《馬鈴薯花葉病》word版參考模板

1、一 馬鈴薯花葉病的表現(xiàn) 1 葉病包括4種病毒:1925年發(fā)現(xiàn)的馬鈴薯X病毒(PVX)、1952年發(fā)現(xiàn)的馬鈴薯S病毒(PVS)、1932年鑒定的馬鈴薯A病毒(PVA)及1931年記載的馬鈴薯Y病毒(PVY)。（1）馬鈴薯X病毒 (Potato virus X 簡(jiǎn)稱PVX)在馬鈴薯上引起輕花葉癥，有時(shí)產(chǎn)生斑駁或環(huán)斑，病毒粒體線形，長480一580納米，其寄主范圍廣，系統(tǒng)侵染的植物主要是茄科，病毒稀釋限點(diǎn)1000001000000倍，鈍化溫度68一75C，體外存活期l年以上。導(dǎo)致的癥狀不同，通常的癥狀為輕型斑駁花葉，葉片顏色深淺不一，小葉片上葉脈間產(chǎn)生黃色嵌斑，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)產(chǎn)生植株頂端壞死、葉片皺縮，

2、植株矮化。通常引起花葉,伴有矮化癥狀,大田可見頂花葉和系統(tǒng)花葉,葉片局部濃綠或葉脈壞死,葉片變窄,葉上部畸形等".（2）馬鈴薯S病毒 (Potato virusS 簡(jiǎn)稱PVS)，在馬鈴薯上引起輕度皺縮花葉或不顯癥，多數(shù)品種上引起葉脈顏色變深、下陷，葉片粗縮，葉尖下卷，葉色變淺；有的品種感病后產(chǎn)生輕度斑駁、脈帶；有的易感品種在感病后期葉片變成古銅色，嚴(yán)重皺縮，葉面產(chǎn)生小的壞死斑病毒粒體線形，長650納米，其寄主范圍較窄，系統(tǒng)侵染的植物僅限于茄科的少數(shù)植物，病汁液稀釋限點(diǎn)1一10倍，鈍化溫度55一60C，體外存活期3一4天。目前主要根據(jù)在鑒別寄主昆諾黎上引起的癥狀不同,把Pvs分為2個(gè)株

3、系,即Pvso(ordinarystrain)和PvsA(AndeanStrain)4."前者在昆諾黎上引起局部壞死斑,后者引起系統(tǒng)斑駁癥狀"這2個(gè)株系在馬鈴薯上引起的癥狀也不盡相同,前者單獨(dú)侵染通常為隱癥帶毒,后者常常導(dǎo)致葉片青銅色,并伴有壞死斑點(diǎn)"（3)馬鈴薯A病毒 (PotatovirusA簡(jiǎn)稱PVA)病毒浸染植株后，葉片扭曲，葉間出現(xiàn)黃色斑駁，后期葉脈下陷，葉邊緣粗縮,在馬鈴薯上引起輕花葉或不顯癥病毒粒體線形，長730納米，其寄主范圍較窄，僅侵染茄科少數(shù)植物，病汁液稀釋限點(diǎn)10倍，鈍化溫度4452C，體外存活期12一18小時(shí)。PVA單獨(dú)浸染常引起花葉或皺葉

4、,有時(shí)無癥狀 .馬鈴薯 A 病毒（PVA）一般會(huì)在馬鈴薯葉片上引起輕度花葉，在葉脈上或葉脈間會(huì)呈現(xiàn)出不規(guī)則的淺色斑，暗色部分比健葉顏色深，葉子表面粗糙，葉緣可產(chǎn)生皺褶呈波狀，在有的栽培品種上可表現(xiàn)不同程度的卷曲和皺縮。病株的莖枝向外彎曲，常呈開散狀。(4) 馬鈴薯Y病毒 (potato virus Y 簡(jiǎn)稱PVY)，PVY是一種很典型的RNA病毒在馬鈴薯上引起嚴(yán)重花葉或壞死斑和壞死條斑，病毒粒體線形，長730納米，該病毒寄主范圍較廣，可侵染茄科多種植物，病汁液稀釋限點(diǎn)100一1000倍，鈍化溫度52一62C，體外存活期12天，這種病毒引起的馬鈴薯病,一般分為馬鈴薯重花葉病、條斑垂葉壞死病、條斑

5、花葉病條斑花葉病、點(diǎn)條斑花葉病.PVY具有PVY0株系(普通株系)、PVYc株系(條痕花樣株系)、PVYN株系(煙草葉脈壞死株系)等多個(gè)不同特性的變異株系.依據(jù)血清學(xué)反應(yīng),PVY分成PVY OC血清型和PVYN血清型; PVY粒子為彎曲的線條狀粒子,通常長約700一900nm,直徑11一15nm,大小為730x11nm螺旋對(duì)稱,螺距3.4nm,顆粒含有大約5%的核酸和95%的蛋白質(zhì)"沉降為單一組分,沉降系數(shù)約150s在cscl中浮力密度為1.31g.cm一3"致死溫度52一55e,體外保毒期2一3d,稀釋終點(diǎn)10一4-10一5二 馬鈴薯病毒檢測(cè)技術(shù)1 指示植物法1 病毒名稱

6、 接種方式 指示植物及其癥狀（1）PVX 汁液摩擦 (1) 千日紅：接種5-7天后葉片出現(xiàn)紫紅環(huán)枯斑 (2)千日紅對(duì)馬鈴薯x病毒的反應(yīng)是接種后在葉片上出現(xiàn)紅 色病斑 (3) 白花刺果曼陀羅：接種10天后系統(tǒng)花葉 (4) 指尖椒：接種10-12天后葉片出現(xiàn)褐壞死斑點(diǎn)，以后系統(tǒng)花葉（2）PVY 汁液摩擦 (1) 枸杞：接種10天后接種葉片出現(xiàn)不清晰的褐色局部病斑 ( 2)馬鈴薯A6：接種5-10天接種葉片出現(xiàn)褐色環(huán)狀枯斑，初 侵染呈綠環(huán)斑 (3) 洋酸漿對(duì)馬鈴薯Y病毒的反應(yīng)是接種后在葉片上出現(xiàn)小枯斑（3）PVS 汁液摩擦 德伯尼煙：初期明脈，以后系統(tǒng)綠塊斑花葉 （4） PVA 地霉松對(duì)馬鈴薯A病毒

7、的反應(yīng)是在葉片上出現(xiàn)許多小型點(diǎn)狀病斑 2 電子顯微鏡技術(shù)3雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法 在酶聯(lián)反應(yīng)板的每個(gè)孔中加入100ul稀釋好的包被液(在每10 mL包被緩沖液中加入35ul待測(cè)病毒抗體), 37攝氏溫度育34 h,或室溫 孵育5h,取待測(cè)樣品約0. 5 g放入樣品袋中,加入2. 0 mL提取緩沖液,研磨樣品至完全磨碎。將包被好的反應(yīng)板洗滌后每孔加入100ul樣品液。密封后將其放入4 攝氏溫度冰箱孵育過夜。反應(yīng)板經(jīng)洗滌后每孔加入90ul已稀釋的酶標(biāo)液(每10 mL包被緩沖液中加入35Ll待測(cè)病毒對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)抗體), 37攝氏溫度 育34 h,或室溫下5 h洗板后每孔中加入80ul的底物溶液, 3

8、0 min左右觀察結(jié)果并用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)儀讀出數(shù)據(jù)。二 馬鈴薯花葉病的取樣勻槳法,稱取病葉l克加PB緩沖液(O.IM磷酸緩沖液PH7.0)lml,勻漿,8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,取上清即為病毒懸液,病毒懸液再用PB緩沖液分別稀釋成10-1,10-2 .10-5,備用. 馬鈴薯 X 病毒的毒源分離、繁殖和提純用一皺縮花葉癥狀的東農(nóng) 303 馬鈴薯檀株作為接種體，摩擦接種于 白花 刺果 蔓陀 蘿 (D atura stram onism )，以 排 除 Y 病 毒，然 后 接 種 于 千 日紅G om phrena globosa)T_進(jìn)行兩次單斑分離 ，再接種于 普 通煙 (N ieotia

9、na tabagurll e'4H um g M iao Y u)上繁 殖 病 毒 ，K hurana 等 的方法 ，稱取冷凍毒 源葉片300 g ，以B eckan O ptima LE 一8OK 型 超速離 心機(jī)提 純病 毒 ，用 O2 M 磷酸氫二鈉，0 05 M 檸檬酸三鈉緩沖液(內(nèi)含 O1二 乙基二硫代氨基 甲酸鈉和 O5巰基乙醇) 勻漿毒源葉 片，用 7 正丁醇 澄清提取液 ，先用聚 乙二 醇 6000 沉 淀一次病毒 ，然后 以 10000d ra in 離心 90 m in 沉淀病毒 ，再以 10- 40 蔗糖密度梯度，28000 rm in 離心90 m in，用26

10、0nm 監(jiān)測(cè) ，分部收集病毒帶 ，然后臺(tái)并病毒帶加進(jìn)一倍緩沖液 ，用 45000 rm in 離心 90 m in 回收病毒。 三 馬鈴薯花葉病病原培養(yǎng)基的制備四 馬鈴薯花葉病病原的理化性質(zhì)的鑒定 2 血清學(xué)檢測(cè)對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行DAS一ELISA檢測(cè),結(jié)果表 明馬鈴薯 PVX 可與PVX抗血清產(chǎn)生明顯的陽性反應(yīng)。 圖PvX病毒粒體 表 :各標(biāo)樣血清學(xué)反應(yīng)及粒體形態(tài)2 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù) (.1)雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(DAS一ELISA)DAS一ELISA是:一種傳統(tǒng)的植物檢測(cè)技術(shù),在馬鈴薯病毒檢測(cè)中有其獨(dú)到的應(yīng)用最早是由clark和AdnlnS1977年提出的,現(xiàn)在被普遍應(yīng)用于各種植物的病毒檢測(cè)

11、"為了加快反應(yīng)速度,節(jié)省時(shí)間,白艷菊等在常規(guī)DAS一ELISA方法基礎(chǔ)上做了兩方面的改進(jìn):第一,由常規(guī)ELISA在一塊板上一種酶標(biāo)記一種抗體改為同塊板上幾種酶對(duì)應(yīng)標(biāo)記幾種抗體(以PVX PVY PvS ) 第二,DAS.ELISA各種反應(yīng)均在恒溫?fù)u床中進(jìn)行,實(shí)現(xiàn)了快速同時(shí)檢測(cè)多種馬鈴薯病毒Ellis等采用雙抗體夾心法進(jìn)行了PvY的鑒定和PvY血清型地理分布工作國內(nèi)也廣泛應(yīng)用雙抗體夾心法檢測(cè)PvY并且己將此法應(yīng)用于脫毒苗的檢測(cè)中"宋吉軒等分別用改進(jìn)DAs一ELISA法和常規(guī)DAS一ELISA法對(duì)馬鈴薯4種主要病毒PVX!PVY!PVS!PLRV進(jìn)行檢測(cè),其檢測(cè)結(jié)果完全一致,且

12、靈敏度也基本相同=-04"結(jié)果表明,改進(jìn)DAs一ELIsA法是一種快速準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)方法,適合種薯生產(chǎn)中大量樣品的多種馬鈴薯病毒的快速檢測(cè)" 3 電子顯微鏡觀察取與PVX抗血清有陽性反應(yīng)的馬鈴薯葉片,采用汁液負(fù)染法進(jìn)行電鏡觀察。結(jié)果表明病毒粒體均為彎曲的線條狀,大小5l5 X 13nm ,與PVX病毒相符。4在紫外分光燈下剛定OD值 246nm(pvx)為最低,260nm為最高。消光系數(shù)OD260/280分別為1.22。 五 馬鈴薯花葉病病原的分子生物學(xué)方法1根據(jù)NCBI報(bào)道的六種馬鈴薯病毒的保守序列設(shè)計(jì)馬鈴薯X病毒(PVX)!馬鈴薯Y病毒(PVY)!馬鈴薯卷葉病毒(PLR

13、V)!馬鈴薯M病毒(PVM)!馬鈴薯S病毒(PVS)!馬鈴薯A病毒(PVA)的特異性引物對(duì)2馬鈴薯病毒單重RT一pCR檢測(cè)的靈敏度測(cè)定在馬鈴薯病毒單重靈敏度測(cè)定中,:將50一100mg馬鈴薯葉片或莖稈(薯塊可以取幼芽提取RNA)放入研缽中,迅速加入液氮并將樣品研磨至粉狀,研磨充分后把粉末轉(zhuǎn)移到離心管中,加入500ml裂解液(使用前應(yīng)按比例加入p一琉基乙醇),溶液和粉末振蕩均勻后將勻漿轉(zhuǎn)移到CS過濾柱上,12000rpm下離心3min,吸取上清液到另外的離心管中,再加入上清液0.5倍體積的乙醇,混勻合均勻后將溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)移到CR吸附柱中,12000rPm離心lmin,倒掉收集管中的廢液,將吸

14、附柱重新放回收集管"向吸附柱中加入7O0ul去蛋白液RWI,在12000rPm下離心lmin,倒掉廢棄液,將吸附柱放回收集管,然后向吸附柱中加入5O0ul漂洗液RW,在1200OrPm下離心lmin,倒掉廢棄液,重復(fù)洗滌一次"洗滌完后將吸附柱在12000rpm下離心2一3min,以去除殘液,讓吸附柱在室溫下放置幾分鐘后,將吸附柱放入新的離心管中,向吸附柱的膜中央加入50一80ulddHZO,再在室溫下放置幾分鐘,在1200Orpm下離心Zmin,得到提純的總RNA"提取的RNA溶液,于一20e保存"制備1%的瓊脂糖凝膠,電泳檢測(cè)各病毒RNA的完整性,在120伏恒壓條件下電泳30分鐘以上,在凝膠成像儀上成像檢測(cè)"先將六種病毒的RNA模板分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,將得到的cDNA用核酸蛋白分析儀測(cè)定其含量,經(jīng)測(cè)定,PVM的CDNA含量為710ng/ul,PVS的CDNA含量為63Ong/ul,PVX的CDNA含量為690ng/ul,