第五章 基因克隆的載體系統(tǒng)2014

1、第五章 基因克隆的載體系統(tǒng)概述概述1、 載體（載體（vector）概念）概念 能將外源能將外源DNA分子攜帶進入宿主細胞分子攜帶進入宿主細胞,并進行復制或表達的工具稱為載體。并進行復制或表達的工具稱為載體。用來進行基因組克隆、用來進行基因組克隆、cDNA克隆或亞克克隆或亞克隆的隆的DNA分子分子。按功能分為克隆載體和表達載體。按功能分為克隆載體和表達載體。 載體的功能載體的功能n運送外源基因高效轉入受體細胞運送外源基因高效轉入受體細胞n為外源基因提供復制能力或整合能力為外源基因提供復制能力或整合能力n為外源基因的擴增或表達提供必要的條件為外源基因的擴增或表達提供必要的條件2 載體的特點載體的特

2、點n能在宿主細胞內獨立復制；能在宿主細胞內獨立復制；n有選擇標記，易于識別和篩選；有選擇標記，易于識別和篩選；n可插入一段較大的外源可插入一段較大的外源DNA分子而不分子而不影響自身復制；影響自身復制；n有合適的限制性酶切位點有合適的限制性酶切位點 第一節(jié)第一節(jié) 克隆載體克隆載體用于攜帶用于攜帶DNA片斷進入宿主細胞進行復制片斷進入宿主細胞進行復制或保存的載體稱為克隆載體?；虮４娴妮d體稱為克隆載體。 主要的克隆載體主要的克隆載體質粒載體質粒載體噬菌體載體噬菌體載體柯斯質粒載體柯斯質粒載體單鏈單鏈DNA噬菌體載體噬菌體載體噬菌粒載體噬菌粒載體動物病毒動物病毒一一、 質粒載體質粒載體（一）質粒一般

3、生物學特性（一）質粒一般生物學特性質粒的概念質粒的概念n質粒是生物細胞內固有的、能獨立于寄主染色體而自主復制、并質粒是生物細胞內固有的、能獨立于寄主染色體而自主復制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子，被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子，并不是細菌生長所必需的，但可以并不是細菌生長所必需的，但可以賦予細菌某些抵御外界環(huán)境因素不利影響的能力。賦予細菌某些抵御外界環(huán)境因素不利影響的能力。n質粒常見于原核細菌和真菌中質粒常見于原核細菌和真菌中n絕大多數(shù)的質粒是絕大多數(shù)的質粒是DNA型的型的(酵母的殺傷質粒是一種酵母的殺傷質粒是一種RNA)n質粒質粒DNA的分子量范圍：的分子量范圍：1 - 300 kb主要構型主要構型

4、SC構型 cccDNAOC構型 開環(huán)DNAL構型 線性DNA3 質粒的基本特性質粒的基本特性1）自主復制性復制起始區(qū)（replication origin) ： 通常一個質粒含有一個與相應的順式作用控制要素結合在一起的復制起始區(qū)（整個遺傳單位定義為復制子）大腸桿菌中使用的大多數(shù)載體都帶有一個來源于 pMB1 質?；?ColE1 質粒的復制起始位點 （2）質粒的拷貝數(shù)）質粒的拷貝數(shù)拷貝數(shù)拷貝數(shù):常指生長在標準培養(yǎng)基條件下常指生長在標準培養(yǎng)基條件下,每個細菌細胞中所每個細菌細胞中所含有的質粒含有的質粒DNA分子的數(shù)目分子的數(shù)目. 根據質粒在寄主細胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質粒根據質粒在寄主細胞中

5、的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質?？煞譃榭煞譃樗沙谛停ㄋ沙谛停╮elaxed control ） : 1060copies,高拷貝高拷貝嚴緊型（嚴緊型（strigent contorl） : 1幾個幾個copies,低拷貝低拷貝質粒質粒 復制子復制子 拷貝數(shù)拷貝數(shù) pBR322 及其衍生質粒及其衍生質粒 pMB1 1520 pUC 系列質粒及其衍生質粒系列質粒及其衍生質粒 突變的突變的 pMB1 500700 pACYC 及其衍生質粒及其衍生質粒 p15A10212pSC101 及其衍生質粒及其衍生質粒pSC101 5 ColE1ColE11520（3）、質粒的不相容性質粒的不相容性（plasmid

6、s incompatibility) 在沒有選擇壓力的情況下在沒有選擇壓力的情況下,兩種親緣關系密切的不同質粒，兩種親緣關系密切的不同質粒，不能在同一個寄主體系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象，稱為不能在同一個寄主體系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象，稱為質質粒的不相容性粒的不相容性. 在細胞的增殖過程中在細胞的增殖過程中,其中必有一種會其中必有一種會被逐漸地排斥掉被逐漸地排斥掉,不相容性的質粒組成不相容性的質粒組成不相容性群不相容性群.nColE1、pMB1 擁有相似的復制子結構，彼此不相容擁有相似的復制子結構，彼此不相容npSC101、F、RP4 擁有相似的復制子結構，彼此不相容擁有相似的復制子結構，彼此不相容np1

7、5A及其衍生質粒擁有相似的復制子結構，彼此不相容及其衍生質粒擁有相似的復制子結構，彼此不相容根據質粒根據質粒DNA中是否含有接合轉移基因分為中是否含有接合轉移基因分為接合型質粒接合型質粒（能自我轉移）（能自我轉移） ：又叫自我轉移型質粒，除了帶有自我復制所必需的遺傳信息外還帶有一套控制細菌配對和質粒接合轉移的基因。能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉移到另一個細能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉移到另一個細胞胞非接合型質粒非接合型質粒（不能自我轉移）（不能自我轉移） ： 帶有自我復制所必需的遺傳信息，但失去了控制細菌配對和質粒接合轉移的基因，因此不能從一個細胞轉移到另一個細胞 （4）可轉移性（二）質

8、粒載體的構建及類型二）質粒載體的構建及類型1、天然質粒用做克隆載體的局限性2、質粒載體必須具備的基本條件3、質粒載體的選擇標記4、不同類型的質粒載體 1、天然質粒用做克隆載體的局限性天然存在的野生型質粒由于分子量大、拷貝數(shù)天然存在的野生型質粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質粒為基礎進行人工構建野生型質粒為基礎進行人工構建2、質粒載體必須具備的基本條件、質粒載體必須具備的基本條件n具有復制起點具有復制起點n具有抗菌素抗性標記具有抗菌素

9、抗性標記n具有若干限制性單一酶切位點具有若干限制性單一酶切位點(多克隆位多克隆位點點(mutiple cloning site簡稱簡稱MCS)。n具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)3、質粒載體的選擇標記、質粒載體的選擇標記n氨芐青霉素 ( Amp )n氯霉素 ( Cml )n卡那霉素 ( Kam )n鏈霉素 ( Sm )n四環(huán)素 ( Tet )篩選標記篩選標記藍白斑篩選藍白斑篩選插入失活插入失活4、不同類型的質粒載體、不同類型的質粒載體高拷貝數(shù)的質粒載體高拷貝數(shù)的質粒載體 ( Col E1、pMB1):拷貝數(shù)1000-3000 擴增基因 低拷貝數(shù)的質粒載體低拷貝數(shù)的質

10、粒載體 ( F因子、因子、pSC101):來自pSC101 拷貝數(shù)小于10 表達某些毒性基因失控的質粒載體失控的質粒載體 :一類溫度敏感型復制控制質粒 插入失活型的質粒載體插入失活型的質粒載體 :載體的克隆位點位于其某一個選擇性標記基因內部。如pDF41、pDF42、pBR329 正選擇的質粒載體正選擇的質粒載體:直接選擇轉化后的細胞.只有帶有選擇標記基因的轉化菌細胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長，如pUR2、pTR262等表達型質粒載體表達型質粒載體:在大腸桿菌細胞中正常轉錄并轉譯成相應的蛋白質的克隆載體特稱為表達載體.5、常用的大腸桿菌質粒載體pBR3224363 bpOrigin of Repl

11、icationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IApr1）元件來源）元件來源復制起點復制起點:來源于ColE1 的派生質粒 pMB1的DNA復制起點Ampr基因基因:來源于pSF2124質粒易位子Tn3的Ampr基因Tetr基因基因:來源于pSC101的Tetr 基因pBR322的優(yōu)點的優(yōu)點 具氨芐青霉素和四環(huán)素雙抗菌素抗性選擇標記 分子小，克隆能力大 載體越小越好，10kb的DNA在純化過程中容易斷裂 高拷貝數(shù) 氯霉素擴增之后，每個細胞可達10003000copy 安全 失去了轉移蛋白基因mob

12、（mobilization）。不能通過接合轉移保留了轉移蛋白（mob）的作用位點，能夠被ColK質粒編碼的mob蛋白識別，如果再有F質粒的參與，就有可能轉移。BamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIIIpBR322 改造而來 通過 -互補作用形成的藍色和白色菌落篩選重組質粒pUC18 / 19：正選擇標記正選擇標記 lacZ 的顯色原的顯色原理理OHHHOHHOHHOHCH2OHO

13、NClBr5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚基吲哚基-b-D-半乳糖苷半乳糖苷 X-galb b-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的a a-肽段肽段ClBrClBrONNPlacMCSlacZ蘭-白斑篩選 如pUC質粒含LacZ基因（編碼半乳糖苷酶）該酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）產生藍色，從而使菌株變藍。當外源DNA插入后，LacZ基因不能表達，菌株呈白色，稱之為藍-白斑篩選。PUC質粒的優(yōu)點:n具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)n適用于組織化學方法檢測重組體n具有多克隆位點MCS區(qū)段MCSlacZPT7PSP6oripGEM-3Z2743 bpApr注意：T7和SP6啟動

14、子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合酶所識別，因此相應的受體菌必須表達噬菌體RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等多拷貝多克隆位點正選擇顏色標記lacZ具有兩個噬菌體強啟動子用于外源基因的高效表達在體外轉錄克隆基因的質粒載體在體外轉錄克隆基因的質粒載體穿梭質粒載體n人工構建的具有兩種不同復制起點和選擇標記,可以在兩種不同的寄主細胞中存活和復制的質粒載體n大腸桿菌-枯草桿菌穿梭載體n大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質粒載體n大腸桿菌-動物細胞穿梭載體（五）質粒載體的穩(wěn)定性問題（五）質粒載體的穩(wěn)定性問題質粒穩(wěn)定遺傳必須的兩個條件質粒穩(wěn)定遺傳必須的兩個條件（1）每個世代、每個質粒至少要復制一

15、次（2）在細胞分裂時，復制過的質粒必須分配到兩個子細 胞中1、結構不穩(wěn)定性:寄主基因組的IS序列插入質粒、質粒間的同源重組等都會使質粒發(fā)生插入或缺失。2、分離的不穩(wěn)定性:在寄主菌細胞分裂的過程中，有一個細胞沒有獲得質粒拷貝，并最終繁殖成無質粒的優(yōu)勢群體。（六）影響質粒載體穩(wěn)定性的主要因素 新陳代謝負荷新陳代謝負荷;質粒載體的拷貝數(shù)質粒載體的拷貝數(shù) ;寄主菌的重組體系寄主菌的重組體系 二、噬菌體二、噬菌體(bacteriophage)載體載體高效率的感染性能使外源基因高效導入受體細胞高效率的感染性能使外源基因高效導入受體細胞;自主復制繁殖性能使外源基因在受體細胞中高效擴自主復制繁殖性能使外源基因

16、在受體細胞中高效擴增增噬菌體或病毒的上述特性使得它們的噬菌體或病毒的上述特性使得它們的DNA能被開發(fā)能被開發(fā)成為基因工程的有用載體成為基因工程的有用載體噬菌體一般生物學特性噬菌體一般生物學特性大多數(shù)多呈帶尾部的二十面體大多數(shù)多呈帶尾部的二十面體. 如 噬菌體,部分為線狀體型.如 M13噬菌體顆粒的外殼是蛋白質分子噬菌體顆粒的外殼是蛋白質分子,內部是核酸內部是核酸,常見的是雙鏈常見的是雙鏈DNA核酸相對分子量相差較大核酸相對分子量相差較大感染率極高感染率極高生命周期可分為溶菌周期和溶源生命周期可分為溶菌周期和溶源周期周期（一）噬菌體的一般特性1.噬菌體的基本功能2.結構及核酸類型3.噬菌體的感染

17、性4.溶菌周期5.溶源周期6.重組噬菌體的分離1 溶菌周期溶菌周期 感染細菌后立即在菌體內復制和合成蛋白質外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導致細菌細胞解體，釋放出大量子代噬菌體。 2 溶源周期溶源周期 感染細菌后，將自己的DNA整合到細菌的染色體DNA中。形成這一過程稱為溶源化（lysogenization)。只有雙鏈DNA的噬菌體才有溶源周期.溫和噬菌體溫和噬菌體:既能進入溶菌生命周期又能進入溶源生命周期的噬菌體.溶源性細菌溶源性細菌:具有一套完整的噬菌體基因組的細菌.溶源化溶源化:用溫和的噬菌體感染細菌培養(yǎng)物使之形成溶源性細菌的過程整合整合:噬菌體的DNA被包容在寄主細菌染色體DNA之中,便

18、叫做已整合的噬菌體DNA原噬菌體原噬菌體:在溶源性細菌內存在的整合的或非整合的噬菌體DNA,叫原噬菌體,原噬菌體中如有某些基因缺失了,稱之為缺陷性的原噬菌體 lysogenic state :噬菌體侵染宿主細胞后，將 噬菌體基因組 DNA 通過位點專一性重組整合到宿主的染色體 DNA 中，并隨宿主的繁殖傳給子代細胞的現(xiàn)象稱溶源狀態(tài)溶源狀態(tài)。 u溶源細菌不能被頭一次感染并使之溶源化的同種噬菌體再感染. 抗御同種噬菌體再感染的特性叫做超感染免疫性超感染免疫性.u經過許多世代之后,溶源性的細菌便能開始進入溶菌周期,這個過程叫做溶源性細菌的誘發(fā)溶源性細菌的誘發(fā)溶源細菌有兩個重要特點溶源細菌有兩個重要特

19、點:（二）單鏈DNA噬菌體載體（M13）1、生物學特性2、M13克隆體系3、噬菌體展示載體生物學特性噬菌體的外型呈絲狀噬菌體的外型呈絲狀由外殼包裝蛋白和由外殼包裝蛋白和(+)DNA組成組成 基因組為單鏈基因組為單鏈DNA;DNA;不裂解宿主細胞，但抑制其生長不裂解宿主細胞，但抑制其生長DNA上上至少有至少有10個基因個基因不存在包裝限制。不存在包裝限制。 M13M13噬菌體只感染雄性大腸桿菌，但噬菌體只感染雄性大腸桿菌，但M13 DNAM13 DNA可以轉染雌性大腸桿菌，可以轉染雌性大腸桿菌，顆粒內含有長顆粒內含有長6407 bp6407 bp的閉合環(huán)狀的閉合環(huán)狀DNADNA基因組?；蚪M。M

20、13的侵染周期很短，不需要插入寄主的基因組。的侵染周期很短，不需要插入寄主的基因組。M13通過細菌的纖毛通過細菌的纖毛插入大腸桿菌，單鏈分子作為模板合成互補鏈，形成雙鏈插入大腸桿菌，單鏈分子作為模板合成互補鏈，形成雙鏈DNA分子分子。轉染轉染:感受態(tài)細胞經分離出來的噬菌體核酸所感染，隨后能產生出正常噬菌體后代；感染感染:病原微生物在寄主組織內立足的狀態(tài) 復制型DNA(Replicative form DNA ):n在宿主細胞內，感染性的單鏈噬菌體 DNA （正鏈）在宿主酶的作用下轉變成環(huán)狀雙鏈 DNA ，用于 DNA 的復制，這種雙鏈 DNA 稱為復制型 DNA 。 M13載體的構建 在M13

21、基因組中有一段507個核苷酸區(qū)域的間隔序列,稱為IS區(qū);在其間插入序列不受影響n插入LacZ,編碼B-半乳糖苷酶前面146個氨基酸,含有其操縱基因和啟動子區(qū),n插入接頭M13 DNA載體的特點載體的特點：優(yōu)點優(yōu)點n有有MCS，便于克隆不同的酶切片段，便于克隆不同的酶切片段n Xgal顯色反應，可供直接選擇顯色反應，可供直接選擇n無包裝限制，克隆能力大無包裝限制，克隆能力大n可以克隆雙鏈可以克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈分子中的每一條鏈 缺點缺點n插入外源插入外源DNA后，遺傳穩(wěn)定性顯著下降后，遺傳穩(wěn)定性顯著下降n實際克隆能力小于實際克隆能力小于1500bp(三三)、雙鏈噬菌體載體、雙鏈噬菌體載

22、體研究得最為詳盡的一種大腸桿菌雙鏈DNA噬菌體l l 噬菌體的生物學特性噬菌體的生物學特性n線狀雙鏈線狀雙鏈DNADNA分子分子nl l 噬菌體噬菌體由外殼包裝蛋白和由外殼包裝蛋白和l l-DNA組成組成nl l-DNA全長全長48502個核苷酸個核苷酸nl l-DNA上上至少有至少有61個基因個基因n兩端各有兩端各有12bp的粘性末端的粘性末端 噬菌體線性噬菌體線性DNA分子的粘性末端及其環(huán)化作用分子的粘性末端及其環(huán)化作用a.具有互補粘性的DNA分子b.通過粘性末端環(huán)化了的DNA分子粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點 細胞內環(huán)化形式的野生型噬菌體基因圖細胞內環(huán)化形式的野生型噬菌體基因圖野生

23、型做為克隆載體的缺點:n限制性內切酶有較多的切割位點l l-DNA載體的構建：載體的構建：去除非必需區(qū)，建立外源去除非必需區(qū)，建立外源DNADNA片段的克隆或替換位點片段的克隆或替換位點 野生型野生型l l-DNA有包裝限制，有包裝限制，l l噬菌體的包裝能力控制在野生型的噬菌體的包裝能力控制在野生型的75%到到105%（36-51kb）。必須區(qū)是）。必須區(qū)是28kb，所以，所以l l載體的最大載體的最大克隆容量是克隆容量是23kb 插入選擇標記基因插入選擇標記基因 cI失活，失活，Spi篩選和篩選和LacZ藍白斑篩選藍白斑篩選建立重組建立重組l lDNA分子的體外包裝系統(tǒng)分子的體外包裝系統(tǒng)根

24、據切除的多少，可將根據切除的多少，可將l l-DNA分成兩大類分成兩大類載體載體：插入型載體插入型載體取代型載體取代型載體I、插入型載體插入型載體具有一個限制酶位點可便于外源DNA插入的,其承受的外源DNA片段較小.一般在10K以內。廣泛用于cDNA及小片段DNA克隆。經改造后的長度為37kb，為包裝的下限，插入片段最大為14kb（51-37kb）如 lgt10、lgt11、lBV2、lNM540、lNM1590、lNM607插入失活常包括插入失活常包括免疫功能失活型免疫功能失活型 插入位點位于載體合成活性阻遏物區(qū)域（cI基因）內，插入導致載體不能合成阻遏物， l載體DNA不能進入溶源期，受體

25、菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。沒有外源DNA插入的l載體感染受體菌形成混濁噬菌斑 如lNM1149載體的兩個克隆位點（EcoR I 和Hind III）都是位于cI基因內部 b b-半乳糖苷酶失活型載體半乳糖苷酶失活型載體 在l基因組中引入了LacZ序列。（其上含有一個EcoR I 克隆位點）。感染LacZ突變的大腸桿菌，經IPTG的誘導，利用Xgal的顯色反應作選擇標記替換型載體（替換型載體（substitution vectors) 兩個多克隆位點區(qū)以反向重復形式分別位于lDNA的非必須區(qū)兩端。用酶切后，可以將中間的區(qū)段切下來，與用同樣酶切成的外源DNA片斷置換。如： l EMBL4、Ch

26、aron40等可取代片斷中如果包含LacZ，可用Xgal顯色作篩選標記替換型克隆外源DNA包括三個步驟:1.應用適當?shù)暮怂醿惹忻赶痩噬菌體,除去基因組中可取代的DNA區(qū)段2.將上述所得的lDNA臂同外源DNA片段連接3對重組體的lDNA分子進行包裝和增殖,以得到有感染性的l重組噬菌體l噬菌體載體一般用途 ：主要用于克隆 DNA 片段構建 cDNA 文庫和基因組文庫，并從中篩選目標基因 亞克隆在大容量載體（如粘粒）中增殖的外源 DNA 片段l l載體的體外包裝載體的體外包裝（1）體外包裝）體外包裝 在試管中與在試管中與l l噬菌體的頭部和尾部蛋白人工裝配成噬菌體的頭部和尾部蛋白人工裝配成噬菌體

27、顆粒，才能高效地感染細菌，把重組噬菌體顆粒，才能高效地感染細菌，把重組DNA注入注入受體菌中受體菌中包裝過程包裝過程:nE 基因編碼頭部蛋白的主要成分（占頭部總蛋白的基因編碼頭部蛋白的主要成分（占頭部總蛋白的70%）。）。nD基因的產物也是頭部蛋白，但主要與基因的產物也是頭部蛋白，但主要與l l DNA 進入頭進入頭部和頭部的成熟有關（只占部和頭部的成熟有關（只占20%）。）。l lDNA載體的優(yōu)點載體的優(yōu)點 l l -DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉染大腸桿菌l l -DNA載體的裝載能力為23 kb，遠遠大于質粒的裝載量重組l l -DNA分子的篩選較為方便l l -DNA載體適合

28、克隆和擴增外源DNA片段，不適合表達外源基因用在真核生物基因組文庫的建立三、柯斯質粒載體三、柯斯質粒載體1、柯斯質粒載體的構建2、柯斯質粒載體的特點3、柯斯克隆4、柯斯克隆的改良考斯質粒與噬菌?？妓官|粒與噬菌粒 l l -DNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為23 kb和1.5 kb，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯質粒和噬菌粒載體的構建就是為了進一步提高噬菌體DNA的裝載量.在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體DNA的長度，就能同步增加載體的裝載能力。將噬菌體DNA與包裝有關的序列與質粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長度，同時又能保證重組DNA分子在

29、體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這便是構建考斯質粒和噬菌粒載體的思路。當然，由于考斯質粒和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細胞內不能形成噬菌體顆粒。1 粘粒載體粘粒載體（考斯質粒載體）考斯質粒載體） 粘粒的結構特征u粘粒（cosmid）：一類由人工構建的含有l(wèi) 噬菌體 DNA的 cos 序列和質粒復制子的特殊類型的質粒載體 u粘粒的組成 包括質粒復制起點（包括質粒復制起點（colE1），抗性標記（），抗性標記（ampr），）， cos 位點位點, 能象質粒一樣轉化（能象質粒一樣轉化（transform)和增殖和增殖(multiplication) u大?。?一般一般 5-7kb

30、左右，用來克隆大片段左右，用來克隆大片段 DNA ，克隆的最，克隆的最大大 DNA 片段可達片段可達 45kb 考斯質粒（考斯質粒（cosmid）pHC796400bpTcrl l fragmentcosoriAprPstIBamHISalI三部分組成:一個抗藥性標記和一個質粒的復一個抗藥性標記和一個質粒的復制起始位點制起始位點帶有帶有l(wèi) l -DNA cos序列序列;一個或多一個或多個限制性內切酶的單一切割位點個限制性內切酶的單一切割位點裝載范圍為31 - 45 kb考斯質粒載體的特點考斯質粒載體的特點n能像能像l l-DNA那樣進行體外包裝，并高效轉染受體細胞那樣進行體外包裝，并高效轉染受

31、體細胞n能像質粒那樣在受體細胞能像質粒那樣在受體細胞中自主復制中自主復制n重組操作簡便，篩選容易重組操作簡便，篩選容易n裝載量大（裝載量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范圍）且克隆片段具有一定的大小范圍n不能體內包裝，不裂解不能體內包裝，不裂解受體細胞受體細胞4、粘粒載體的工作原理、粘粒載體的工作原理n分離外源DNA片斷35-45kbn外源DNA與兩個粘粒相連，且cos方向相同n體外包裝：l 噬菌體 A 基因蛋白的末端酶功能作用下切割兩個 cos 位點，并將兩個同方向 cos 位點之間的片段包裝到 l 噬菌體顆粒中去 n線狀的重組 DNA 注入細胞并通過 cos 位點環(huán)化，形成粘粒載體

32、，象質粒一樣復制并使其宿主獲得抗藥性。用途n在構建基因文庫中，減少重組體的數(shù)目n在單個重組體中克隆和增殖完整的基因n克隆與分析組成某一基因家族的真核DNA區(qū)段n在染色體步查（chromosome walking) 過程中具有優(yōu)勢，是 噬菌體 文庫的兩倍，可克隆45kb 染色體步查：采用一段分離自某一重組體一端的非重復DNA片段作探針，以鑒定含有相鄰序列的重組克隆cosmid載體克隆的缺點載體克隆的缺點n載體片斷自我連接n外源DNA片斷自我連接n多個本來不在一起的外源DNA片斷連接起來同時插入載體cosmid載體的改良載體的改良 npJB8 cosmid載體載體 在在BamH I位點兩側各有一個

33、位點兩側各有一個EcoR I切點。使克隆切點。使克隆在在BamH I上的外源上的外源DNA可被可被EcoR I切下來。切下來。四、噬菌粒載體四、噬菌粒載體1、概念2、pUC118和 pUC1193、pBluescript噬菌粒載體概念 由質粒載體與單鏈噬菌體載體的復制起點由質粒載體與單鏈噬菌體載體的復制起點結合而成的新型噬菌粒載體系列結合而成的新型噬菌粒載體系列n能像能像M13-DNA那樣體外包裝，并高效轉染受體細胞那樣體外包裝，并高效轉染受體細胞 n能像質粒那樣在受體細胞能像質粒那樣在受體細胞中自主復制中自主復制n裝載量比常規(guī)的裝載量比常規(guī)的M13mp系列要大很多（系列要大很多（10 kb）

34、n通過克隆雙鏈通過克隆雙鏈DNA能獲得同等長度的單一單鏈能獲得同等長度的單一單鏈DNAn重組操作簡便，篩選容易重組操作簡便，篩選容易重要的噬菌粒載體：重要的噬菌粒載體：pUC118 / 119npUC118 pUC18 + M13間隔區(qū)間隔區(qū) IGnpUC119 pUC19 + M13間隔區(qū)間隔區(qū) IG重要的噬菌粒載體：pBluescript 體外轉錄載體由pUC質粒載體、f1噬菌體的復制起點和T3、T7噬菌體的啟動子組成。 MCS兩側分別加上T3和T7噬菌體的啟動子。加入適當?shù)氖删wRNA聚合酶，就可以定向體外轉錄噬菌粒具有以下特征 雙鏈 DNA 既穩(wěn)定，又高產，具有常規(guī)質粒的特征； 免卻了

35、將外源 DNA 片段從質粒亞克隆于噬菌體載體這一既繁瑣又費時的步驟； 由于載體足夠小，故可得到長達 10kb 的外源 DNA 區(qū)段的單鏈。噬菌粒的主要優(yōu)點： 可以產生大段外源 DNA 的適量單鏈拷貝，又不必擔心發(fā)生缺失突變，而這些外源 DNA 區(qū)段常常由于太大而不能克隆于常規(guī) M13 載體。缺點： 輔助噬菌體感染后，有時候單鏈 DNA 的產量較低且重復性較差。五、大分子五、大分子DNA克隆載體克隆載體 將細菌接合因子或酵母菌染色體上的復制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)將細菌接合因子或酵母菌染色體上的復制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質粒組裝在一起，即可構成染色體載體。當大片段的外源與質粒組裝在一起，即可構成染色體載

36、體。當大片段的外源DNA克克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體它能像天然染色隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體它能像天然染色體那樣，在受體細胞中穩(wěn)定的復制并遺傳。體那樣，在受體細胞中穩(wěn)定的復制并遺傳。目前常用的人造染色體載體包括目前常用的人造染色體載體包括：n細菌人造染色體（細菌人造染色體（BAC）n酵母人造染色體（酵母人造染色體（YAC)1 酵母人造染色體（酵母人造染色體（Yeast Artificial Chromosomes YAC）利用釀酒酵母（利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的染）的染色體的復制元件構建的載體色體的復制元件構建的載體

37、 u生長的代時為 90 分鐘；u含 16 條染色體，其大小為 225-1900kb ，總計有14106 bp；u具真核 mRNA 的加工活性 YAC載體應含有下列元件載體應含有下列元件u控制酵母控制酵母DNA復制的自主復制序列復制的自主復制序列（autonomously replication sequences，ARS） u一段來自酵母染色體的著絲粒一段來自酵母染色體的著絲粒（centromere ， CEN）序列；序列； 有絲分裂過程中紡錘絲的結合位點，使染色體在分裂過程中能正確分配到子細胞中 u一對酵母的一對酵母的端粒重復序列端粒重復序列 定位于染色體末端一段序列，用于保護線狀的定位于染

38、色體末端一段序列，用于保護線狀的 DNA 不被胞內的核酸酶不被胞內的核酸酶降解，以形成穩(wěn)定的結構降解，以形成穩(wěn)定的結構 n酵母系統(tǒng)的酵母系統(tǒng)的選擇標記：選擇標記：trp 1、 leu 2 ，his 3 ，ura3 ，sup4 n宿主酵母菌宿主酵母菌 ade 2-1 ade 2-1 ，sup4 白色菌落白色菌落 ade 2-1 紅色菌落nYAC載體的裝載量為載體的裝載量為: :350 - 400 kb缺點n 存在高比例的嵌合體，一個克隆含兩個不相連的獨立片段；n部分克隆子不穩(wěn)定，轉代培養(yǎng)中可能會發(fā)生缺失或重排；n 難與酵母染色體區(qū)分開，因為YAC與酵母染色體有相似結構；n 操作時容易發(fā)生染色體機

39、械切割。2 細菌人造染色體（細菌人造染色體（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）n細菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子細菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子F質粒的基礎質粒的基礎上構建的，其裝載量范圍在上構建的，其裝載量范圍在50 - 300 kb之間之間.n各種類型的各種類型的pBACs在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝貝.主要適用于：主要適用于：克隆大型基因簇（克隆大型基因簇（gene cluster）結構）結構;構建動植物基因文庫構建動植物基因文庫; 克隆大片段克隆大片段DNA，100-300kb結構特征n一個抗生素抗性標記

40、:氯霉素抗性和 Lac Z n一個來源于大腸桿菌 F 因子的復制子 oriS(嚴謹型控制)n一個易于 DNA 復制的的解旋酶（RepE）(由 ATP 驅動)n三個確保低拷貝質粒精確分配至子代細胞的基因座 （ parA , parB , 和parC ） 。n 優(yōu)點 易于用電擊法轉化E.coli（效率比酵母高10-100倍）；超螺旋環(huán)狀載體，易于操作； F質粒本身所帶的基因控制了質粒的復制； 很少發(fā)生體內重排。低拷貝性可以避免嵌合體的產生，減小外源基因的表達產物對宿主細胞的毒副作用。缺點:n拷貝數(shù)小,制備難度大第二節(jié)第二節(jié) 表達載體表達載體n可攜帶DNA片段進入宿主細胞進行復制并進行轉錄翻譯的載體

41、,一般在克隆載體基礎上增加了基因表達的調控元件.n質粒表達載體n病毒表達載體n大片段表達載體n其他一、質粒表達載體以質粒為基本骨架和克隆載體的基礎上,組裝啟動子,轉錄終止子和核糖體結合位點等表達元件而構建成的.n原核表達載體nTi質粒表達載體n動物質粒表達載體(一) 原核表達載體啟動子核糖體結合位點克隆位點轉錄終止信號1表達元件主要包括:n啟動子:trp-lac（tac）啟動子、噬菌體PL啟動子、T7噬菌體啟動子n轉錄終止子n核糖體結合位點:核糖體結合位點（RBS）,起始密碼子（ATG）和SD序列用途：表達外源目的基因，獲得重組融合蛋白用途：表達外源目的基因，獲得重組融合蛋白2 表達方式:n組

42、成型表達:在組成型啟動子驅動下，外源基因源源不斷地表達。n誘導型表達：表達受一些因素的誘導，屬于可控性表達。n融合型表達：表達載體的多克隆位點上有一段融合表達標簽，表達為融合蛋白，可方便后續(xù)的蛋白分離純化和檢測。n分泌型表達：在起始密碼和目的基因之間加入一個信號肽，可以引導目的蛋白穿越細胞膜，可避免表達產物在細胞內過度積累而影響細胞的生長，或形成包含體，且表達產物是可溶性的，不需要重復。典型的原核表達載體pET-12a大腸桿菌原核細胞表達1） 表達載體：較常用的是具可誘導的T7啟動子的表達載體，大部分蛋白可獲得表達而且表達量較高 （占細菌總蛋白的25%以上）。2） 寄主菌：細菌染色體上含有噬菌體T7-RNA聚合酶基因，它的啟動子為Lac啟動子，可被IPTG誘導3） 融合蛋白：常用6-10組氨酸-融合蛋白，只增加幾個氨基酸，對蛋白質結構影響較少。 GST-融合蛋白，選擇大腸桿菌偏愛密碼子，易表達外源蛋白。融合蛋白有利于表達和純化。4） 用途：獲得融合蛋白，用于抗體制備，生化性質研究等。 n