理標(biāo)本或含有脫落細(xì)胞及針吸細(xì)胞的標(biāo)本檢測病毒包涵體。包涵體對病毒的診斷有一定價(jià)值。觀察病毒CPE。病理標(biāo)本根據(jù)病理特征，再配合組化染色技術(shù)進(jìn)行診斷。 （二）病毒蛋白抗原檢測 1. 酶聯(lián)免疫技術(shù)（ELISA） 2. 免疫熒光標(biāo)記技術(shù)（IF） 3. 放射免疫標(biāo)記（SPRIA） 這些技術(shù)操作簡便、特異性強(qiáng)、敏感性高。尤其使用單克隆抗體標(biāo)記技術(shù)可測到ng（10-9g） 至pg（10-12g）水平的抗原或半抗原。

10、其中由于放射性核酸可引起放射性污染，已逐漸被非放射性標(biāo)記物（如地高辛等）所代替。 （三）早期抗體檢測1IgM型特異抗體檢測 檢測病毒感染機(jī)體產(chǎn)生的特異性IgM，如孕婦羊水中查到IgM型特異抗體可早期診斷某些病毒引起的胎兒先天性感染；IgM抗體測定有助于早期診斷，但感染機(jī)體產(chǎn)生IgM抗體有明顯個(gè)體差異。 2免疫印跡試驗(yàn)（Western blot, WB） 某些病毒感染的診斷需持慎重認(rèn)真的作法。如AIDS和成人白血病等，在初篩試驗(yàn)陽性后，尚需用WB法進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)。 （四）檢測病毒核酸1核酸電泳：正粘病毒屬和呼腸病毒屬的核酸是分節(jié)段 的，甲型流感病毒8個(gè)節(jié)段，輪狀病毒11個(gè)節(jié)段。從 標(biāo)本中直接提取輪

11、狀病毒的核酸，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠 電泳（PAGE）和銀染色后在凝膠板上清楚核酸條 帶，結(jié)合臨床情況可進(jìn)行診斷。2核酸雜交：其原理是應(yīng)用已知序列的核酸單鏈作為探 針（probe），探針預(yù)先用放射性核素（32P或131I）或 生物素、地高辛苷原、辣根過氧化物酶等標(biāo)記，在一 定條件下按堿基互補(bǔ)規(guī)律與標(biāo)本 （1）斑點(diǎn)雜交（dot blot hybridization）： （2）原位雜交（in site hybridization）： （3）DNA印跡（southern blot）和RNA印跡 （northern blot）雜交技術(shù)3聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 4基因芯片技術(shù)（gene chip） 5基因測序

12、 包括病毒全基因測序和特征性基因 片段的測序。 第三節(jié) 病毒學(xué)診斷 自身免疫病和腫瘤密切相關(guān)。病毒性疾病在人類疾病中占有十分重要的地位。 由于病毒感染的防治原則不同于細(xì)菌等其他微生物，盡早判定病人感染或某傳染病的流行是由病毒所致，是醫(yī)生和微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的責(zé)任和任務(wù)。 病毒的分離與鑒定當(dāng)然是病毒病原學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但因病毒是嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生，病毒分離必須有活的細(xì)胞支持，故病毒的分離鑒定較困難。 三、病毒感染的快速診斷 病毒的分離與鑒定是病毒診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用困難，而且費(fèi)時(shí)，對臨床病毒感染癥的診治幫助不大?？焖僭\斷主要指臨床標(biāo)本繞過分離培養(yǎng)復(fù)雜而較長的過程，直接在電鏡下觀察病毒顆粒，或直接檢測標(biāo)本中的病毒成分和IgM抗體等，以作出快速和早期診斷。 （四）檢測病毒核酸1核酸電泳：正粘病毒屬和呼腸