生物轉(zhuǎn)化與甾體藥物

1、陳代杰陳代杰上海來(lái)益生物藥物研究開發(fā)中心上海來(lái)益生物藥物研究開發(fā)中心Shanghai Health-Creation Centre for Biopharmaceuticals R & D1）應(yīng)用基因工程技術(shù)來(lái)構(gòu)建具有高度專一性和高）應(yīng)用基因工程技術(shù)來(lái)構(gòu)建具有高度專一性和高轉(zhuǎn)化率的基因工程菌；轉(zhuǎn)化率的基因工程菌；2）增加底物在水相中的溶解性；）增加底物在水相中的溶解性；3）改良固定化酶或固定化細(xì)胞的技術(shù)；）改良固定化酶或固定化細(xì)胞的技術(shù)；4）開發(fā)連續(xù)轉(zhuǎn)化和產(chǎn)物回收的技術(shù)；）開發(fā)連續(xù)轉(zhuǎn)化和產(chǎn)物回收的技術(shù)；5）在培養(yǎng)基中應(yīng)用像環(huán)糊精類物質(zhì)來(lái)提高底物轉(zhuǎn)）在培養(yǎng)基中應(yīng)用像環(huán)糊精類物質(zhì)來(lái)提高底物

2、轉(zhuǎn)化率?；?。 盡管有不少用于不飽和甾體邊鏈盡管有不少用于不飽和甾體邊鏈氧化的有效的化學(xué)方法，但對(duì)飽和氧化的有效的化學(xué)方法，但對(duì)飽和的脂肪族的脂肪族C-17邊鏈的氧化反應(yīng)的收邊鏈的氧化反應(yīng)的收率非常低，而用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)除率非常低，而用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)除去植物甾醇的邊鏈?zhǔn)且环N非常有效去植物甾醇的邊鏈?zhǔn)且环N非常有效的方法。的方法。http:/ 盡管在甾體的分子結(jié)構(gòu)中有許多盡管在甾體的分子結(jié)構(gòu)中有許多可以被微生物進(jìn)行羥基化的基團(tuán)，可以被微生物進(jìn)行羥基化的基團(tuán)，但目前在工業(yè)規(guī)模大量用微生物轉(zhuǎn)但目前在工業(yè)規(guī)模大量用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行的羥基化反應(yīng)主要是化技術(shù)進(jìn)行的羥基化反應(yīng)主要是11 -、11 -和和16

3、 -位點(diǎn)的羥基化反位點(diǎn)的羥基化反應(yīng)。其它一些可以在工業(yè)規(guī)模用微應(yīng)。其它一些可以在工業(yè)規(guī)模用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行羥基化反應(yīng)的位生物轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行羥基化反應(yīng)的位點(diǎn)包括有點(diǎn)包括有7 -、9 -和和14 -。 COOHHOHOHHOOOCH3OCH3HOOCH3OCH3HOOCH3HNCH3HOHOC2H5HOC2H5HODeoxycholic acid (I)Hecogenin (II)Diosgenin (III)Solasodine (IV)Ergosterol (V)Stigm asterol (VI)Sitosterol (VII)Cholesterol (VIII) I：脫氧膽酸； II：?？?/p>

4、皂配基； III：薯蕷皂苷配基； IV：茄解定； V：麥角甾醇; VI：豆油甾醇； VII：谷甾醇； VIII：膽甾醇； 9111213148171615105671234HO19182023222625242127HOHOHO2425262728282922232829CholesterolCampesterolSitosterolStigmasteroll氧氧 化化 反反 應(yīng)應(yīng) （）羥基化（）羥基化 所有甾體母核和角甲基位置均幾被羥化所有甾體母核和角甲基位置均幾被羥化 能在邊鏈上若干位置上羥基化能在邊鏈上若干位置上羥基化（）醇基氧化（）醇基氧化 氧化飽和鏈上醇基至酮基氧化飽和鏈上醇基至酮基

5、氧化丙烯基或高丙烯基至氧化丙烯基或高丙烯基至、-不飽和酮不飽和酮（）環(huán)氧化作用（）環(huán)氧化作用（ Epoxidation ）（）（）碳碳鍵的裂開碳碳鍵的裂開 氧的插入（氧的插入（Insertion）形成酯、醇、酮、內(nèi)酯和酸形成酯、醇、酮、內(nèi)酯和酸 逆醛醇縮合反應(yīng)（逆醛醇縮合反應(yīng)（ Retroaldol reactions） 碳鍵裂開產(chǎn)生非官能團(tuán)化的產(chǎn)物（碳鍵裂開產(chǎn)生非官能團(tuán)化的產(chǎn)物（Unfunctionalized products）（）（）雙鍵的導(dǎo)入反應(yīng)雙鍵的導(dǎo)入反應(yīng) 飽和飽和3酮和酮和4-3酮甾體的酮甾體的1位脫氫位脫氫 飽和飽和3酮和酮和-3酮甾體的酮甾體的4位脫氫位脫氫 伴著環(huán)芳香化的位

6、脫氫伴著環(huán)芳香化的位脫氫 1（10）53甾醇的芳香甾醇的芳香 化化 羥基、酯或過(guò)氧化合的消除羥基、酯或過(guò)氧化合的消除（）過(guò)氧化反應(yīng)（）過(guò)氧化反應(yīng) 5，7-雙烯間形成雙烯間形成5、8-表二氫化合物表二氫化合物 氫過(guò)氧化（氫過(guò)氧化（Hydroperoxidation）雜原子氧化雜原子氧化 立體專一性氧化硫醚到亞砜立體專一性氧化硫醚到亞砜 胺胺 被被 氧氧 化化 到到 酮酮 還還 原原 反反 應(yīng)應(yīng)（）（） 還還 原原 酮酮 到到 醇醇 （）（） 還還 原原 醛醛 到到 醇醇 （）（） 還還 原某氫過(guò)氧化物到醇原某氫過(guò)氧化物到醇（）（） 還還 原原 烯烯 醇醇 到到 伯伯 醇醇（）（） 雙雙 鍵鍵 飽

7、飽 和和 還還 原原1，4-3-酮到酮到4-3-酮酮 還還 原原4-3-酮到飽和酮到飽和- 酮酮 還還 原原4，6-3-酮到酮到4-3-酮酮 還還 原原1，6-20-酮到飽和酮到飽和20-酮酮 厭厭 氧氧 性性 脫脫 羥羥 基基 l異異 構(gòu)構(gòu) 化化 （）（）6-3-酮異構(gòu)化成酮異構(gòu)化成4-3-酮酮 （）（）-高環(huán)化（高環(huán)化（D-Homoannulation）（）（）反頻哪酮重排（反頻哪酮重排（Retropinacolic rearrangement） （）（）醇差向（立體）異構(gòu)醇差向（立體）異構(gòu)（）（）-表二氫化合物重排到橋氧醇表二氫化合物重排到橋氧醇 l結(jié)結(jié) 合合 （ 1 ） 羥羥 基基 乙

8、乙 酰化?；?（）（） 糖苷化糖苷化 （）（） 酚酚 醚醚 形形 成成 （）（） 胺胺 的的 乙酰乙酰 化化 （）甾體生物堿與碳酸相結(jié)合（）甾體生物堿與碳酸相結(jié)合l水水 解解（1 ）酯化）酯化 碳碳 酸酸 酯酯 內(nèi)內(nèi) 酯酯 硫硫 酸酸 酯酯 （ ） 醚醚 開開 裂裂 烯烯 醇醇 醚醚 開開 裂裂 為為 酮酮 酚酚 醚醚 開開 裂裂 為為 酚酚 苷苷 開開 裂裂 為為 醇醇 l引入引入 雜雜 原原 子子 ： （1）氮）氮 ：由：由21位醇基甾體形成位醇基甾體形成21-乙酰胺甾體乙酰胺甾體 （）鹵（）鹵 素素 ：鹵過(guò)氫化酶催化導(dǎo)入：鹵過(guò)氫化酶催化導(dǎo)入CH2OHCOOHHOOOCOOHOCH2OHO

9、COOHOCOOHOOO-C2H5COOH-CH3COOH-C2H5COOHOOCOOHOCOOHOOOCholesterol(V III)(XIII)(IX)(XIV)(XVIII)(XIX)(X X )(XV)(XVI)(XVII)(XXI)(XXII)(XXIII)ADD4ADXV：甾醇甾醇C24-羧酸；羧酸； XVI：甾醇甾醇C22-羧酸；羧酸； XVII：雄甾雄甾-4-烯烯-3,17-二酮二酮(AD)；XVIII：C19-甾醇；甾醇；XXIII：雄甾雄甾-1,4-雙烯雙烯-3,17-二酮二酮(ADD)；其余參見文章內(nèi)其余參見文章內(nèi) HOCH2ROCH2ROCH2CH2OHROCH2C

10、OSCoAROCHCSCoAROROCH2OROCOSCoARHOHOHOOCOOCOOOCOOHR CH3=Sitosterol(VII)H=Canpesteriol(XXV)HO(XXVI)(XXVII)(XXVIII)(XXXI)(XXXII)(XXX)(XV)(XIV)(XVII)(XXIX)-C2H5COSCoA-CO2OCO CoEnz-R-CH2COOH-CH3COOH-C2H5COOH圖 、微生物裂解甾醇和采油甾醇邊鏈的反應(yīng)OH OC O O HOOC H2O HOO C H3OOOOOOOOOOOOOOO HO( X V I I )( L V I I )( V I I )H

11、O O COOOOOH OOO HO HOO HOH OH O( L V I I I )O H( X X I I I )( X V I I )( L X I I )( L X I )( L I X )( L X )( X V I I )( X X I I I )H OC O2H2OWi l d t y p eA T O C6 8 4 2S C M- 1N R R LB - 8 1 1 9N R R LB - 1 1 0 4 5N R R LB - 8 1 2 9N R R LB - 8 1 2 8N R R LB - 8 1 1 3 5 9B - 8 1 3 5l1)添加有關(guān)的酶抑制劑添加有關(guān)

12、的酶抑制劑l2)利用被修飾的底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化利用被修飾的底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化l3)利用阻斷突變株用于定向生物轉(zhuǎn)化利用阻斷突變株用于定向生物轉(zhuǎn)化同時(shí)利用突變同時(shí)利用突變株、酶抑制劑株、酶抑制劑和被修飾的底和被修飾的底物進(jìn)行生物降物進(jìn)行生物降解邊鏈所得到解邊鏈所得到的產(chǎn)物的產(chǎn)物A c OC H2O HC2H5H OOS ito stero l d eriv a tiv e(L X III)E stero n e(X X X V II)H OOOH OROOOOH OC h o le ste ro l(V III)A n d ro sta -1 ,4 -d ie n e-3 ,1 7 -d io n e

13、 (X X III)R = H -c h o leste ro l(V III) C 2 H 5 -sito ste ro l(V II)A n d ro st-4 -e n e-3 ,1 7 -d io n e (V V II)-h y d ro x y a n d ro st-4 -en e -3 ,1 7 -d io n eM y c o b ac te riaN o ca rd ia S p .w ild ty p een z y m e in h ib ito rsM y co b a c te riu m S p .m u tan tsm u ta n tsm u ta n tsO

14、OA n d ro sta-1 ,4 -d ien e -3 ,1 7 -d io n e(X X III)M y co b a c te riu m S p .M y c o b ac te riu m S p .部分邊鏈降解的甾醇產(chǎn)物COOHOCOOHOOOOO圖 同時(shí)利用突變株、酶抑制劑和被修飾的底物進(jìn)行生物降解邊鏈所得到的產(chǎn)物OOCH3HOOHOHOOCH3OCOOCH3CH2OHCH2OHCH2OH(LX)(LXIV)(LIX)(LXV)(LXIV)(LXI)(LXVI)(LXVII)圖 部分邊鏈降解的甾醇產(chǎn)物OOOHOOHHOOH(CH3)2NO米 非 司 酮OOHOOHCHCHO

15、OHOHHOADD雌 酚 酮雌 二 醇11-OH-ADD炔 雌 醇雌 三 醇COOHOCH2OHO潑 尼 松炔 雌 醚COOHOCH2OHHO潑 尼 松 龍OOCOOHOCH2OHHOFCH3倍 他 米 松COOHOCH2OHHOF OH確 炎 舒 松COOHOCH2OHHOFCH3CCH3COHCHCCH3O地 塞 米 松OO4ADOOOOHE s t r o n eOHOHCCHOHCCHOHOHOHOHADD乙 炔 雌 二 醇乙 炔 雌 二 醇甲 酯雌 二 醇雌 三 醇MeOOH卵 泡 激 素OO1 9 - 去 甲 乙 炔 睪 酮1 9 - 去 甲 雄 甾 - 4 - 烯 - 3 ， 1

16、 7 - 二 酮OOH蛋 白 同 化 激 素OHCCHO黃 體 激 素OOOOO螺 內(nèi) 酯礦 質(zhì) 皮 質(zhì) 激 素OOH睪 酮OOHMe甲 基 睪 酮雄 激 素OMeH甲 基 雄 甾 烷 醇 酮蛋 白 同 化 激 素OHOOH氫 化 可 的 松其 它 高 檔 皮 質(zhì) 激 素CCH2OHO利用經(jīng)過(guò)修飾的底物進(jìn)行邊鏈的選擇性裂解利用經(jīng)過(guò)修飾的底物進(jìn)行邊鏈的選擇性裂解底物底物產(chǎn)物產(chǎn)物微生物微生物19-羥基甾醇羥基甾醇雌酮雌酮restrictus諾卡氏菌諾卡氏菌 ATCC 1488719-norsterols雌酮雌酮諾卡氏菌諾卡氏菌ATCC 191703-羥基羥基-19- 1，3，5 甾醇甾醇 雌酮雌酮

17、草分支桿菌草分支桿菌分支桿菌分支桿菌simplex節(jié)桿菌節(jié)桿菌IAM 166019-羥基羥基-4-膽甾烷膽甾烷-3-酮酮雌酮雌酮草分支桿菌草分支桿菌19-羥基羥基-膽甾醇膽甾醇-3- 乙酸鹽乙酸鹽雌酮雌酮草分支桿菌草分支桿菌19-羥基羥基- 4，7 甾醇甾醇3-羥基羥基-19-nor- 1，3，5（10）甾醇甾醇3-羥基羥基-19-nor- 1，3，5（10），），7（8）甾甾醇醇馬烯雌酮馬烯雌酮馬萘雌酮馬萘雌酮雌酮雌酮分支桿菌分支桿菌6-19-oxidosten-eones3-乙酸基乙酸基-5-氯（氟）氯（氟）-6-19-氧化氧化-甾醇甾醇6-19-氧化氧化-AD諾卡氏菌諾卡氏菌ATCC 1

18、9170分支桿菌分支桿菌 一些用于抑制環(huán)裂解的最為有效的抑制劑一些用于抑制環(huán)裂解的最為有效的抑制劑抑制劑名稱抑制劑名稱抑制機(jī)理抑制機(jī)理2,2-聯(lián)吡啶聯(lián)吡啶1,10-菲咯啉菲咯啉8-羥基羥基-喹啉喹啉5-硝基硝基-1,10-菲咯啉菲咯啉銅鐵靈銅鐵靈雙硫腙雙硫腙二苯基二硫縮二氨基脲二苯基二硫縮二氨基脲二乙基二硫氨基甲酸酯二乙基二硫氨基甲酸酯異煙酸酰肼異煙酸酰肼黃原酸黃原酸鄰苯二氨鄰苯二氨4-異戊酸環(huán)庚三烯酚酮異戊酸環(huán)庚三烯酚酮硫化四乙基秋蘭姆硫化四乙基秋蘭姆作為作為Fe2+的抑制劑的抑制劑Ni2+, Co2+, Pb2+, SeO32-, AsO2-用于取代鐵離子或阻斷用于取代鐵離子或阻斷SH-功

19、能功能亞甲藍(lán)亞甲藍(lán)刃天青刃天青正丙醇正丙醇氧化還原反應(yīng)氧化還原反應(yīng)在有在有酶抑酶抑制劑制劑存在存在的條的條件下件下進(jìn)行進(jìn)行甾醇甾醇邊鏈邊鏈的選的選擇性擇性裂解裂解 抑制劑抑制劑產(chǎn)物產(chǎn)物微生物微生物螯合劑螯合劑2,2-聯(lián)吡啶聯(lián)吡啶1,10-菲咯啉菲咯啉8-羥基羥基-喹啉喹啉ADADD其它雄甾烷衍生物其它雄甾烷衍生物Arthrobacter simplex 分支桿菌分支桿菌紅球菌紅球菌草分支桿菌草分支桿菌諾卡氏菌諾卡氏菌Arthrobacter globiformis 螯合劑和活性炭螯合劑和活性炭ADD分支桿菌分支桿菌 NRRL B-3683螯合劑和苯乙烯螯合劑和苯乙烯-二乙二乙烯苯共聚物烯苯共聚

20、物AD、ADD23,24-二去甲膽甾酸二去甲膽甾酸分支桿菌分支桿菌 NRRL B-3683螯合劑和脂肪、油、螯合劑和脂肪、油、甘油酯甘油酯ADD1-脫氫睪酮脫氫睪酮Arthrobacter simplex Brevibacterium lipolyticum草分支桿菌草分支桿菌無(wú)機(jī)離子無(wú)機(jī)離子AD、ADD其它雄甾烷衍生物其它雄甾烷衍生物分支桿菌分支桿菌 sp. KNGSF 70Arthrobacter simplex氧化還原顏料氧化還原顏料ADDArthrobacter simplex丙醇丙醇AD、ADD和其它衍和其它衍生物生物假單胞菌假單胞菌 sp. NCIBOOCorynespora-Ca

21、sicolaATCC 16718OOOH4-雄甾烯-3,17-反酮9 -羥基-4-雄甾烯-3,17-反酮O棒狀桿菌ATCC 21329或短桿菌 NRRLB-8054OOH9 -羥基-3-氧化娠烷-4,17-反烯-20-羧酸COOHCOOH3-氧化娠烷-4,17-反烯-20羧酸OCH3O黑 根 霉Rhizopus N igricansA TCC 62276孕 酮11-羥 基 孕 酮（ 主 要 產(chǎn) 物 11,6 -二 羥 基 孕 酮（ 微 量 副 產(chǎn) 物 11還 原 孕 酮（ 偶 然 產(chǎn) 生 副 產(chǎn) 物 OCH3OOCH3OOCH3OHO+HOOHHHOOCH2OHO新月彎孢霉OCH2OHOOHHO147化合物S氫化可的松OCH2OHOOHHOF的瑰色鏈絲菌（Streptomyces roseoc